Luận văn Khảo sát khả năng tổng hợp Amylase từ Aspergillus oryzae khi bổ sung muối cảm ứng

iảm dần. Đa số enzyme bền ở pH từ 5 - 9. Độ bền sẽ tăng nếu có mặt của cơ chất và coenzyme hoặc Ca2+ Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng axid yếu, kiềm yếu hay trung tính; chỉ có một số ít có pH tối thích trong vùng axid hay kiềm mạnh. Hình 10. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme 2.3.5 Các chất kìm hãm Trong các chất kìm hãm enzyme, một số chất như những ion kim loại, các chất vô cơ, hữu cơ có khả năng kìm hãm tốc độ phản ứng của enzyme. Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch. Phản ứng enzyme (E) và các chất kìm hãm (I) nhanh chóng đạt đến cân bằng: Trong đó: K1, K-1: Hằng số tốc độ phản ứng Các chất kìm hãm cạnh tranh E + I EI K -1 K1 Hoạt độ enzyme Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 14 Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là một số chỗ kết hợp cần thiết ở enzyme bị chất kìm hãm chiếm mất. Do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau: Các chất kìm hãm không cạnh tranh Kiểu cạnh tranh trên là hiện tượng chiếm đoạt trung tâm hoạt động trong cấu trúc enzyme, nhưng kiểu kìm hãm không cạnh tranh lại xảy ra hoàn toàn khác hẳn. Ở đây, chất kìm hãm sẽ kết hợp với enzyme ở vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme. Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể trở thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu: S1 + S2 = P1 + P2 Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2. Kìm hãm do thừa cơ chất Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + I EI E + S ES E + P E + S = ES E + P E + I = EI ES + I = EIS EI + S = EIS E + S = ES E + P Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 15 Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng dính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này được coi là chất kìm hãm. ES + S = ESS 2.3.6 Các chất hoạt hóa Các chất hoạt hóa enzyme có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hóa hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme. Hình 11. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động enzyme 2.4 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase 2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, axid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Trong môi trường lên men nitơ thường được bổ sung dưới dạng muối nitrate, các hợp chất amon hoặc một số hợp chất có nguồn gốc vi sinh vật. Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị axid hóa, quá trình dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase. Fenikxova và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và thấy rằng sinh tổng hợp α-amylase giảm 10 lần mà sự tạo thành glucoamylase hầu như không bị ảnh hưởng. Kết quả được thể hiện ở bảng 3. Enzyme không hoạt động Chất cảm ứng Cơ chất Enzyme hoạt động Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 16 Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp amylase Hoạt độ enzyme sau 6 ngày nuôi (đv/100ml) Nguồn nitơ Liều lượng muối (% theo N) α-amylase Glucoamylase NaNO3 0,30 145 8.000 NaNO3 0,15 26 3.300 NH4NO3 0,15 98 4.100 NH4NO3 0,30 45 4.900 NH4H2PO4 0.30 5,5 8.000 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Sự tạo thành glucoamylase cũng như amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao từ (0,25-0,4%). Tỷ lệ khối lượng giữa carbon và nitơ trong môi trường, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới có thể tích lũy được enzyme cực lớn. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia. Tỷ lượng tối ưu giữa carbon và nitơ (C:N) cho sự sinh tổng hơp amylase là 10:1- 40:1. Nói cách khác hàm lượng carbon trong môi trường phải 10- 40 lần hàm lượng nitơ. 2.4.2 Ảnh hưởng của axid amin Acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme. Acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase do các nguyên nhân sau: Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ và là nguồn năng lượng. Nhiều vi sinh vật có thể đồng hóa trực tiếp acid amin (Konvalov, 1967). Một số aid amin riêng lẽ (acid glutamic, acid aspartic) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi axid amin cụ thể là sinh tổng hợp nhiều axid amin khác trong quá trình chuyển amin hóa (Araiet và ctv, 1968). Nhiều acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như acid pantotenic, biotin, acid folic, các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. ngoài ra có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của acid amin trong môi trường nuôi. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 17 Acid amin có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kìm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số acid amin kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các amylase, một số thì ức chế quá trình này, một số thì không có ảnh hưởng gì cả. Chẳng hạn, sự tổng hợp amylase khi nuôi chủng Aspergillus awamori được kích thích bởi hai acid amin là acid glucomic và tyrosine. Sự tổng hợp glucoamylase được tăng cường bằng bốn acid amin: acid glutamic, tyrosine, aspartic và β-alanine. 2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme. MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lượng glucoamylase giảm xuống hàng chục lần (Fenikxova và Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho sinh tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0,05%, thiếu muối này không ảnh hưởng đến sự tạo thành oligo- 1,6-glucosidase (Silov, 1967). Phosphor cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic acid phospholipide) và nhiều coenzyme (adenosine-phosphat, thiamine), đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy hóa sinh học. Phosphor ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzyme amylase. Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới 0,15M. Hoạt độ α- amylase và oligo-1,6-glucosidase tăng khi có 0,1% KH2PO4, còn hoạt độ glucoamylase tăng cực đại khi có 0,2% muối này. Calcium cần cho sự tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzyme này. Nó còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease (Hsiu, 1964). Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng calcium trong môi trường là 0,01-0,05%. Lưu huỳnh kích thích tạo amylase (lưu huỳnh có trong thành phần các axid amin quan trọng như: methionine, cystine, cystein). Lưu huỳnh với hàm lượng 0,07g/ml môi trường là thích hợp nhất cho Aspergillus oryzae tạo amylase (300- 350 đv/100ml). Giảm hàm lượng lưu huỳnh tới 0,004% thì hoạt lực amylase giảm xuống hai lần. Ngoài Ca2+, trong phân tử α-amylase của Bacillus subtilis còn có chứa ion Zn2+. Magan, đồng, thủy ngân kìm hãm sinh tổng hợp ở vi sinh vật. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 18 2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme (bảng 4). Bảng 4. Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp amylase pH môi trường Hoạt độ enzyme trong mốc thành phẩm (đv/g) Các chất làm ẩm cám tới độ ẩm 60% Trước Thanh trùng Sau thanh trùng Mốc Thành phẩm α-amylase Oligo-1,6 glucoside Maltase Nước máy 6,0 6,1 6,4 25 1.008 130 HCl (0,1N) 5,0 6,7 6,7 27,3 1.230 134 HCl (0,2N) 4,5 6,8 6,8 24,7 1.172 127 HCl (0,25N) 4,0 6,1 6,1 10,4 1.100 134 HCl (0,3N) 3,6 6,0 6,0 8,7 1.130 133 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Đối với Aspegillus awamoori, pH ban đầu là 6,3 thì nấm mốc tạo α-amylase cực lớn. Nếu pH ban đầu là 3 thì nấm sợi sẽ tạo nhiều oligo-1,6-glucosidase và α-1,4- amyloglucosidase, còn pH là 7,4 thì sự tổng hợp cả Bacillus subtilis enzyme đều giảm (Grigorev, 1968). Đối với vi khuẩn pH tốt nhất để tạo enzyme là 6,6 -7,4. 2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 - 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 55- 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sinh trưởng Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 19 và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo amylase. Sự thay đổi độ ẩm của môi trường nuôi cấy đến hoạt đô của enzyme thể hiện trong bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng độ ẩm của môi trường tới hoạt độ enzyme amylase 20 giờ 34 giờ 42 giờ Phương án thí nghiệm Độ ẩm (%) Hoạt độ amylase (đv/g) Độ ẩm (%) Hoạt độ amylase (đv/g) Độ ẩm (%) Hoạt độ amylase (đv/g) Khay để hở 27,8 15,0 23,8 18,0 22,0 20,5 Khay đậy nắp 46,4 20,4 42,4 32,9 42,4 36,7 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 2.5 Phương pháp nuôi Enzyme amylase là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein và chúng chỉ được tổng hợp bằng con đường sinh học mà chủ yếu là ở vi sinh vật. Nguồn enzyme amylase từ Aspergillus oryzae được sử dung nhiều nhất và có nhiều ưu điểm nổi bật: Hoạt tính amylase từ vi sinh vật rất cao, chỉ một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ chất khá lớn, cường độ phản ứng xảy ra rất mạnh khi được xúc tác bởi các enzyme loại này. Aspergillus oryzae có cường độ sinh sản cực kỳ mạnh và tổng hợp amylase với tốc độ rất nhanh chóng. Trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme rất lớn. Môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae tạo enzyme amylase thì rất dễ kiếm và rẻ tiền, thường là những phụ liệu công nghiệp nên giá thành rẻ hơn và dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất. Aspergillus oryzae chịu ảnh hưởng rất lớn ở các thành phần dinh dưỡng môi trường, do dó người ta có thể tác động những biện pháp khác nhau hoặc thay đổi thành phần dinh dưỡng để tạo ra các enzyme có hoạt tính cao và khối lượng lớn. 2.5.1 Cách tiến hành Chuẩn bị 50g môi trường cơ bản trên mỗi bình tam giác có dung tích 250ml, hoặc 10g môi trường trên các đĩa Petri. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 20 Dùng dung dịch đệm tạo ra độ ẩm môi trường từ 60 - 65%, đem triệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Chuẩn bị 3 - 5 ống nghiệm nước vô khuẩn. Bằng thao thác vô trùng thực hiện trong tủ cấy vô trùng, đổ 10ml nước vô trùng này vào các ống nghiệm giống. Dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy nhẹ để bào tử nấm sợi Aspergillus oryzae hòa điều trong nước. Dùng pipet vô trùng hút lấy 2ml cho vào đĩa Petri có chứa môi trường vô khuẩn đã được làm nguội, hoặc đổ toàn bộ 10ml nước đã hòa tan đều bào tử vào bình tam giác có môi trường đã thanh trùng hoặc làm nguội. Lắc đều để môi trường trong bình tam giác trộn đều với bào tử hoặc xoay đều để môi trường trong đĩa Petri trộn đều với bào tử. Bao gói đĩa Petri hoặc đậy nắp bông bình tam giác và để vào tủ ấm có nhiệt độ ổn định 37oC. Nuôi trong thời gian 36 giờ. Nếu thí nghiệm được thực hiện với mục đích thu nhận lượng chế phẩm thô nhiều hơn ta có thể nuôi chúng trong bình tam giác 1000ml với lượng môi trường 200- 250g. hoặc có thể nuôi chúng trong các khay nhôm. Chiều dày của khối môi trường trên khay khoảng 3-5cm là tốt nhất. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme được tạo ra nhiều nhất. Ta nên thu nhận chế phẩm thô ngay giai đoạn này. Chế phẩm thô sau khi thu nhận được đem đi sấy ở nhiệt độ dưới 40oC có quạt thông gió để dễ dàng bảo quản và dùng lâu dài. 2.5.1Phương pháp nuôi cấy Nuôi cấy nấm mốc có rất nhiều phương pháp: Nuôi cấy trên bề mặt rắn, nuôi cấy trên bề mặt lỏng, nuôi cấy chìm trong đó phương pháp nuôi cấy trên bề mặt rắn được sử dụng phổ biến do có nhiều ưu điểm sau: • Nuôi cấy bề mặt dễ thực hiện. Qui trình công nghệ thường không phức tạp. • Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là ưu điểm rất quan trọng giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt phát triển rất mạnh. • Chế phẩm amylase thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 21 • Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó dễ vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. • Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc biệt là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó ra khỏi toàn bộ khối môi trường nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ được an toàn. Nguyên liệu dùng tạo ra môi trường bán rắn để nuôi cấy Aspergillus oryzae thường là cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột kém chất lượng kháccòn có bổ sung thêm một số dung dịch đặc trưng khác như: nitơ, phosphor, canxi, magiê, để giúp cho việc tổng hợp enzyme amylase cao hơn. Để làm tăng độ xốp của môi trường bán rắn từ các nguyên liệu trên người ta cho thêm phụ liệu có độ xốp cao. Trong các loại phụ liệu đó, người ta dùng trấu hoặc lõi ngô đã được làm nhỏ. Tuy nhiên các phụ liệu cho vào thường là vật liệu chứa ít chất dinh dưỡng, do đó lượng phụ liệu cho vào thường khoảng 15 - 20%. Mặc khác để tăng cường quá trình sinh tổng hợp các enzyme amylase cảm ứng, người ta thường cho thêm vào môi trường những chất có tính cảm ứng cho các enzyme này như: nitơ, phosphor, canxi, magiê, độ ẩm trong môi trường bán rắn thường được tạo ra là 58 - 60%. Nhiệt độ nuôi thường khoảng 28 - 30oC, thời gian nuôi từ 36 - 72 giờ. Chiều dày của lớp môi trường tốt nhất thường nằm trong khoảng 2 -3 cm. Trong quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường vi sinh vật thường trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn đầu: Thời gian kéo dài từ 10-15 giờ đầu. Ở giai đoạn này bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu giai đoạn hô hấp, do đó nhiệt độ trong phòng nuôi cố duy trì ở 28 - 30oC. Giai đoạn thứ hai: Thời gian kéo dài từ 14 - 18 giờ kể từ khi kết thúc giai đoạn thứ nhất. Giai đoạn này hệ sợi nấm bắt đầu phát triển, quá trình hô hấp tăng mạnh, lượng nhiệt trong môi trường tăng nhanh. Tính chất vật lý và thành phần môi trường bắt đầu thay đổi. Để tránh ảnh hưởng của nhiệt (do quá trình hô hấp tạo ra) người ta thường phải thông gió trong giai đoạn này. Mặt khác, do quá trình tăng nhiệt trong khối môi trường nên độ ẩm của chúng cũng giảm rõ rệt. Để khắc phục tình trạng này phải tạo ra một hệ thống điều hòa độ ẩm không khí khoảng 80-90% là tốt nhất. Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, giai đoạn này kéo dài khoảng 10- 12 giờ. Nhiệt độ khối môi trường bán rắn dần dần hạ xuống, cường độ hô hấp của Aspergillus oryzae giảm một cách rõ rệt, hệ sợi của nấm mốc Aspergillus oryzae Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 22 sẽ được chuyển mạch từ màu xám trắng của giai đoạn trước sang màu vàng hoa cao của khối bào tử. Ở thời kỳ bào tử đã già hoạt tính của enzyme amylase thường giảm rõ rệt. Toàn bộ khối môi trường đã nuôi nấm mốc đó được gọi là canh trường hay chế phẩm enzyme thô. Enzyme amylase được tiết ra môi trường và một phần khá lớn còn nằm lại trong tế bào nấm mốc. 2.5.2 Thu nhận enzyme chế phẩm Nguyên tắc trong quá trình phát triển của vi sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp để tham gia vào quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa. Trong thí nghiệm này, chủ yếu là thu nhận chế phẩm enzyme thủy phân là các loại amylase. Do hoạt tính enzyme không chỉ biểu hiện ở khả năng thủy phân của enzyme mà còn biểu hiện ở khả năng của vi sinh vật tổng hợp ra nó trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sẽ tạo ra enzyme. Các enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vật thoát ra khỏi tế bào để thực hiện các phản ứng thủy phân ngoài tế bào được gọi là enzyme ngoại bào. Khi tổng hợp ra enzyme, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường, tan trong nước, có trong sinh khối của vi sinh vật. Toàn bộ khối vật chất thu nhận được trong quá trình nuôi cấy bao gồm: Sinh khối vi sinh vật, nước có trong đó, enzyme trong và ngoài tế bào và cả khối môi trường mà vi sinh vật không sử dụng hết được gọi là chế phẩm enzyme thô. 2.6 Ứng dụng của enzyme amylase Amylase là enzyme rất thông dụng được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm. Enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử đường glucose. Trong sản xuất rượu: Người ta dùng enzyme amylase làm tác nhân đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu, cho phép tiết kiệm hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt rút ngắn quá trình sản xuất, tiết kiệm được sản xuất bởi enzyme amylase thủy phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian rút ngắn. Enzyme amylase không chỉ quan trọng trong thời gian đường hóa nà còn trong cả quá trình xử lý nhiệt nguyên liệu nữa. Việc sử dụng enzyme amylase để dịch hóa tinh bột khi nấu ở nhiệt độ 85 - 90oC cho phép có thể dùng hơi nước thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu. Điều này làm giảm chi Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 23 phí hơi trong gia nhiệt và tổn thất thiết bị. Vì vậy làm cho hiệu quả sản xuất tăng lên. Trong sản xuất bia: Trong công nghiệp sản xuất bia, enzyme amylase có trong mầm đại mạch được sử dụng để thủy phân tinh bột có trong đại mạch. Khác với rượu ở đây mức độ đường hóa tinh bột chứa trong nguyên liệu thấp hơn. Cần có các dextrin chưa đường hóa làm cho bia có hương vị. Việc chuyển hóa tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do các enzyme amylase đảm nhận. Do đó, trong quá trình đường hóa và dịch hóa thì enzyme amylase có ý nghĩa và vai trò quan trọng bậc nhất. Việc bổ sung amylase từ các nguồn khác như vi sinh vật vào quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất cho từng giai đoạn. Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: • Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt, do đó làm tăng hiệu suất lao động. • Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như: gạo, bắp, những nguyên liệu không nảy mầm. • Giảm tổn thất tinh bột và các chất hòa tan khi cho hạt nảy mầm, làm tăng hiệu suất chất hòa tan lên đáng kể. Trong công nghiêp sản xuất bánh mì: Trong sản xuất bánh mì enzyme amylase được xem như là một chất phụ gia cho quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme amylase được đưa vào để giải quyết các vấn đề sau: • Làm tăng nhanh thể tích bánh • Làm màu sắc của bánh đẹp hơn • Làm tăng mùi thơm cho bánh Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả α-amylase và β-amylase, các enzyme này thủy phân tinh bột để tạo thành đường. việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt. Trong sản xuất bánh kẹo: Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh. Do đó, người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh. Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và axid amin. Đường khử và axid amin có trong khối bột cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử, phản ứng maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường: Sản xuất siro đường fructose từ tinh bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh. Theo Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 24 phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan trong nước. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét. Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa, các enzyme này giúp cho quá trình đường hóa rất dễ dàng. Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Trong xay xát: các bột nghèo enzyme α-amylase được cải thiện bằng cách bổ sung α-amylase vào trong khối bột. Công nghệ sản xuất đường: Enzyme amylase được bổ sung trong nước mía để cải thiện tốc độ lọc nước mía bằng cách thủy phân tinh bột trong nước ép mía giúp cho quá trình lọc nhanh hơn. Trong công nghiệp dệt và làm giấy: Chế phẩm amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis, B.mensentericus có tính ưu việt và chịu nhiệt cao nên được dùng để tẩy lớp hồ bột trên vải. Trong vải mộc thường chứa 5% tinh bột và những tạp chất khác. Công nghiệp bột giặt: Tăng khả năng làm sạch của bột giặt đối với quần áo bị bẩn do tinh bột. Trong chăn nuôi: Người ta sử dụng amylase bằng hai cách: Trộn thẳng enzyme vào thức ăn khi cho gia súc ăn hoặc xử lý sơ bộ thức ăn trước bằng enzyme amylase. Chế phẩm amylase được sử dụng riêng lẽ hoặc phối hợp với protease, hemicellulase để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, dễ hấp thu cho gia súc. Trong y học: Enzyme amylase thường được phối hợp với các enzyme thủy phân khác để điều trị các biến chứng có liên quan đến đường tiêu hóa. Ngoài ra, enzyme amylase còn được dùng để tăng cường và cải thiện quá trình tiêu hóa thường được sử dụng ở dạng viên. Enzyme amylase còn được dùng để điều trị các chứng bệnh về tim, hệ thần kinh, enzyme amylase còn dùng để điều chế các môi trường dinh dưỡng chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, giúp cho công tác nghiên cứu vi sinh vật học trong các viện và phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 25 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Dụng cụ và hóa chất Giống vi sinh vật được dùng trong thí nghiệm là nấm sợi Aspegillus oryzae. Nấm sợi này có thể sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, pectinase và cả cellulase tùy theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào. Môi trường bán rắn cơ bản gồm: Cám Trấu Các nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng (bột gạo và các muối nitrate) để tổng hợp ra enzyme tương ứng Độ ẩm môi trường là 60 - 65% Các dụng cụ thủy tinh dùng trong nuôi cấy gồm đĩa Petri, bình tam giác Khay Hình 12. Máy đông khô Hình 13. Máy phân tích ẩm Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 26 Hình 14. Máy đo pH Hình 15.Thiết bị đo mật độ quang Hình 16. Tủ ủ Dưới đây là phần thực nghiệm để thu nhận enzyme thô. Đánh giá chất lượng enzyme thô Chế phẩm enzyme thô được xác định hoạt tính chung và hoạt tính enzyme riêng theo những phương pháp tương tứng. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – K