Luận án Sử dụng thịt đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus Vannamei) để chế biến chế phẩm giàu Protein

và 2 enzyme alcalase và flavourzyme Các giá trị hiệu suất thủy phân (DH%) và khả năng chống oxy hóa (DPPH%) được khảo sát thông qua 17 đơn vị thí nghiệm và được trình bày trong Bảng 4.27. Các nghiệm thức khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng 3 nhân tố pH, nhiệt độ và thời gian thủy phân kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại TT Giá trị mã hóa Kết quả X12:Nhiệt độ (°C) X13: pH X14:Thời gian (giờ) DH (%) DPPH (%)(*) IC50 (mg/100mL) 1 55,50 6,80 3,00 74,98±1,09 77,25±0,33 5,95±0,03 2 55,50 7,05 3,00 88,78±0,85 83,74±0,30 5,49±0,02 3 59,70 7,05 3,00 63,91±0,75 65,68±0,17 7,00±0,02 4 55,50 7,05 1,32 66,58±0,77 72,25±0,04 6,37±0,01 5 55,50 7,30 3,00 64,06±1,04 68,02±0,41 6,78±0,04 6 58,00 7,20 4,00 45,32±0,63 51,78±0,30 8,90±0,05 7 51,30 7,05 3,00 66,57±0,72 74,35±0,23 6,19±0,02 8 53,00 7,20 2,00 56,35±0,90 57,78±0,26 7,97±0,04 9 58,00 7,20 2,00 80,91±0,67 80,77±0,64 5,68±0,05 10 53,00 6,90 2,00 68,74±0,81 73,26±0,47 6,29±0,04 11 58,50 6,90 4,00 48,60±1,04 53,17±0,24 8,64±0,04 12 55,50 7,05 4,68 56,47±1,16 61,49±0,35 7,48±0,04 13 53,00 6,90 4,00 81,47±0,50 82,15±0,38 5,59±0,03 14 58,00 6,90 2,00 65,73±0,49 68,89±0,37 6,69±0,04 15 53,00 7,20 4,00 62,88±0,40 62,37±0,07 7,37±0,01 16 55,50 7,05 3,00 91,62±0,94 85,25±0,15 5,39±0,01 17 55,50 7,05 3,00 87,84±1,42 85,64±0,31 5,38±0,02 (Ghi chú: Giá trị mã hóa -1,68; -1, 0, +1 và + 1,68 thể hiện 5 mức độ khảo sát tương ứng với nhiệt độ (oC); pH và thời gian thủy phân; (*) DPPH % đã được pha loãng 20 lần), Dựa trên kết quả điều kiện tối ưu của protease nội tại và enzyme thương mại cho thấy, ba nhân tố X12 nhiệt độ, X13 pH và X14 thời gian - điều này có thể là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến việc thay đổi hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm. Kết quả phân tích ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy được trình bày ở Bảng 4.28 và Bảng 4.29. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 112 Khoa Nông nghiệp Ảnh hưởng các nhân tố đến phương trình hồi quy dựa trên hiệu suất thủy phân Y16 (DH%) khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Nhân tố Tổng bình phương Bậc tự do Phương sai Tỉ số F Giá trị P X12 296,145 1 296,145 64,91 0,0000 X13 307,653 1 307,653 67,43 0,0000 X14 559,249 1 559,249 122,58 0,0000 X12 X12 2342,27 1 2342,27 513,41 0,0000 X12 X13 689,839 1 689,839 151,21 0,0000 X12 X14 1942,45 1 1942,45 425,77 0,0000 X13 X13 1734,51 1 1734,51 380,19 0,0000 X13 X14 227,743 1 227,743 49,92 0,0000 X14 X14 3373,94 1 3373,94 739,54 0,0000 Số lần lặp lại 1,02237 2 0,511186 0,11 0,8943 Sai số 177,926 39 4,56222 Tổng 8993,56 50 X12: Nhiệt độ (oC); X13: pH và X14: thời gian thủy phân tương ứng khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Y11: Hàm mục tiêu thể hiện hiệu suất thủy khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Ảnh hưởng các nhân tố đến phương trình hồi quy dựa trên hoạt tính chống oxy hóa Y17(DPPH%) khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Nhân tố Tổng bình phương Bậc tự do Phương sai Tỉ số F Giá trị P X12 274,945 1 274,945 93,23 0,0000 X13 363,854 1 363,854 123,37 0,0000 X14 529,417 1 529,417 179,51 0,0000 X12 X12 1150,88 1 1150,88 390,23 0,0000 X12 X13 793,372 1 793,372 269,01 0,0000 X12 X14 1286,77 1 1286,77 436,31 0,0000 X13 X13 819,105 1 819,105 277,74 0,0000 X13 X14 125,069 1 125,069 42,41 0,0000 X14 X14 1635,14 1 1635,14 554,43 0,0000 Số lần lặp lại 0,0280636 2 0,0140318 0,00 0,9953 Sai số 115,019 39 2,94921 Tổng 5810,07 50 Y17: Hàm mục tiêu thể hiện hoạt tính chống oxy hóa khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại (*) DPPH % đã được pha loãng 20 lần Kết quả phân tích cho thấy hệ số hồi quy bậc một của X12, X13, X14 tính theo hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa cũng như hệ số tương tác của X12X13, X12X13, X13X14 đều khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%, đồng thời hệ số hồi quy bậc hai của X122, X132 và X142 cũng khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Như vậy, các yếu tố này đều mang ý nghĩa thống kê và có thể xem xét giữ lại trong phương trình hồi qui, nói cách khác, cả nhiệt độ, Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 113 Khoa Nông nghiệp pH và thời gian và các tương tác đôi giữa chúng đều ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân (Hình 4.48); hoạt tính chống oxy hóa (Hình 4.49) và IC50 (Hình 4.50). Đồ thị biểu diễn sự tương tác của pH nhiệt độ và thời gian thủy phân lên hiệu suất thủy phân protein khi kết hợp enzyme protease nội tại và thương mại Đồ thị biểu diễn sự tương tác của pH nhiệt độ và thời gian thủy phân lên hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân khi kết hợp protease nội tại và thương mại Đồ thị biểu diễn sự tương tác của pH nhiệt độ và thời gian thủy phân lên IC50 của dịch thủy phân khi kết hợp protease nội tại và thương mại Kết quả này phù hợp với nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện thủy phân bằng enzyme protease nội tại ở mục 4.2 và enzyme ngoại bào ở mục 4.3, chứng Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 114 Khoa Nông nghiệp tỏ việc tìm ra một pH và nhiệt độ thích hợp cũng như thời gian thủy phân là một bài toán kinh tế cho quá trình thủy phân protein từ thịt đầu tôm. Bản chất của enzyme là protein, do đó dù là enzyme nội tại hay là enzyme thương mại đều có khoảng pH và nhiệt độ tối ưu riêng. Đồ thị tương tác và đồ thị đường đồng điểm biểu diễn sự tương tác của pH, nhiệt độ và thời gian thủy phân lên hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính chống oxy hóa khi kết hợp enzyme nội tại và 2 enzyme thương mại (alcalase và flavourzyme) được thể hiện ở Hình 4.51; Hình 4.52 và Hình 4.53 tương ứng với các hàm mục tiêu Y16, Y17 và Y18 . Đồ thị đồng điểm biểu diễn sự tương tác của pH, nhiệt độ và thời gian lên hiệu suất thủy phân protein khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Đồ thị đồng điểm biểu diễn sự tương tác của pH, nhiệt độ và thời gian lên hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 115 Khoa Nông nghiệp Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồng điểm biểu diễn sự tương tác của pH, nhiệt độ và thời gian lên IC50 của dịch thủy phân khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Xét về nhiệt độ và pH, kết quả từ đồ thị ở Hình 4.51 thể hiện rằng có sự tương tác đơn và tương tác đa với các nhân tố khảo sát, là yếu tố quyết định thời gian thủy phân của protein. Khi tăng nhiệt độ từ 53÷55 °C hiệu suất thủy phân tăng, ở 54,94 °C hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa đạt cực đại, đây cũng là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme nội tại (thí nghiệm 6 và Nguyễn Lệ Hà, 2011). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trang Sĩ Hùng và ctv. (2007) khi nghiên cứu kết hợp enzyme protease trong thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm (thủy phân ở 55 °C). Khi enzyme ở các mức nhiệt độ thấp hơn, các nguyên tử trong phân tử enzyme có ít năng lượng để di chuyển dẫn đến tần số va chạm giữa enzyme và cơ chất thấp và tốc độ phản ứng chậm hơn. Điều này cũng cho thấy, khi nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn nhiệt độ tối ưu sẽ làm giảm hoạt tính enzyme (Mathewson, 1998). Mỗi một enzyme hoạt động tốt nhất ở một khoảng nhiệt độ nhất định, gia tăng nhiệt độ có tác động tích cực trong việc gia tăng tốc độ phản ứng của enzyme. Tuy nhiên, bản chất của enzyme là protein nên không bền với nhiệt độ cao hơn 70 °C, tại nhiệt độ này enzyme bị biến tính hoàn toàn dẫn đến làm mất hoạt tính xúc tác (Phan Thị Bích Trâm, 2010). Tương tự, hiệu suất thủy phân đạt thấp ở điều kiện pH cao hơn (pH 7,2) hay pH thấp (pH 6,9) và thời gian ngắn (2 giờ). Điều này có lẽ là do ở pH 6,9÷7,10 là môi trường pH phù hợp cho hoạt động của enzyme nội tại và enzyme flavourzyme, ngược lại pH cao chỉ phù hợp cho hoạt động của enzyme alcalase (đây là enzyme có dãy pH hoạt động tối thích rất rộng 6,5÷8,5). Đồng thời mức thời gian ngắn 2 đến 3 giờ chưa đủ để enzyme protease nội tại (6 giờ) trong thịt đầu tôm hoạt động cũng như thời gian đủ để enzyme thương mại tiếp xúc cũng như tham gia thủy phân với cơ chất. Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở Hình 4.52 và Hình 4.53 Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 116 Khoa Nông nghiệp một lần nữa khẳng định cả ba yếu tố nhiệt độ, pH và thời gian đều ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa và IC50 của dịch thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ. Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phương trình hồi quy thể hiện sự tương quan của điều kiện thủy phân đến hiệu suất thủy phân được thiết lập và sử dụng để dự đoán hiệu quả việc thủy phân protein. Hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa mô phỏng (Y16, Y17 và Y18 lý thuyết) được xác định bằng cách thay các biến với giá trị thực vào phương trình (16); (17) và (18). Hàm mục tiêu Y16 – Hiệu suất thủy phân của dịch thủy phân bằng enzyme thương mại alcalase và flavourzyme có kích hoạt enzyme nội tại: Y16 = -15161,4 + 56,7271X12 + 3737,68X13 + 400,736X14 - 1,33152X12^2 + 14,2967X12X13 - 3,59857X12X14 - 318,284X13^2 - 20,5364X13X14 - 9,98803X14^2, R2=98,02%. (16) Hàm mục tiêu Y17 – Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân bằng enzyme thương mại alcalase và flavourzyme có kích hoạt enzyme nội tại: Y17 = -8325,72 + 3,26072X12 + 2258,86X13 + 307,971X14 – 0,933347X12^2 – 15,3321X10X13 -2,9289X12X14 – 218,724X13^2 – 15,2187 X11X12 – 6,95327X14^2, R2=98,02% (17) Hàm mục tiêu Y18 – IC50 của dịch thủy phân bằng enzyme thương mại alcalase và flavourzyme có kích hoạt enzyme nội tại: Y18 – IC50 = 721,779 - 0,0629663X12 - 193,37 X13 - 29,3533 X14 + 0,0821089 X12^2 - 1,40444 X12 X13 + 0,323 X12X14 + 19,1416 X13^2 + 1,14444X13X14 + 0,629855 X14 (18) Ứng với từng hàm mục tiêu, xác định được điều kiện tối ưu cho hoạt động thủy phân (Bảng 4.30). Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân với hàm mục tiêu Y16, Y17 và Y18 Nhân tố Chế độ Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu, Thấp Cao Y16 Y17 Y18 DH% DPPH% IC50 X12 51,29 59,70 54,94 53,24 51,29 90,20 86,92 4,96 X13 6,80 7,30 7,01 6,91 6,81 X14 1,32 4,68 2,96 3,37 3,96 X12: Nhiệt độ (oC); X13: pH và X14: thời gian thủy phân tương ứng khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại. Y17: Hàm mục tiêu thể hiện hiệu suất thủy khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại. Y18: Hàm mục tiêu thể hiện hoạt tính chống oxy hóa khi kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại Như vậy, có thể kết luận rằng phương trình hồi quy đã mô tả đúng các kết quả thực nghiệm. Hệ số tương quan cho biết 98,29% sự thay đổi hiệu suất thủy Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 117 Khoa Nông nghiệp phân protein và 98,08% cho sự thay đổi của hoạt tính chống oxy hóa là do ảnh hưởng các biến độc lập X12, X13, X14 và chỉ có 1,71% và 1,92% tương ứng là do các yếu tố không xác định gây ra Hình 4.54 và Hình 4.55. Đồ thị tương quan giữa hiệu suất thủy phân theo thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy Đồ thị tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa theo thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy Điều kiện tối ưu cho hoạt động thủy phân đáp ứng đồng thời 3 mục tiêu Y16 ; Y17 và Y18, kết quả thể hiện ở Bảng 4.31, Hình 4.56 và Hình 4.57. Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân đáp ứng 3 mục tiêu Y16; Y17 và Y18 Nhân tố Chế độ Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu, Thấp Cao DH% DPPH% IC50, (mg/100mL) X12 51,29 59,70 54,94 90,19 86,16 5,26 X13 6,80 7,30 7,01 X14 1,32 4,68 2,96 y = 0.9829x + 1.1504 R² = 0.9829 40 50 60 70 80 90 100 40 50 60 70 80 90 100 H iệ u s u ất t h ủ y p h ân t h ự c tế (% D H ) Hiệu suất thủy phân lý thuyết (%DH) y = 0.9808x + 1.3178 R² = 0.9808 50 55 60 65 70 75 80 85 90 50 55 60 65 70 75 80 85 90 H o ạt t ín h c h ố n g o x y h ó a (D P P H % ) th ự c tế Hoạt tính chống oxy hóa (DPPH%) lý thuyết Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 118 Khoa Nông nghiệp Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ, pH và thời gian đến hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân từ thịt đầu tôm thẻ bằng enzyme protease nội tại kết hợp enzyme thương mại Tương tác của nhiệt độ, pH và thời gian đến hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân từ thịt đầu tôm thẻ bằng enzyme protease nội tại kết hợp enzyme thương mại Từ kết quả điện di trên gel SDS–PAGE ở Hình 4.58 có thể nhận thấy, mẫu dịch thủy phân ngay sau ly tâm (giếng 2, giếng 3 và giếng 4) không có sự hiện diện cao của protein nằm trong khoảng khối lượng phân tử từ 14,4 kDa trở lên, phù hợp với các khảo sát trước đó của (Zhao et al. 2011) xác định rằng các peptit có khối lượng phân tử càng nhỏ hơn 1 kDa có khả năng chống oxy cao nhất so với 4 phân đoạn (> 10 kDa; 510 kDa; 35 kDa và 13 kDa) thu được trong quá trình thủy phân phụ phẩm tôm bằng enzyme alcalase. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 119 Khoa Nông nghiệp Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE dịch thủy phân khi kết hợp enzyme nội tại và 2 enzyme thương mại 0: Thang chuẩn; 1: nguyên liệu; 2, 3 và 4 kết hợp enzyme nội tại với 2 enzyme thương mại Kết quả báo cáo của Ranathunga et al. (2006) khi thủy phân protein từ cá chình (conger eel) cho thấy rằng phân tử peptit khối lượng phân tử thấp nhất (<1 kDa) có năng lực chống oxy hóa mạnh nhất, ức chế khoảng 79% axit linoleic trong hệ thống mô hình oxy hóa axit linoleic. Trong một nghiên cứu khác, peptit với khối lượng phân tử giữa 390 và 1400 Da cho thấy khả năng chống oxy hoá mạnh nhất trong số các phân đoạn thủy phân từ cơ tối phụ phẩm của cá ngừ (Hsu, 2010). Tóm lại, với hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa cao thu được khi kết hợp enzyme protease nội tại và enzyme thương mại chịu sự chi phối rất lớn của các điều kiện nhiệt độ, pH môi trường và thời gian thủy phân. Điều kiện thủy phân thích hợp cho hoạt động chung của 2 loại enzyme nội tại và thương mại là cần thiết, kết quả thu được, pH 7,01; nhiệt độ 54,94 °C và thời gian 2,96 giờ với hàm lượng enzyme alcalase và nồng độ flavouryme bổ sung lần lượt là 19,43 UI/g và 32,09 UI/g giúp hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ đạt 90,19%, hoạt tính chống oxy hóa 86,16%. So sánh lựa chọn enzyme có khả năng thủy phân hiệu quả nhất Kết quả từng trường hợp thủy phân thu nhận ở Bảng 4.32 chứng minh rằng, phương pháp thủy phân thu được hiệu suất thủy phân cao nhất là khi kết hợp kích hoạt enzyme nội tại kết hợp với sử dụng cả hai loại enzyme thương mại là alcalase và flavourzyme bởi vì mỗi loại enzyme có khả năng thủy phân khác nhau và dịch thủy phân đạt khả năng chống oxy hóa khác nhau. Do vậy, tùy theo mục tiêu muốn đạt được mà có sự kết hợp các enzyme thương mại với nhau hay các enzyme thương mại với enzyme nội tại có trong nguyên liệu. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 120 Khoa Nông nghiệp So sánh hiệu quả thủy phân bằng các enzyme khác nhau Enzyme thủy phân Hiệu suất thủy phân (DH %) Hoạt tính chống oxy hóa (%)(*) Hàm lượng amin hòa tan (mg N/g) IC50 (mg/100mL) TH1 15,66a ± 0,06 16,54a ± 0,17 0,33a ± 0,001 29,39a ± 0,12 TH2 41,69d ± 0,24 34,47d ± 0,03 0,87d ± 0,005 11,04d ± 0,06 TH3 37,70c ± 0,21 31,57c ± 0,31 0,73c ± 0,004 13,20c ± 0,08 TH4 35,10b ± 0,45 29,50b ± 0,57 0,69b ± 0,010 13,95b ± 0,19 TH5 61,36e ± 0,35 52,68e± 0,42 1,02e ± 0,003 7,50e± 0,04 TH6 90,06f ± 1,06 85,98f ± 1,33 1,87f ± 0,001 5,11f ± 0,06 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD ở mức độ tin cậy 95%). TH1: protease nội tại hông kích hoạt; TH2: protease nội tại có kích hoạt; TH3: alcalase; TH4: Flavourzyme; TH5: alcalase + flavourzyme; TH6: kết hợp enzyme nội tại với 2 enzyme thương mại. (*) DPPH % đã được pha loãng 20 lần. Các trường hợp thủy phân khác nhau có hiệu suất thủy phân có khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê 5%. Trường hợp thủy phân bằng enzyme alcalase (TH3) và enzyme flavourzyme (TH4), sau khi vô hoạt enzyme nội tại cho kết quả tương tự nhau với hiệu quả thủy phân thấp (37,7% và 35,10%), hoạt tính chống oxy hóa thấp (31,57% và 29,5%). Điều này có thể do protein từ thịt đầu tôm thẻ bị biến tính do quá trình vô hoạt enzyme nội tại, làm biến tính protein trước khi bắt đầu thủy phân dẫn đến quá trình tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất gặp khó khăn. Đặc biệt, enzyme thương mại alcalase mang đặc điểm cắt endoprotease, enzyme flavourzyme mặc dù có cả hai đặc tính exopeptidase và endopeptidase. Tuy nhiên, hoạt động chính của enzyme được cung cấp bởi exopeptidase. Kết quả cũng cho thấy hiệu quả của việc sử dụng kết hợp enzyme nội tại và hai enzyme thương mại alcalase và flavourzyme, tăng hiệu quả phân cắt các liên kết peptit thể hiện qua hiệu xuất thủy phân tăng 1,47 lần so với sử dụng kết hợp hai enzyme thương mại đạt 2,1 lần so với hiệu suất thủy phân từ enzyme nội tại. Tiến hành chạy điện di dịch protein sau khi thủy phân trên gel SDS-PAGE giúp khẳng định hiệu quả phân cắt các liên kết peptit của protein bằng hỗn hợp enzyme và xác định được khoảng khối lượng phân tử thu được của các peptit. Từ kết quả Bảng 4.32 cũng chứng tỏ, sự phân cắt các liên kết peptit diễn ra trong trường hợp khi ta kết hợp 2 enzyme thương mại để thủy phân protein từ thịt đầu tôm so với kết quả việc sử dụng kết hợp hai enzyme thương mại (TH5) đã giúp giảm đáng kể giá trị IC50, đồng nghĩa với tăng cao khả năng chống oxy hóa của dịch đạm thủy phân, hiệu suất thu hồi cao hơn 1,63 lần so với sử dụng enzyme alcalase và 1,75 lần so với sử dụng enzyme flavourrzyme. Tuy nhiên, so sánh TH2 – kích hoạt enzyme nội tại có trong thịt đầu tôm thì việc sử dụng một enzyme thương mại không đem lại hiệu quả thủy phân như Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 121 Khoa Nông nghiệp mong muốn, việc vô hoạt cũng góp phần làm giảm hoạt tính sinh học, cụ thể là khả năng chống oxy hóa của dịch đạm thủy phân, cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dịch đạm thu được trong TH5. Tuy nhiên, trong điều kiện khảo sát riêng lẽ enzyme nội tại và enzyme thương mại hiệu suất thủy phân đều thấp, dịch thủy phân chứa hàm lượng đạm amin thấp và khả năng chống oxy hóa không cao so với việc kết hợp enzyme thương mại cùng với kích hoạt enzyme nội tại TH6. Kết hợp enzyme nội tại và enzyme thương mại làm tăng hiệu suất thủy phân lên đến 90,06%; khả năng chống oxy hóa là 85,98% và đạm amin trong dịch đạt 1,87 mgN/g. Bên cạnh đó, việc sử dụng kích hoạt enzyme nội tại nhìn chung có chi phí tương đối thấp, qui trình thực hiện đơn giản, hiệu quả cao. Về mặt lý thuyết, kết quả này hoàn toàn thuyết phục, mẫu thịt đầu tôm thủy phân không qua quá trình gia nhiệt (TH6) luôn nhiều hơn so với các mẫu ở các trường hợp còn lại vì bản thân thịt đầu tôm tươi có một lượng đáng kể enzyme nội tại có hoạt tính. Kết hợp với hai enzyme thương mại có bản chất endo và exo, đây chính là nguyên nhân dẫn đến quá trình thủy phân đạt hiệu quả cao trong thời gian ngắn. Kết quả này phù hợp với nhiều báo cáo trước đó là hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân thu được phụ thuộc vào khối lượng phân tử (Moure et al., 2006; Zhu et al., 2006; Dong et al., 2008; Li et al., 2008) và nghiên cứu của Zhao et al. (2011) phân đoạn nhỏ hơn 1 kDa cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất với các phân đoạn còn lại. Tuy nhiên, nghiên cứu của Wu, et al. (2003) khi thủy phân cơ thịt cá thu bằng enzyme protease N ở 50 oC trong 25 giờ thu được 3 phân đoạn peptit chính có khối lượng phân tử 1400, 900 và 200 Da, peptit có khối lượng phân tử 1.400 Da có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Điều này chứng minh, thành phần và trình tự axit amin quyết định khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân. Kết quả phân tích dịch thủy phân với sự hiện diện của 17 loại axit amin (Bảng 4.33) là minh chứng cho khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân từ thịt đầu tôm thẻ. Từ kết quả ở Bảng 4.33 cho thấy tổng hàm lượng axit amin trong dịch thủy phân là 4,55%. Trong đó, có đầy đủ các axit amin cần thiết yếu bao gồm arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, lysine và valine (trừ tryptophan – do không có điều kiện phân tích). Đặc biệt arginine chiếm tỷ lệ cao nhất (0,66%), đây là một trong những 8 axit amin thiết yếu đối với trẻ em. Tiếp đến, lysine (0,55%) có vai trò quan trọng trong việc hấp thu canxi, tạo cơ bắp, phục hồi sau chấn thương, phẫu thuật đồng thời tổng hợp các hormone, enzyme và các kháng thể, methionine (0,18%) là 1 axit amin có gốc lưu huỳnh có vai trò quan trọng trong chuyển hoá vật chất, đặc biệt là quá trình gắn và trao đổi nhóm methyl trong cơ thể, giúp trung hòa các gốc tự do giảm một số bệnh tật của người già và lão hóa. Ngoài ra, có đầy đủ các axit amin không thiết yếu Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 122 Khoa Nông nghiệp như alanine, asparagine, aspartic axit, cysteine, glutamic axit, glycine, proline, serine và tyrosine trong thành phần dịch thủy phân. Một số nghiên cứu đã chứng minh mối tương quan giữa axit amin và hoạt động chống oxy hoá của peptit, các axit amin thơm như Tyr, His, Trp và Phe và các axit amin kỵ nước bao gồm Val, Leu và Ala, cũng như Met and Gly đóng vai trò quan trọng đối với hoạt động chống oxy hoá của peptit (Chen et al., 1998; Mendis et al., 200a; Rajapakse et al., 2005b). Kết quả này vượt trội hơn so với nghiên cứu của thủy phân của Randriamahatody et al. (2011) khi thủy phân tôm Peaneus monodon bởi enzyme protease thương mại đã xác định có 14÷15 axit amin trong dịch thủy phân. So với kết quả phân tích thành phần axit amin của bột carotenoprotein thu được từ đầu tôm sú là 16 axit amin (Nguyễn Lệ Hà, 2011), trong dịch thủy phân thịt đầu tôm thẻ có thêm cysteine, một axit amin có chứa lưu huỳnh cần thiết cho làn da khỏe mạnh, tốt cho tóc và móng tay. Ngày nay người ta còn xem cysteine cũng là một axit amin không thể thay thế (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004). Kết quả cho thấy, dịch thủy phân từ thịt đầu tôm thẻ chân trắng duy trì sự hiện diện của hầu hết các thành phần axit amin có trong tôm thẻ chân trắng theo kết quả phân tích của Gunalan et al. (2013). Thành phần axit amin trong dịch thủy phân thịt đầu tôm thẻ ở điều kiện thủy phân tối ưu khi kết hợp enzyme nội tại và 2 enzyme thương mại (% so với dịch thủy phân) TT Axit amin Hàm lượng (%) 1 Aspartic axit 0,21 2 Serine 0,31 3 Glutamine 0,12 4 Histidine 0,14 5 Glycine 0,26 6 Threonine 0,20 7 Arginine 0,66 8 Alanine 0,31 9 Tyrosine 0,09 10 Cysteine 0,02 11 Methionine 0,18 12 Valine 0,29 13 Phenylalanine 0,29 14 Isoleucine 0,25 15 Leucine 0,41 16 Lysine 0,55 17 Proline 0,26 Tổng 4,55 Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 2014 - Đợt 2 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm 123 Khoa Nông nghiệp Khảo sát tương tác giữa nhiệt độ và thời gian cô quay đến tính chất của dịch thủy phân Thành phần hóa lý cơ bản và hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân từ thịt tôm trước khi cô đặc: - Độ ẩm (%): 90,24±1,68 - Protein tổng (%): 6,85 ±0,02 Hoạt tính chống oxi hóa(%): 86,16±0,12 (%)(dịch thủy phân đã được pha loãng 20 lần trước khi xác định hoát tính chống oxi hóa) Các giá trị protein tổng số và DPPH (%) quan sát được trong 12 nghiệm thức của quá trình cô quay và được trình bày trong Bảng 4.34. Các nghiệm thức khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng 2 nhân tố nhiệt độ và thời gian cô quay STT Giá trị biến thực nghiệm Giá trị thực nghiệm X15: Nhiệt độ (oC) X16: Thời gian (phút) Y19: P (%) Y20: HSTH Protein (%) Y21: DPPH (%)(*) Y22: HSTH DPPH (%) Y23: IC50 (mg/100mL) 1 50 30 15,18±0,13 88,56±0,51 55,60±0,38 64,53±0,60 3,31±0,02 2 45 40 18,56±0,33 95,21±1,17 63,26±0,07 64,55±0,50 2,91±0,01 3 40 50 16,63