Luận văn Khảo sát tính thích nghi của cây hoàng lan [Cananga odorata(Lam.) Hook. f. et Thomson] tạo được từ các kỹ thuật nhân giống khác nhau tại Thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước

g của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 4 (%) Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 8 (%) Thời gian thực hiện Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 95 ± 1.51 90 ± 2.25 82.5 ± 2.00 77.5 ± 2.00 67.5 ± 3.28 67.5 ± 3.53 04-06/2010 50 ppm IBA 95 ± 1.59 90 ± 1.84 90 ± 1.29 90 ± 1.31 85 ± 0.92 85 ± 1.59 06-08/2010 100ppm IBA 57.5 ± 2.72 37.5 ± 3.01 25 ± 0.92 20 ± 2.25 15 ± 3.05 12.5 ± 1.52 03-05/2010 500ppm IBA 70 ± 3.44 60 ± 5.36 52.5 ± 3.53 55 ± 3.05 32.5 ± 2.00 17.5 ± 1.52 03-05/2010 1000ppm IBA 85 ± 3.05 20 ± 2.59 10 ± 1.29 62.5 ± 4.34 20 ± 2.59 7.5 ± 1.52 02-04/2010 50ppm 2,4D + 100ppm IBA 100 92.5 ± 2.39 75 ± 3.05 85 ± 3.05 82.5 ± 2.39 37.5 ± 2.72 05-07/2010 100ppmIAA + 100ppm IBA 67.5 ± 2.00 57.5 ± 2.00 55 ± 2.76 67.5 ± 2.00 57.5 ± 2.00 55 ± 2.76 05-07/2011 Oxyberon dust 0.5 92.5 ± 2.39 80 ± 2.59 70 ± 2.25 62.5 ± 2.00 62.5 ± 2.00 57.5 ± 5.26 04-06/2010 N3M 100 100 90 ± 3.18 100 82.5 ± 2.39 60 ± 1.30 04-06/2010 Từ tháng 02 – 05/2010, các nghiệm thức sử dụng IBA với nồng độ 100ppm, 500ppm, 1000ppm được tiến hành. Các đoạn thân chịu sự ảnh hưởng phần lớn từ điều kiện ngoại cảnh, nên có tỷ lệ sống thấp hơn so với đối chứng. Trong đó, đoạn 1 có tỷ lệ sống trung bình cao hơn so với đoạn 2 và 3, tỷ lệ sống của đoạn này tăng dần theo nồng độ IBA, cao nhất là 62,5% ở 1000ppm IBA. Đối với đoạn 2 và 3, tỷ lệ sống ở 500ppm IBA cao hơn so với 100ppm và 1000ppm. Nghiệm thức IBA có nồng độ 50ppm được tiến hành vào tháng 06 – 08/2010, tỷ lệ sống của các đoạn sau 8 tuần cao hơn so với đối chứng, đoạn 1 là 90%, đoạn 2 và 3 là 85%. Như vậy, sự sống sót của cành giâm hoàng lan chịu ảnh hưởng khá lớn từ điều kiện khí hâu và thời điểm giâm cành hoàng lan thích hợp nhất vào những tháng mùa mưa của năm. Các nghiệm thức có sự kết hợp giữa IBA với 2,4D và IAA được tiến hành cùng thời gian vào tháng 05 – 07/2010. Ở nghiệm thức 100ppm IBA kết hợp với 50ppm 2,4D, kết quả về tỷ lệ sống cũng giảm dần sau 8 tuần, tỷ lệ sống trung bình của đoạn 1 và 2 cao hơn so với đối chứng, tuy nhiên thấp hơn so với kết quả thu được từ nghiệm thức có 50ppm IBA, như vậy, chính 2,4D là tác nhân chính làm giảm tỷ lệ sống của các đoạn thân, và sự ảnh hưởng này thể hiện rõ rệt qua tỷ lệ sống của đoạn 3. Tương tự như vậy, ở nghiệm thức có sự kết hợp giữa 100ppm IBA và 100ppm IAA, IAA đã có ảnh hưởng tức thời lên các cành giâm, nên chỉ sau 3 tuần tỷ lệ sống của các đoạn thân giảm đi và thấp hơn so với đối chứng, sau đó tỷ lệ này không đổi sau các tuần tiếp theo. Số liệu trên bảng 8 cho thấy, để giâm hom đoạn thân hoàng lan có thể sử dụng thuốc N3M hay IBA (50mg/l) để đạt hiệu quả cao. Thời gian áp dụng từ tháng 6 – 8 trong năm. 3.1.2. Thời gian ra rễ Theo nghiên cứu của Hoang và cộng sự (Philipines), hoàng lan là loại cây dễ ra rễ. Tuy nhiên, sự hình thành rễ mới ở cành tay và thân cây không giống nhau. Theo dõi sự ra rễ của các đoạn cành tay và đoạn thân hoàng lan, thời gian ra rễ được xác định như sau: Đối với cành tay hoàng lan, thời gian ra rễ của các đoạn cành khá chậm. Dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng IBA ở nồng độ 1000ppm và thuốc thương phẩm Oxyberon dust 0.5 (Nhật), sau 4 tuần, các đoạn cành bắt đầu ra rễ và tiếp tục ra rễ ở 3 – 4 tuần sau đó. Đối với thân hoàng lan, ở nghiệm thức đối chứng, các đoạn thân ra rễ sau 4 tuần kể từ khi được giâm vào giá thể. Khi có tác động của chất điều hòa sinh trưởng, thời gian ra rễ nhanh hơn, sau 2 – 3 tuần giâm vào giá thể, các đoạn thân bắt đầu ra rễ. Cụ thể : - Ở nghiệm thức có IBA 50ppm, 500ppm, IBA 100ppm kết hợp với 2.4D 50ppm, IBA 100ppm kết hợp với IAA 100ppm và thuốc thương phẩm N3M (Việt Nam) , rễ mới xuất hiện sau 5 hoặc 6 tuần. - Ở nghiệm thức có IBA 1000ppm và Oxyberon dust 0.5, rễ mới xuất hiện sau 2 tuần. Như vậy, thân hoàng lan có thể ra rễ sau 3 tuần kể từ khi giâm vào giá thể, và tiếp tục ra rễ trong các tuần tiếp theo cho đến tuần thứ 8. Cành tay hoàng lan khó ra rễ hơn, dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng, các đoạn cành ra rễ sau 4 tuần. Qua đó, tôi đã theo dõi quá trình ra rễ của hoàng lan ở 2 mốc thời gian : 3 – 4 tuần, và 6 – 8 tuần. 3.1.3. Tỷ lệ tạo rễ trong giâm cành hoàng lan 3.1.3.1. Tỷ lệ tạo rễ của các đoạn cành tay trong giâm cành Kết quả ra rễ của cành giâm từ cành tay hoàng lan được trình bày ở bảng 9. Bảng 9. Tỷ lệ ra rễ của các đoạn cành tay hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ ra rễ TB ở tuần thứ 4 (%) Tỷ lệ ra rễ TB ở tuần thứ 8 (%) Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 0 0 0 0 0 0 50ppm IBA 0 0 0 0 0 0 100ppm IBA 0 0 0 0 0 0 500ppm IBA 0 0 0 0 2.5 ± 3.53 0 1000ppm IBA 0 0 0 2.5 ± 0.79 5 ± 1.59 0 50ppm 2,4D + 100ppmIBA 0 0 0 0 0 0 100ppm IAA + 100ppm IBA 0 0 0 0 0 0 Oxyberon dust 0.5 7.5 ± 1.52 0 0 15 ± 2.00 2.5 ± 0.79 0 N3M 0 0 0 0 0 0 Nhìn chung, cành tay hoàng lan khó ra rễ. Sau 8 tuần, ở nghiệm thức đối chứng, các đoạn cành tay hoàng lan không ra rễ. Ở tất cả các nghiệm thức, đoạn 3 – đoạn ở gần gốc cành tay không ra rễ.  Hình 5. Các đoạn cành tay ra rễ A. 500ppm IBA – đoạn 2; B. 1000ppm IBA – đoạn 1; C. 1000ppm IBA- đoạn 2; D. Oxyberon dust 0.5 – đoạn 1; E. Oxyberon dust 0.5 – đoạn 2 Khi bổ sung IBA với nồng độ tăng dần từ 50 – 1000ppm, các đoạn 2 ra rễ tốt hơn so với đoạn 1. Đồng thời, những nghiệm thức được thực hiện trong điều kiện ngoại cảnh thích hợp (phụ lục 1), các đoạn cành dễ ra rễ hơn.Tuy nhiên tỷ lệ ra rễ trung bình còn thấp. Đoạn 2 hình thành rễ mới ở 500ppm IBA với tỷ lệ 2,5%. Ở nghiệm thức IBA 1000ppm, đoạn 1 ra rễ với tỷ lệ 2,5%; đoạn 2 có tỷ lệ ra rễ với tỷ lệ 5%, cao hơn so với đoạn 1 và so với đoạn 2 ở nồng độ 500ppm IBA. Ở các nghiệm thức sử dụng các thuốc ra rễ thương phẩm, thuốc kích thích ra rễ N3M chưa có hiệu quả đối với các đoạn cành. Trong khi đó, sử dụng thuốc Oxyberon dust 0.5 (Nhật Bản) cho kết quả tốt lên đoạn 1 với tỷ lệ ra rễ trung bình là 7,5% sau 4 tuần, và 15% sau 8 tuần; tỷ lệ ra rễ trung bình ở đoạn 2 là 2,5% sau 8 tuần. Tác dụng của sự kết hợp giữa IBA với các auxin khác đã không có hiệu quả đối với sự ra rễ của cành tay hoàng lan, các đoạn cành ở các nghiệm thức này không ra rễ. Như vậy, cành tay hoàng lan có tỷ lệ ra rễ không cao, đoạn 2 ra rễ tốt hơn so với các đoạn ở các vị trí khác trên cành tay. Trong thí nghiệm này, IBA ở nồng độ 1000ppm có hiệu quả tốt nhất cho sự ra rễ của cành tay. 3.1.3.2. Tỷ lệ tạo rễ của đoạn thân trong giâm cành Thực hiện các thí nghiệm tương tự như ở cành tay hoàng lan, các đoạn thân có tỷ lệ ra rễ cao hơn. Các kết quả được trình bày ở bảng 10. Nghiệm thức đối chứng, đoạn 2 ra rễ với tỷ lệ 10%, cho thấy đoạn này dễ ra rễ hơn so với đoạn 1 và 3, trong đó đoạn 1 không ra rễ. Dưới tác dụng của thuốc kích thích ra rễ thương phẩm, các đoạn thân ra rễ nhiều hơn đối chứng. Tỷ lệ ra rễ của đoạn 2 là 27,5% khi dùng N3M và 35% khi dùng Oxyberon dust 0.5, cao hơn hẳn so với đoạn 1 và đoạn 3. Ở các nghiệm thức có IBA với nồng độ tăng dần từ 100 – 1000ppm, tỷ lệ ra rễ của các đoạn 1, 2 và 3 tăng theo mức tăng của nồng độ IBA, đoạn 1 có tỷ lệ ra rễ cao nhất 40% ở 1000ppm IBA. Dưới tác động của ngoại cảnh, các đoạn thân không ra rễ hoặc ra rễ với tỷ lệ thấp. Tại nồng độ 100ppm IBA, các đoạn không ra rễ; hoặc ở nồng độ IBA 500ppm và 1000ppm, đoạn 2 và 3 có tỷ lệ ra rễ thấp hơn so với đoạn 1. Bảng 10. Tỷ lệ ra rễ của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ (%) ra rễ TB ở tuần thứ 4 Tỷ lệ (%) ra rễ TB ở tuần thứ 8 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 0 0 0 0 10 ± 1.29 5 ± 0.92 50 ppm IBA 0 0 0 7.5 ± 1.52 22.5 ± 2.00 15 ± 1.59 100ppm IBA 0 0 0 0 0 0 500ppm IBA 7.5 ± 2.39 2.5 ± 0.79 0 12.5 ± 3.01 2.5 ± 0.79 0 1000ppm IBA 12.5 ± 0.8 0 0 40 ± 3.90 15 ± 3.05 2.5 ± 0.79 50ppm 2,4D + 100ppm IBA 0 0 0 12.5 ± 0.79 17.5 ± 2.00 10 100ppm IAA + 100ppm IBA 0 2.5 ± 0.79 0 22.5 ± 0.79 25 ± 0.92 17.5 ± 2.39 Oxyberon dust 0.5 2.5 ± 0.79 7.5 ± 0.79 0.25 ± 0.79 27.5 ± 2.76 35 ± 3.79 22.5 ± 4.19 N3M 0 0 0 10 ± 1.29 27.5 ± 2.72 5 ± 1.59 Trong điều kiện khí hậu thích hợp, các đoạn 3 có tỷ lệ sống cao hơn và ra rễ dễ hơn. Tại nồng độ IBA 50ppm, tỷ lệ ra rễ của các đoạn thân cao hơn so với đối chứng, đoạn 2 tỏ ra dễ ra rễ hơn, đặc biệt đoạn 3 ra rễ với tỷ lệ cao hơn đoạn 1. Ở các nghiệm thức kết hợp giữa IBA với 2,4D và IAA, cả 3 đoạn đều ra rễ và đoạn 2 ra rễ nhiều nhất. Tỷ lệ ra rễ của các đoạn này đều cao hơn so với đối chứng, nhưng tỷ lệ ra rễ ở đoạn 1 là 22.5% thấp hơn so với kết quả ở nồng độ 1000ppm IBA. Như vậy, sự phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trưởng tác động lên sự ra rễ của thân hoàng lan với hiệu quả còn thấp. Như vậy, IBA là kích tố ra rễ thích hợp để thực hiện giâm cành các đoạn thân hoàng lan. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Trong các nồng độ IBA đã thực hiện, nồng độ 1000ppm IBA cho kết quả ra rễ tốt nhất, tỷ lệ ra rễ cao nhất là 40% ở Hình 6. Các đoạn thân ra rễ A.Đoạn 1; B. Đoạn 2; C. Đoạn 3 đoạn 1 của thân. Thuốc thương phẩm kích thích ra rễ có nguồn gốc khác nhau cũng có hiệu quả trong giâm cành ở mức độ thấp hơn. Thuốc N3M có thể sử dụng để nhân giống hoàng lan 1 cách rộng rãi và dễ dàng bằng phương pháp giâm cành. 3.1.4. Số lượng và kích thước rễ Trong giâm cành, một bộ phận của cây bị tách rời cơ thể mẹ, để có thể sống độc lập, nó phải phát triển thành một cơ thể mới, tái sinh các cơ quan dinh dưỡng. Sự tái sinh bộ rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính của loài, điều kiện ngoại cảnh, hàm lượng các phytohormones (auxins), vị trí của cành giâm trên cây, lượng chất dinh dưỡng chứa trong cành giâm, độ lớn của cành giâm… Dưới tác động của chất kích thích ra rễ khác nhau, các vị trí khác nhau trên thân và cành hoàng lan tái sinh bộ rễ với số lượng và chiều dài rễ khác nhau. 3.1.4.1. Số lượng và chiều dài rễ ở cành tay hoàng lan Các đoạn cành tay hoàng lan có thể ra rễ ở các nghiệm thức 500 – 1000ppm IBA và Oxyberon dust 0.5. Số lượng rễ được hình thành và chiều dài rễ sau 8 tuần được trình bày trên bảng 11. Bảng 11. Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn cành hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Số rễ Chiều dài rễ (cm) 500ppm IBA 1 6 1000ppm IBA 1- 2 6.5 - 8 Oxyberon dust 0.5 4 - 6 2 - 5.5 Qua bảng 11, ở các nghiệm thức 500ppm và 1000ppm IBA, số lượng rễ hình thành được ít, từ 1 – 2 rễ, chiều dài rễ dao động từ 6–8cm. Nghiệm thức 1000ppm IBA, số lượng rễ mới nhiều hơn và rễ dài hơn so với 500ppm IBA. Ở nghiệm thức sử dụng thuốc Oxyberon dust 0.5, chất lượng bộ rễ tốt hơn, các đoạn có từ 4 – 6 rễ mới, chiều dài rễ ngắn hơn, từ 2 – 5,5cm. Các nghiệm thức này được tiến hành cùng thời gian (11 – 12/2009), nên chịu ảnh hưởng của tác nhân ngoại cảnh như nhau. Như vậy, chất lượng bộ rễ phụ thuộc chủ yếu vào liều lượng và chất kích thích ra rễ. 3.1.4.2. Số lượng và chiều dài rễ ở thân hoàng lan Chất lượng bộ rễ của các đoạn cành giâm từ thân hoàng lan tốt hơn so với bộ rễ ở các đoạn cành tay. Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn thân được thể hiện ở bảng 12. Ở tất cả các nghiệm thức, số lượng rễ hình thành được ở đoạn 2 cho số rễ cao hơn đoạn 1 và 3. Dựa theo kết quả về số rễ có được từ các nghiệm thức, số rễ của các cành giâm nhiều hơn khi nồng độ IBA tăng. Ở nghiệm thức IBA 1000ppm, số rễ thống kê được cao hơn so với đối chứng. Bảng 12. Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất - 1.25 ± 0.79 - - 1.02 ± 0.87 - 50 ppm IBA - 1.89 ± 0.71 1.67 ± 1.27 - 2.42 ± 0.91 2.83 ± 0.62 100ppm IBA - - - - - - 500ppm IBA 2.29 ± 1.48 - - 1.69 ± 0.52 - - 1000ppm IBA 2.5 ± 0.51 2.83 ± 2.24 - 2.87 ± 1.08 1.13 ± 0.36 - 50ppm 2,4D + 100ppm IBA 1 1.71 ± 0.69 - 2.52 ± 2.29 1.3 ± 0.50 - 100ppm IAA + 100ppm IBA 1.22 ± 0.34 2 ± 0.58 1.29 ± 0.45 3.37 ± 1.42 2.63 ± 0.95 2.06 ± 1.13 Oxyberon dust 0.5 2.8 ± 0.56 3.56 ± 1.12 2.56 ± 1.49 2.79 ± 0.86 2.01 ± 0.48 1.26 ± 0.44 N3M - 1.91 ± 0.70 - - 1.98 ± 0.83 - Đối với chiều dài rễ, rễ của các đoạn 1 dài nhất và rễ của các đoạn 2 dài hơn rễ đoạn 3, có thể là do các tế bào ở đoạn 1 gần mô phân sinh đỉnh ngọn, nên rễ hình thành được sẽ phát triển nhanh hơn. Chiều dài rễ cũng tăng dần theo nồng độ của IBA. Qua kết quả trên, ta cũng thấy được, ở điều kiện ngoại cảnh thuận lợi (phụ lục 1), các cành giâm có tỷ lệ ra rễ cao, thì số lượng rễ nhiều hơn và kích thước rễ cũng dài hơn, điều này được thể hiện ở kết quả của hầu hết các nghiệm thức trên bảng 11. 3.2. Kết quả nuôi cấy invitro chồi hoàng lan 3.2.1. Kết quả vô trùng chồi ngọn hoàng lan Dưới tác động của các hóa chất khử trùng (Javel, HgCl2), các mẫu chồi hoàng lan được vô trùng, tuy nhiên, đối với từng loại chất khử trùng và nồng độ chất khử trùng khác nhau, tỷ lệ mẫu được vô trùng cũng khác nhau, đồng thời, tỷ lệ sống của mẫu cấy cũng bị ảnh hưởng. Các kết quả về khử trùng mẫu chồi hoàng lan được thể hiện ở bảng 13 và hình 7. Về tỷ lệ số mẫu vô trùng, xử lý mẫu cấy bằng HgCl2 tỏ ra hiệu quả hơn so với xử lý bằng Javel. Khi sử dụng Javel để khử trùng mẫu, nồng độ và thời gian xử lý mẫu càng cao, các tác nhân gây hại (nấm, vi khuẩn) bị loại bỏ càng nhiều, nên tỷ lệ mẫu vô trùng tăng lên. Nhưng Javel cho hiệu quả khử trùng rất thấp. Ở nồng độ 10% Javel xử lý mẫu trong thời gian 10 phút và 15 phút, đều không có hiệu quả khử trùng. Ở nồng độ 50% Javel xử lý mẫu trong 15 phút, tỷ lệ số mẫu vô trùng chỉ đạt 13,3%. Khi sử dụng HgCl2 để khử trùng mẫu thì hiệu quả khử trùng mẫu cao hơn. Ở nồng độ 0.05mg/l HgCl2 xử lý trong 5 phút, tỷ lệ số mẫu vô trùng là 66,67%. Bên cạnh đó, tương tự với kết quả khi xử lý bằng Javel, nồng độ HgCl2 và thời gian xử lý tăng lên, tỷ lệ số mẫu vô trùng cũng tăng lên. Ở nồng độ HgCl2 cao nhất (0,1mg/l) xử lý trong thời gian lâu nhất (10 phút) cho hiệu quả khử trùng cao nhất, tỷ lệ số mẫu vô trùng là 93,67%. Về tỷ lệ số mẫu sống vô trùng, các nghiệm thức ở nồng độ 0,07mg/l HgCl2 có tỷ lệ mẫu sống cao hơn so với các nghiệm thức còn lại. Ở các nghiệm thức có nồng độ HgCl2 thấp hơn (0,05mg/l), có hiệu quả khử trùng thấp hơn nên tỷ lệ mẫu sống vô trùng thấp hơn so với các nồng độ cao hơn. Ở các nghiệm thức có nồng độ HgCl2 cao hơn (0,1mg/l)2, tỷ lệ số mẫu sống thấp hơn do ảnh hưởng của chất khử trùng. Bảng 13. Tỷ lệ mẫu vô trùng và tỷ lệ mẫu sống sau khi khử trùng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu vô trùng (%) Tỷ lệ mẫu sống sau khử trùng (%) Hóa chất Nồng độ Thời gian (phút) Javel (%) 10 10 0 0 15 0 0 30 10 3.67 ±1.43 0 15 8.33 ± 3.79 0 50 10 10 ± 2.48 3.33 ± 7.17 15 13.3 ± 3.79 3.33 ± 14.34 HgCl2 (mg/l) 0.05 5 66.67 ± 5.17 51.67 ± 5.17 7 72.33 ± 6.25 53.33 ± 7.17 10 76.67 ± 3.79 55 ± 4.97 0.07 5 81.67 ± 1.43 66.67 ± 5.17 7 82 ± 4.97 73.33 ± 7.17 10 84.5 ± 1.24 78.33 ± 3.79 0.1 5 87.33 ± 5.17 65 ± 6.57 7 92.33 ± 1.43 63.3 ± 5.17 10 93.67 ± 3.79 60.67 ± 6.25 Như vậy, HgCl2 là hóa chất khử trùng hiệu quả hơn so với Javel. Và xử lý mẫu cấy ở nồng độ 0,07mg/l HgCl2 trong thời gian 10 phút có tỷ lệ số mẫu sống vô trùng cao nhất (78,33%). Hình 7. Đồ thị về tỷ lệ số mẫu vô trùng và tỷ lệ mẫu sống 3.2.2. Kết quả về tạo chồi hoàng lan trong nuôi cấy mô Các mẫu cấy vô trùng được cấy chuyền qua môi trường WPM, có chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA. Sau 4 tuần, các chồi mới được hình thành từ các nách lá. Kết quả tạo chồi được thể hiện qua bảng 14 và hình 9. Số liệu trên bảng 14 cho thấy tỷ lệ số mẫu tạo chồi sau 6 tuần nuôi cấy đều giảm trên tất cả các nghiệm thức. Điều này là do, một số mẫu không tạo chồi hoặc tạo nên những cấu trúc bất thường và một số chất có tác động ức chế được sản sinh từ chính mẫu cấy trong quá trình nuôi cấy. Các chồi mới được hình thành sau 3 tuần nuôi cấy bị thoái hóa và tạo nên những dạng bất thường khi được cấy chuyền sang môi trường mới. Các dạng bất thường này có màu xanh nhạt, giòn dễ gãy hoặc có hiện tượng thủy tinh hóa. Kết quả cho thấy, trên các môi trường có bổ sung thêm BA, hoặc BA và NAA đều có tỷ lệ số mẫu tạo chồi nhiều hơn so với môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng (đối chứng). Trong các môi trường có nồng độ BA tăng dần, nồng độ BA 2mg/l có tác dụng tốt trong sự tạo chồi, tỷ lệ số mẫu tạo chồi ở tuần thứ 3 là 57,4% và tuần thứ 6 là 44,37%, cao hơn so với các nồng độ BA còn lại. Tuy nhiên, trong các nghiệm thức có sự phối hợp giữa BA với NAA có kết quả tạo chồi tốt hơn. Tỷ lệ số mẫu tạo chồi cao hơn so với nghiệm thức chỉ bổ sung BA. Ở nghiệm thức có 0,2mg/l NAA và 2mg/l BA, tỷ lệ số mẫu tạo chồi là ở tuần thứ 3 85,17% và ở tuần thứ 6 là 81,53%, cao hơn so với tất cả các nghiệm thức khác, chồi phát triển tốt và các dạng bất thường rất ít. Bảng 14. Tỷ lệ số mẫu tạo chồi và số chồi Nghiệm thức Tỷ lệ số mẫu tạo chồi (%) Số chồi TB/mẫu Đặc điểm Tuần thứ 3 Tuần thứ 6 Đối chứng (không chất điều hòa sinh trưởng) 33.23 ± 1.69 13.83 ± 1.89 1 Số lượng chồi không tăng, dạng không bình thường xuất hiện nhiều. 0.5mg/l BA 40.83 ± 2.59 20.5 ± 1.88 1.14 ± 0.21 Số chồi tăng ít, dạng không bình thường xuất hiện. 1mg/l BA 50.97 ± 2.49 26.57 ± 1.27 1.22 ± 0.21 2mg/l BA 57.4 ± 1.31 44.37 ± 1.76 1.29 ± 0.16 3mg/l BA 42.87 ± 2.55 34.9 ± 2.1 1.15 ± 0.15 0.2mg/l NAA + 2mg/l BA 85.17 ± 1.89 81.53 ± 12.5 1.74 ± 0.23 Số lượng chồi tăng, chồi phát triển tốt, dạng bất thường ít. 0.5mg/l NAA + 2mg/l BA 81.67 ± 3.79 73.17 ± 1.89 1.27 ± 0.17 Chồi ngắn, dạng bất thường nhiều. 1mg/l NAA + 2mg/l BA 72.67 ± 2.87 61.5 ± 1.24 1.25 ± 0.19  Hình 8. Chồi hoàng lan trong các môi trường tạo chồi A.Đối chứng; B. 0.5mg/l BA; C. 1mg/l BA; D. 2mg/l BA; E. 3mg/l BA; F. 0.2mg/l NAA + 2mg/l BA; G. 0.5mg/l NAA + 2mg/l BA; H. 1mg/l NAA + 2mg/l BA Tương tự như trên, về số chồi/mẫu, môi trường có bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng có số chồi mới cao hơn so với đối chứng. Trong các môi trường có từ 0,5 – 3mg/l BA, số chồi/mẫu hình thành càng nhiều khi nồng độ BA tăng dần, môi trường có 2mg/l BA có số chồi trung bình/mẫu 1,26 chồi cao hơn so với các nồng độ BA khác. Như vậy, nồng độ 2mg/l BA thích hợp để tạo chồi hoàng lan trong nuôi cấy invitro. Môi trường có 2mg/l BA kết hợp với 0,2 – 1mg/l NAA, ở môi trường có 0,2mg/l có số chồi trung bình (1,74 chồi) cho kết quả tạo chồi cao nhất. Hình 9. Đồ thị về tỷ lệ số mẫu tạo chồi Như vậy, nghiệm thức có 0,2mg/l NAA kết hợp với 2mg/l BA thích hợp cho sự tạo chồi trong nuôi cấy mô hoàng lan, trong nghiệm thức này, tỷ lệ số mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu đều cao. Kết quả này tương tự với kết quả nuôi cấy invitro hoàng lan mà Molabayabas và cộng sự (1995) đã thực hiện. Cụm chồi tiếp tục được tạo ra khi cấy chuyền các chồi hoàng lan ở các tuần sau đó. 3.2.3. Kết quả về vươn chồi hoàng lan Nghiệm thức có kết hợp giữa GA3 và BA đã kích thích tăng trưởng chiều cao của các chồi hoàng lan rất rõ rệt. Ở nghiệm thức đối chứng, hình thái chồi trước và sau 3 tuần không thay đổi về màu sắc, hình dạng lá và thân, khó nhận biết sự thay đổi về chiều cao. Trong nghiệm thức có 2mg/l BA, màu sắc chồi trước và sau 3 tuần không có sự thay đổi, các chồi mới vẫn tiếp tục được hình thành, chiều cao chồi tăng chậm. Trong các nghiệm thức có GA3 và BA, sau 3 – 4 ngày cấy chuyền, lá và thân chồi vươn cao, đồng thời màu xanh của chồi trở nên nhạt đi, chiều cao chồi tăng nhanh, cùng với sự tăng trưởng chiều cao ở chồi chính, các chồi nách cũng có sự vươn dài. Kết quả vươn chồi trong nuôi cấy invitro được thể hiện ở bảng 15 và hình 11. Hình 10. Nuôi cấy tăng sinh chồi hoàng lan A.Ban đầu; B. Sau 3 tuần; C. Cụm chồi Bảng 15. Tăng trưởng chiều cao của chồi hoàng lan Nghiệm thức Chiều cao trung bình (cm) Tăng trưởng chiều cao trung bình (cm) Đặc điểm Thời điểm cấy Tuần thứ 3 Đối chứng 1.09 ± 0.06 1.33 ± 0.06 0.24 Chồi và lá có màu xanh đậm, khoảng cách đoạn thân giữa các lá ngắn. 2mg/l BA 1.16 ± 0.05 1.69 ± 0.07 0.53 0,5mg/l GA3 + 2mg/l BA 1.20 ± 0.06 1.93 ± 0.08 0.73 Chồi và lá vươn cao, có màu xanh nhạt, khoảng cách đoạn thân giữa các lá và cuống lá dài, sẹo lớn màu trắng hình thành ở gốc chồi. 1mg/l GA3 + 2mg/l BA 1.05 ± 0.05 1.87 ± 0.07 0.82 2mg/l GA3 + 2mg/l BA 1.19 ± 0.07 2.26 ± 0.14 1.07 3mg/l GA3 + 2mg/l BA 1.16 ± 0.08 2.39 ± 0.16 1.23 Trong nghiệm thức không có chất điều hòa sinh trưởng (đối chứng), chồi vẫn có sự tăng trưởng chiều cao, nhưng sự tăng trưởng chiều cao trung bình/chồi ở các nghiệm thức có BA hay BA kết hợp với GA3 đều cao hơn so với đối chứng. Ở nghiệm thức chỉ có BA, các chồi chính không chỉ tăng về chiều cao và còn sản sinh thêm chồi mới, nên chiều cao của chúng thấp hơn so với các chồi ở nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và GA3. Tăng trưởng chiều cao trung bình/chồi của các chồi trong nghiệm thức có nồng độ GA3 cao hơn thì nhiều hơn so với các chồi ở nghiệm thức có nồng độ GA3 thấp hơn. Hình 11. Tăng trưởng chiều cao trung bình của các chồi Chú thích: NT 1: 2mg/l BA; NT 2 : 0,5mg/l GA3 + 2mg/l BA; NT 3 : 1mg/l GA3 + 2mg/l BA; NT 4: 2mg/l GA3 + 2mg/l BA; NT 5: 3mg/l GA3 + 2mg/l BA Hình 12. Chồi hoàng lan ở các nghiệm thức vươn chồi khác nhau A.Đối chứng; B. 2mg/l BA; C. 0.5mg/l GA3 + 2mg/l BA; D. 1mg/l GA3 + 2mg/l BA; E. 2mg/l GA3 + 2mg/l BA; F. 3mg/l GA3 + 2mg/l BA Như vậy, chồi vươn lóng tốt ở nghiệm thức có BA kết hợp với GA3. Sự tăng trưởng chiều cao chồi tỷ lệ thuận với sự tăng dần nồng độ GA3 có trong môi trường. Ở các nghiên cứu trước đây, chồi được tăng sinh chủ yếu trong môi trường có 2mg/l BA hoặc 2mg/l BA kết hợp với 0,2mg/l NAA. 3.2.4. Kết quả tạo rễ ở chồi invitro 3.2.4.1. Hiệu quả của IBA đến ra rễ chồi invitro khi được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng Theo các nghiên cứu nuôi cấy invitro chồi hoàng lan trước đây, tái sinh rễ được tạo trên môi trường ½ WPM có 0,5mg/l IBA. Chính vì vậy, để kích thích tạo rễ ở chồi hoàng lan invitro, môi trường ½ WPM có bổ sung 0,5mg/l và 1mg/l IBA được thiết lập. Nhưng sau 9 tuần theo dõi, các chồi vẫn không ra rễ, mặc dù chồi phát triển bình thường. Như vậy, nồng độ IBA bổ sung trực tiếp vào môi trường còn ít, tác dụng kích thích chưa đủ để các chồi ra rễ. 3.2.4.2. Hiệu quả xử lý chồi invitro bằng IBA trước khi cấy lại vào môi trường dinh dưỡng Sự hình thành rễ mới xảy ra ở các chồi hoàng lan được nhúng qua các dung dịch IBA trong 10 phút, rễ mới dần xuất hiện và nhô ra từ gốc của chồi. Sau đó, các rễ này dài ra rất nhanh. Các kết quả tạo rễ ở chồi hoàng lan được trình bày ở bảng 16. Kết quả cho thấy, rễ mới chỉ hình thành trên môi trường ½ WPM. Ở môi trường này, các yếu tố dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, vitamin và đường đều giảm đi so với môi trường WPM. Sự giảm sút dinh dưỡng này tạo nên động lực thúc đẩy sự tạo rễ ở các chồi hoàng lan. Các chồi hoàng lan không được xử lý với dung dịch IBA (đối chứng) không hình thành rễ. Khi các chồi được nhúng vào dung dịch IBA ở 5ppm và 10ppm trước khi cấy vào môi trường, một số chồi có khả năng tạo rễ. Nồng độ IBA 10ppm có tỷ lệ chồi tạo rễ cao hơn so với nồng độ 5ppm. Tỷ lệ chồi tạo rễ đạt được là 40%. Bảng 16. Tỷ lệ chồi ra rễ invitro và số rễ trung bình/chồi Nghiệm thức Tỷ lệ (%)chồi ra rễ Số rễ trung bình/chồi Thời gian tạo rễ Môi trường Hóa chất WPM Đối chứng 0 - - 5ppm IBA 0 - - 10ppm IBA 0 - - 1/2 WPM Đối chứng 0 - - 5ppm IBA 15.17 ± 1.54 1 3 tuần 10ppm IBA 40 ± 2.48 1.2 ± 0.17 2 tuần Như vậy, chồi hoàng lan invitro được nhúng trong dung dịch 10ppm IBA, cho kết quả tạo rễ cao nhất sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường ½ WPM. Ở các nghiên cứu nuôi cấy invitro hoàng lan trước có hiệu quả kinh tế hơn, chồi tạo rễ khi được nuôi cấy trên môi trường ½ WPM có 0,5mg/l IBA, tuy nhiên, thời gian ra rễ và tỷ lệ chồi tạo rễ chưa được đề cập rõ. 3.3. Sinh trưởng của cây hoàng lan trồng ở thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước 3.3.1. Một số đặc điểm sinh thái ở nơi trồng cây hoàng lan 3.3.1.1. Thành phần lý hóa của đất Các lô thí nghiệm trồng hoàng lan được bố trí ở cùng 1 nơi, do đó, diều kiện sinh thái của các lô này sai khác rất ít. Thành phần cơ giới và hóa học của đất trồng cây hoàng lan ở thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước được trình bày ở bảng 17. Bảng 17. Thành phần cơ giới và hóa học của đất trồng cây ở thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước Tầng đất (cm) pH Mùn N P2O5 K2O Dễ tiêu (mg/kg)