Luận văn Thu nhận khuôn ngoại bào in vitro ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và trị liệu

MỤC LỤC

Trang phụbìa Trang

Lời cảm ơn

Mục lục . i

Danh mục từviết tắt .v

Danh mục bảng . vi

Danh mục hình . vii

Danh mục đồthị. viii

ĐẶT VẤN ĐỀ. 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU. 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Định nghĩa và thành phần ECM.3

1.1.1. Định nghĩa ECM.3

1.1.2.Thành phần ECM.4

a. Nhóm protein cấu trúc.4

b. Phức hợp protein - polysacharide .6

c. Nhóm protein bám dính . 6

d. Nhân tốtăng trưởng .7

1.2. Quy trình thu nhận ECM.8

1.2.1. Các phương pháp loại tếbào .8

a. Phương pháp vật lí .8

b. Phương pháp hóa học.9

c. Phương pháp enzyme .11

d. Chất ức chếprotease .12

1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn mô đến quá trình loại tếbào .12

1.2.3. Kiểm tra sựloại bỏtếbào.12

1.2.4. Loại bỏcác hóa chất dưtrên ECM .13

1.3. Một số đặc tính sinh học của ECM .13

1.3.1. Đặc tính tựphân hủy .13

1.3.2. Đặc tính kháng khuẩn .14

1.3.3. Đặc tính hóa hướng động .14

1.3.4. Đặc tính tạo mạch .15

1.4. Một sốsản phẩm ECM thương mại và ứng dụng .15

1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu .17

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thếgiới .17

1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .19

Chương 2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

2.1.Vật liệu – phương pháp .20

2.1.1. Dụng cụ- thiết bị.20

2.1.2. Hóa chất.21

2.2. Phương pháp nghiên cứu.24

2.2.1. Nguồn mẫu .24

2.2.2 .Đối tượng nghiên cứu .25

2.2.3. Phương pháp thu nhận ECM .25

a. Thu nhận và nuôi cấy nguyên bào sợi. 25

b. Nuôi cấy và tăng sinh nguyên bào sợi . 26

c. Đánh giá nguyên bào sợi .26

d. Kích thích nguyên bào sợi tổng hợp protein tạo ECM . 27

e. Phá tếbào thu nhận ECM . 27

2.2.4.Phương pháp đánh giá sựbám dính nhanh và tạo cụm .28

a. Phân lập và nuôi nhân tếbào sừng từmô da . 28

b. Đánh giá sựbám dính nhanh của tếbào trên ECM . 29

c. Đánh giá sựtạo cụm tếbào trên ECM . 29

2.2.5. Phương pháp khảo sát sựphục hồi tổn thương da chuột của ECM .29

a. Xửlí màng ối thu nhận vật mang và tạo đĩa phủvật mang . 30

b. Tạo ECM trên vật mang . 31

c. Khảo sát sựphục hồi tổn thương da chuột .31

2.3. Sơ đồbốtrí thí nghiệm.32

2.4. Xửlí sốliệu .33

Chương 3. KẾT QUẢ- BIỆN LUẬN

3.1. Kết quảthu nhận ECM .34

3.1.1. Kết quảthu nhận, nuôi cấy tăng sinh và đánh giá nguyên bào sợi thu

nhận từmô da . 34

3.1.2. Kết quảkích thích nguyên bào sợi tổng hợp ECM.36

3.1.3. Kết quảxửlí thu nhận ECM .38

3.2. Kết quả đánh giá ECM .42

3.2.1. Kết quả đánh giá thành phần ECM .42

3.2.2. Kết quả đánh giá sựbám dính của tếbào trên ECM.44

a. Kết quả đánh giá sựbám dính nhanh của tếbào sừng trên ECM . 44

b. Kết quả đánh giá sựbám dính nhanh của nguyên bào sợi . 47

3.2.3. Kết quảsựtạo cụm tếbào của tếbào trên ECM .49

3.3. Kết quả đánh giá khảnăng của ECM lên sựphục hồi.52

3.3.1. Kết quảthu nhận vật mang từmàng ối.52

3.3.2. Kết quảthu nhận ECM trên vật mang .54

3.3.3. Đánh giá sựphục hồi tổn thương bỏng da chuột .54

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ . 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 59

 

pdf17 trang | Chia sẻ: maiphuongdc | Ngày: 25/12/2013 | Lượt xem: 1279 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Thu nhận khuôn ngoại bào in vitro ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và trị liệu, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
sát bình thường, (b) sợi collagen chứa nhiều tơ collagen, (c) mỗi phân tử collagen là một xoắn gồm 3 chuỗi α, (d) ba chuỗi α bện vào nhau với đầu tận cùng liên kết lỏng lẻo. (Nguồn: Elastin Elastin là protein chủ yếu giữ vai trò đàn hồi và giúp liên kết định hướng các mô. Hàm lượng elastin có thể thay đổi từ 2% trọng lượng khô của da đến hơn 70% trong các dây chằng gáy của động vật ăn cỏ. Chức năng chính của elastin là tạo tính đàn hồi và độ đàn hồi cho mô. Tuy nhiên, elastin còn tăng cường sự bám dính của tế bào và elastin peptides đã được chứng minh là tạo nên tính hóa hướng động đối với tế bào. Tropoelastin là phân tử đơn vị hòa tan của elastin. Tuy nhiên do sự nối ghép các phân tử đơn vị đã tạo nên nhiều dạng elastin. Phân tử đơn vị được tạo ra và tiết vào không gian ngoại bào, kết hợp với các thành phần vi sợi tạo thành sợi elastin. 6 Các phân tử polypeptide của elastin được liên kết với nhau bằng liên kêt kị nước, lặp đi lặp lại. Các liên kết giữa lysine là các liên kết cộng hóa trị giúp ổn định cấu trúc sợi đàn hồi của elastin [9]. b. Phức hợp protein - polysaccharide Proteoglycan Proteoglycan gồm nhiều phân tử glycosaminoglycan (GAGs) liên kết với lõi protein. Glycosaminoglycan phụ thuộc vào dạng mô, tuổi của cơ thể và môi trường thu nhận ECM. Các phân tử GAGs bám vào các nhân tố tăng trưởng, các cytokines, thúc đẩy quá trình giữ nước và tạo nên đặc tính gel cho ECM. Nhờ đặc tính bám dính của heparin trên nhiều thụ thể bề mặt tế bào và trên các nhân tố tăng trưởng đã tạo nên phân tử heparin giàu glycosaminoglycan – là thành phần quan trọng trong ECM giúp tế bào tăng trưởng. Các phân tử GAGs hiện diện trong ECM gồm có chondroitin sulfates, heparin, heparan sulfate, và hyaluronic acid [9], [32], [40]. c. Nhóm protein bám dính Fibronectin Fibronectin là thành phần chiếm tỉ lệ cao đứng thứ 2 sau collagen trong ECM. Fibronectin tồn tại ở dạng hòa tan, dạng sợi và là thụ thể bám dính của nhiều loại tế bào [49], [50], [61], [62]. Đặc trưng của fibronectin là tạo ra lớp chất nền giúp tế bào bám dính khi nuôi cấy in vitro. Chúng thường được sử dụng như vật liệu bao phủ các giàn giáo sinh học để tăng cường tính tương hợp sinh học với cơ thể chủ. Fibronectin là phân tử giàu Arg-Gly-Asp, bộ 3 peptide này có vai trò quan trọng trong sự bám dính của tế bào [74]. Laminin Laminin là một protein bám dính được tìm thấy trên màng nền của ECM . Cấu trúc của laminin gồm ba chuỗi polypeptide liên kết với nhau. Laminin tương tác rộng rãi với ECM như là một giàn giáo để tái tạo cấu trúc mô. Mạch β1 integrin 7 có ảnh hưởng gián tiếp đến tế bào gốc tạo máu khi tương tác với fibronectin và laminin. Khi sử dụng ECM như một giàn giáo để tái tạo mô và cơ quan ở người trưởng thành thì không thấy rõ vai trò của laminin, nhưng nó có vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học phát triển, đó là các phân tử thiết yếu cần cho sự tự tập hợp các quần thể tế bào để hình thành mô và chống lại sự tạo thành mô sẹo [51], [61], [70]. Integrin Intergin là các thụ thể trên bề mặt tế bào mà gắn trên ECM. Fibronectin, laminin và các thành phần khác của ECM gắn trên các thụ thể của phân tử glycoproteins trên bề mặt tế bào được gọi là integrin. Integrin giúp hợp nhất xương tế bào và ECM [19], [54]. CAMs CAMs là các phân tử protein xuyên màng, có vai trò trong sự bám dính trực tiếp hay gián tiếp giữa tế bào và tế bào, giữa tế bào và ECM. Những tương tác này giúp gắn tế bào vào mô và thúc đẩy sự liên lạc giữa các tế bào với môi trường xung quanh [17], [64]. d. Nhân tố tăng trưởng Trên ECM có nhiều nhân tố tăng trưởng, bao gồm cả các nhân tố tăng trưởng tế bào nội mô (VEGF), họ nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF), nhân tố tăng trưởng thu nhận từ các tế bào đệm (SDF-1), nhân tố tăng trưởng tế bào biểu mô (EGF), nhân tố tăng trưởng biến đổi β (TGF- β), nhân tố tăng trưởng tế bào sừng (KGF), nhân tố tăng trưởng tế bào gan (HGF), nhân tố tăng trưởng phân lập từ tiểu cầu (PDGF) và protein tạo hình xương. Các nhân tố tăng trưởng này là các phân tử sinh học hoạt động. Khi sử dụng ECM ở trạng thái tự nhiên làm giàn giáo giúp tế bào tăng trưởng và biệt hóa, có thuận lợi về sự hiện diện của tất cả các nhân tố tăng trưởng giống như trong mô tự nhiên [18], [32], [45], [56]. 8 1.2. Quy trình thu nhận ECM ECM có thể được thu nhận từ rất nhiều mô như van tim, mạch máu, da, thần kinh, cơ xương, gân, dây chằng, mô liên kết ruột non (SIS), bàng quang và gan. Để thu được ECM tự nhiên đòi hỏi loại hết các tế bào trong mô, cơ quan. Mục đích của quá trình này nhằm làm giảm phản ứng viêm hoặc đáp ứng miễn dịch, đồng thời giảm thiểu các tác động bất lợi lên thành phần, hoạt tính sinh học và đặc tính cơ học của ECM được thu nhận [12], [13], [22], [30], [38], [48], [60], [63], [66]. Từ một mô tự nhiên, để thu được ECM đòi hỏi phải có sự kết hợp của các phương pháp vật lí, hóa học và enzyme để loại hết thành phần tế bào. Tiếp theo sự loại bỏ tế bào, ECM được tiệt trùng trước khi sử dụng như giàn giáo sinh học. Hai phương pháp tiệt trùng phổ biến là chiếu xạ (tia gamma) và khí ethelyne oxide [33]. 1.2.1. Các phương pháp loại tế bào Để quá trình loại tế bào khỏi mô đạt hiệu quả cao, phải có sự kết hợp các phương pháp vật lí, hóa học và enzyme. Nhìn chung, một quy trình loại tế bào thường trải qua nhiều giai đoạn. Đầu tiên là li giải màng tế bào, bước tiếp theo là xử lí bằng enzym để tách các thành phần tế bào khỏi mô và cuối cùng là loại bỏ các mảnh vụn tế bào [35]. a. Phương pháp vật lí Phương pháp vật lí thường sử dụng để loại tế bào khỏi mô bao gồm làm lạnh, loại tế bào bằng áp suất và lắc. Phương pháp làm lạnh nhanh thường sử dụng để loại bỏ tế bào của mô gân, dây chằng và mô thần kinh. Mô được lạnh nhanh, trong mô sẽ hình thành tinh thể đá nội bào và chúng sẽ phá vỡ màng tế bào và li giải tế bào. Do vậy phải kiểm soát cẩn thận tốc độ thay đổi nhiệt độ để ngăn cản các tinh thể đá phá vỡ ECM [43], [72]. Ngoài ra tế bào có thể được li giải bằng cách tạo áp lực trực tiếp lên mô, nhưng phương pháp này chỉ có hiệu quả đối với các mô, cơ quan mà ECM không dầy đặc. Các lực cơ học có thể được sử dụng để tách lớp các mô, cơ quan có cấu 9 trúc mô tự nhiên gồm nhiều lớp như ruột non, bàng quang. Phương pháp này có hiệu quả và ít gây tổn hại đến cấu trúc 3 chiều của ECM. Biện pháp cơ học thường được sử dụng kết hợp với phương pháp hóa học để phá vỡ tế bào và loại các thành phần tế bào ra khỏi ECM. Ngoài ra có thể kết hợp các tác động cơ học cùng với sóng âm để phá vỡ tế bào. Chưa có nghiên cứu nào xác định cường độ hoặc tần số tối ưu của sóng âm để phá vỡ tế bào, nhưng mỗi dạng sóng cụ thể đều có tác động lên sự loại bỏ các thành phần tế bào [69]. b. Phương pháp hóa học Dung dịch kiềm và acid Kiềm và acid thường được sử dụng để hòa tan tế bào chất cũng như để loại bỏ acid nucleic. Acetic acid, peracetic acid (PAA), hydrochloric acid, sulfuric acid và ammonium hydroxide (NH4OH) có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng của các bào quan nội bào. PAA được sử dụng ở nồng độ 0,10 – 0,15% trọng lượng/thể tích để thu ECM của mô ruột non và bàng quang lợn. PAA đã được chứng minh là không gây tác động có hại lên đặc tính cơ học của ECM. Mô sau khi được xử lí bằng PAA, ECM của mô vẫn duy trì được cấu trúc và chức năng của các nhân tố tăng trưởng hiện diện trong mô trước đó. Cả SIS và UBM (ECM bàng quang lợn) đã được chứng minh là chất nền tuyệt vời trong nuôi cấy tế bào in vitro và đã ứng dụng thành công in vivo [11], [14], [39], [41], [53]. Chất tẩy không ion Chất tẩy không ion cũng thường được sử dụng trong các quy trình loại tế bào khỏi mô. Các chất này phá vỡ liên kết giữa lipid – lipid, lipid – protein và giữ nguyên liên kết protein – protein. Do vậy, sau khi xử lí mô bằng các chất tẩy này, protein trong mô vẫn giữ nguyên chức năng. Triton X-100 là chất tẩy không chứa ion được sử dụng rộng rãi để loại bỏ tế bào. Sự tiếp xúc giữa mô và Triton X-100 có thể biến thiên từ vài giờ đến 14 ngày. Sau 24 giờ xử lí mô van tim bằng Triton X- 100 đã loại bỏ hoàn toàn tế bào mà vẫn duy trì cấu trúc của van tim. Đối với các 10 thành phần ECM, Triton X-100 làm mất gần như hoàn toàn GAGs và làm giảm hàm lượng laminin và fibronectin trong mô van tim [27], [60]. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy Triton X-100 không có hiệu quả hoàn toàn trong việc loại tế bào khỏi mạch máu, gân, dây chằng sau khi tiếp xúc với các mô này lên đến 4 ngày. Gân khi được xử lí bằng Triton X-100 đã làm thay đổi sự căng của các sợi collagen. Ngược lại, dây chằng khi xử lí bằng Triton X-100 đã không ảnh hưởng đến sợi collagen. Mặc dù Triton X-100 là một hóa chất được sử dụng nhiều để loại tế bào, nhưng hiệu quả của nó phụ thuộc vào mô được loại tế bào và phụ thuộc vào các phương pháp kết hợp khác để loại bỏ tế bào [21], [70]. Chất tẩy có ion Chất tẩy có ion có tác dụng hòa tan màng tế bào nhân và màng tế bào chất. Chúng làm biến tính protein vì phá vỡ liên kết protein-protein. Hầu hết các chất tẩy ion thường sử dụng là sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium deoxycholate và Triton X-200. SDS rất có hiệu quả trong việc loại bỏ các thành phần tế bào khỏi mô. Chất này có xu hướng phá vỡ cấu trúc mô tự nhiên, làm giảm nồng độ GAGs nhưng không làm mất tính nguyên vẹn của collagen. Sodium deoxycholate cũng có hiệu quả trong việc loại bỏ các thành phần tế bào nhưng chúng có xu hướng phá vỡ cấu trúc mô tự nhiên nhiều hơn so với SDS. Chúng thường được sử dụng kết hợp với các chất tẩy zwitterionic để loại tế bào trong mô thần kinh. Tuy nhiên, chỉ có sự kết hợp của Triton X-200 với chất tẩy zwitterionic cho hiệu quả loại tế bào hoàn toàn trong mô thần kinh [44] Tri (n-butyl) phosphate Tri (n-butyl) phosphate (TBP) là một dung môi hữu cơ. Chúng thường được sử dụng để bất hoạt virus trong máu mà không gây ảnh hưởng đến hoạt động của các nhân tố đông máu. Gần đây, TBP được sử dụng như là tác nhân hỗ trợ để loại bỏ tế bào trong mô gân và dây chằng. Xử lí bằng TBP đã loại bỏ hoàn toàn các tế bào trong mô gân đuôi chuột mà không ảnh hưởng đến sức căng của sợi collagens. 11 TBP hứa hẹn là một tác nhân phá tế bào ít gây ảnh hưởng đến đặc tính cơ học của ECM và đang được nghiên cứu sâu hơn [43]. Xử lí nhược trương và ưu trương Phương pháp tạo sốc thẩm thấu bằng dung dịch nhược trương hoặc dung dịch ưu trương thường được sử dụng để phá tế bào trong mô và cơ quan. Khi xử lí mô trong dung dịch nhược trương (10mM Trizma HCl, 5mM EDTA) trong 11 giờ. Sau đó xử lí bằng dung dịch ưu trương (50mM TrizmaHCl, 1M NaCl, 10mM EDTA) trong 11 giờ có thể phá vỡ tế bào, nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các thành phần tế bào khỏi mô. Do vậy khi xử lí mô bằng phương pháp này thường phải kết hợp với các phương pháp dùng enzyme hoặc hóa chất để loại bỏ hoàn toàn các mảnh vụn tế bào. Loại bỏ các mảnh DNA khỏi mô là một khó khăn, bởi vì DNA có xu hướng bám lên các protein trên ECM [29], [72]. Tác nhân Chelat Các tác nhân Chelat như EDTA và EGTA, là phân tử dạng vòng phức tạp có một ion kim loại liên kết chặt ở trung tâm. Như đã biết, các ion Ca2+ và Mg2+ thì cần thiết giúp tế bào bám lên collagen và fibronectin tại các thụ thể Arg–Gly–Asp. Sự ràng buộc bởi các ion này hiện diện trên các tế bào bám dính trên ECM đã tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình loại bỏ tế bào khỏi mô. EDTA thường được sử dụng kết hợp với trypsin [36]. c. Phương pháp enzyme Phương pháp sử dụng enzyme để loại tế bào bao gồm sử dụng các enzyme phân hủy protein, tác nhân chelating Ca và enzyme phân hủy nhân tế bào. Trypsin là enzyme phân hủy protein phổ biến được sử dụng để phá tế bào. Chúng bẻ gãy các cầu nối cacbon trên arginine và lysine. Khi đã phá vỡ hết các liên kết này thì sẽ phá các liên kết carbon trên proline. Enzyme thường sử dụng để thủy phân nhân tế bào là endonucleases và exonucleases. Endonucleases thủy phân các cầu nối bên trong chuỗi DNA hoặc RNA. Exonucleases thủy phân các liên kết ở đầu cuối cùng của DNA hoặc RNA. Kết quả cuối cùng là phân hủy DNA hoặc RNA [36] 12 d. Chất ức chế protease Trong quá trình phá tế bào, một số enzyme phân hủy protein được giải phóng ra khi tế bào bị vỡ. Trong suốt thời gian xử lí mẫu với các tác nhân hóa học, sự hiện diện của các enzyme này có thể làm tổn hại các cấu trúc tự nhiên của ECM. Do vậy, nên bổ sung vào dung dịch phá tế bào các chất ức chế protease như aprotonin và leupeptin. Dung dịch đệm pH 7 - 8 cũng có thể ức chế nhiều protease [36] 1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn mô đến quá trình loại tế bào Hiệu quả của quá trình hoặc phương pháp loại tế bào khỏi mô phụ thuộc vào nguồn mô sử dụng. Grauss và cộng sự (2003) đã chứng minh sử dụng một mình trypsin để loại tế bào van động mạch chủ tim lợn thì không hiệu quả. Trong khi đó, Schenke - Layland và cộng sự (2003) lại loại bỏ hoàn toàn các thành phần tế bào của van động mạch phổi heo. Cartmell và Dunn (2000), Woods và Gratzer (2005) nghiên cứu độc lập cách phá tế bào trên gân đuôi chuột và ACL heo đã thấy kết quả loại tế bào khác nhau. Các nghiên cứu trên cho thấy hiệu quả loại tế bào phụ thuộc vào nguồn mô, thành phần của mô, mật độ tế bào và các nhân tố khác. Đối với mỗi mô sử dụng để loại tế bào đều được phải được nghiên cứu kỹ, điều này rất cần thiết để tối ưu hóa quy trình phá tế bào mà không ảnh hưởng đến ECM thu nhận được [21], [35], [59], [72]. 1.2.3. Kiểm tra sự loại bỏ tế bào Một số phương pháp nhuộm mô học thường được sử dụng để kiểm tra hiệu quả của việc loại tế bào khỏi mô. Phương pháp nhuộm mô bằng Hematoxylin - Eosin là phương pháp kiểm tra đầu tiên để xác định cấu trúc nhân và có thể quan sát bằng mắt thường. Một trong các phương pháp nhuộm mô như Masson’s Trichome, Movat’s Pentachrome hoặc Safrin O thường được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của các thành phần tế bào chất và các phân tử ngoại bào khác nhau. Collagen khi nhuộm PAS hoặc nhuộm Masson’s Trichome sẽ bắt màu hồng hoặc xanh tương ứng với mỗi loại thuốc nhuộm. Phương pháp hóa mô miễn dịch cũng được sử dụng để xác định các protein nội bào như actin và vimentin [72]. 13 Kiểm tra sự hiện diện của DNA có thể thực hiện bằng cách nhuộm Hoechst, trong đó phân tử huỳnh quang bám vào các nucleotide A, T trên các rãnh nhỏ của phân tử DNA. Ngoài ra, propidium iodide và PicoGreen cũng được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của DNA trong mẫu. Ngoài việc xác định các thành phần đã loại bỏ, việc xác định các thành phần còn lại của ECM cũng rất cần thiết. Các protein có vai trò bám dính như fibronectin, laminin, GAGs, các nhân tố tăng trưởng, sợi elastic và collagens đều rất cần thiết để tế bào bám lên ECM trong in vitro hoặc in vivo [35]. 1.2.4. Loại bỏ các hóa chất dư trên ECM Các phương pháp loại tế bào hầu hết đều sử dụng hóa chất có thể gây tổn hại đến tế bào. Nếu hóa chất sử dụng vẫn còn lại trong ECM với nồng độ cao sau khi đã xử lí, chúng có thể gây độc đối với cơ thể chủ khi ECM được cấy ghép in vivo. Do vậy việc định lượng các hóa chất còn dư trong ECM là rất cần thiết. Tóm lại, để hoàn thành quá trình loại tế bào của hầu hết các mô thì đòi hỏi phải có sự kết hợp của các phương pháp vật lí, enzym và hóa học. Ngoài ra quy trình xử lí mô còn phụ thuộc vào nguồn mô quan tâm. Nhìn chung mọi qui trình đều mong muốn sử dụng lực tác động nhẹ nhất để loại hết tế bào khỏi mô mà không phá vỡ thành phần cấu trúc và chức năng của ECM. 1.3. Một số đặc tính sinh học của ECM Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy vai trò quan trọng của sự tự phân hủy ECM trong quá trình phục hồi tổn thương. Sự tự phân hủy của ECM là nhân tố tác động sớm nhất đến quá trình phục hồi tổn thương của mô. Ngoài ra sự tự phân hủy của ECM cũng tạo thành các chuỗi peptide kháng vi sinh, chất hóa hướng động và sự tạo mạch [20], [58]. 1.3.1. Đặc tính tự phân hủy ECM có khả năng tự phân hủy nhanh sau khi cấy ghép vào mô chủ. Chúng sẽ được thay thế từ từ thông qua các liên kết hóa học chéo. Sự thay thế này làm quá 14 trình tự phân hủy diễn ra từ từ. Nghiên cứu sử dụng 14C gắn với SIS - ECM để theo dõi sự tự phân hủy của ECM khi điều trị tổn thương thành bàng quang. Phóng xạ 14C được phát hiện trong máu và trong bàng quang ngay sau khi có sự sửa chữa bàng quang hay khi ECM bắt đầu phân hủy. SIS - ECM sẽ tự phân hủy khoảng 40 - 60% trên tổng số ECM được ghép tại vị trí cần tái tạo mô trong vòng 4 tuần. Sau 90 ngày ghép, 14C đã không còn trong bàng quang [53]. 1.3.2. Đặc tính kháng khuẩn Trong tự nhiên có nhiều phân tử peptide kháng khuẩn tồn tại phổ biến rộng trong giới động thực vật. Sarikaya và cộng sự đã chứng minh thành phần của ECM thu nhận từ mô liên kết ruột non (SIS) và niêm mạc bàng quang (UBM) lợn có hoạt tính kháng đối với vi khuẩn gram dương và gram âm. Để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn này, SIS và UBM lợn được thu nhận và phân tủy bằng cách sử dụng acid loãng ở nhiệt độ. Sản phẩm của sự phân hủy này đưa vào môi trường nuôi cấy E. coli hoặc S. aureus để kiểm tra sự tăng trưởng của chúng sau 24 giờ. Nhận thấy sản phẩm phân hủy của SIS và UBM đều chống lại sự tăng trưởng của E. coli và S. aureus trong 24 giờ [58]. 1.3.3. Đặc tính hóa hướng động Sự tự phân hủy của ECM cũng tạo ra các phân tử peptide có hoạt tính hóa hướng động. Các phân tử peptide này được thu nhận từ SIS – ECM, có trọng lượng khoảng 5 – 16 kDa. Chúng được chứng minh có tính hóa hướng động đối với các tế bào có nguồn gốc từ tế bào nội mô tim, gan và thận chuột. Thêm vào đó, các thử nghiệm in vivo cho thấy việc cấy ghép giàn giáo SIS –ECM và UBM – ECM có bổ sung tế bào tủy xương đã thúc đẩy các tế bào này di cư vào trong vị trí của mô đang được phục hồi và tham gia vào quá trình phục hồi mô. Các nghiên này đã chứng minh sự tự phân hủy của ECM tạo ra các phân tử peptide có trọng lượng phân tử thấp. Các phân tử này có khả năng kích thích tập trung các tế bào nội mô cả in vitro và in vivo [15], [74], [75]. 15 1.3.4. Đặc tính tạo mạch Ngoài các đặc tính kháng khuẩn và tính hóa hướng động, các sản phẩm phân hủy của ECM cũng thể hiện đặc tính tạo mạch. Li và cs đã tiến hành thí nghiệm kiểm tra đặc tính tạo mạch của sản phẩm phân hủy SIS – ECM. Nhóm nghiên cứu trộn các nồng độ khác nhau của sản phẩm này cùng matrigel và heparin, sau đó tiêm dưới da chuột. Hỗn hợp PBS và matrigel được sử dụng làm là đối chứng âm. Chuột bị giết sau 7 ngày tiêm và xác định hàm lượng matrigel trong máu. Kết quả cho thấy khi tiêm các sản phẩm phân hủy của SIS - ECM với matrigel có sự gia tăng đáng kể số lượng mạch máu tại vị trí ghép. Sự gia tăng mạch máu phụ thuộc vào nồng độ chất đưa vào. Không có mạch máu nào hiện diện tại mô ghép khi tiêm dung dịch PBS. Vì thế nhóm nghiên cứu cho rằng khi có mặt các sản phẩm phân hủy ECM có thể cảm ứng sự tạo mạch [47]. Tóm lại, mong muốn khi sử dụng ECM để tái tạo mô là mô phục hồi gần giống với mô khỏe mạnh về cấu trúc và chức năng. 1.4. Một số sản phẩm ECM thương mại và ứng dụng Một số ECM có nguồn gốc tự nhiên hoặc ECM có liên quan đến quá trình loại tế bào đã chấp nhận ứng dụng trên người như ECM trung bì da người (Alloderms, LifeCell, Corp), SIS lợn (SurgiSISs, Cook Biotech, Inc; Restores, DePuy Orthopaedics, Inc), bàng quang lợn (ACell, Inc), và van tim lợn (Synergrafts, CryoLife, Inc). Việc tạo ra nhiều ECM tự nhiên ứng dụng trong kỹ thuật mô và y học tái tạo đã đẩy mạnh sự phát triển các quy trình loại tế bào nhẳm tìm ra phương pháp áp dụng lâm sàng thích hợp [10], [35]. Các ECM thương mại có chất liệu là thành phần của ECM tự nhiên hiện đang được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của công nghệ mô. Chúng được ứng dụng để chữa các tổn thương ngoài da như loét mãn tính, vết loét không lành do tiểu đường. Ngoài ra chúng còn được sử dụng trong tái tạo cấu trúc đường niệu, ứng dụng trong dạ dày- thực quản, sửa chữa mô mềm, tái tạo cấu trúc mô cơ-gân. Hiện tại, lĩnh vực y học cũng đang mở rộng các ứng dụng sử dụng ECM. 16 Hình 1.4. Khuôn ngoại bào thu nhận từ bàng quang lợn [66] Đây là một vài các sản phẩm ECM tự nhiên đã được thương mại. Sản phẩm The Restore™ là ECM của lớp mô liên kết ruột non lợn, được sử dụng để thay thế các khiểm khuyết thuộc về cơ - gân. Cuff Patch™ cũng là sản phẩm được tạo ra từ lớp mô liên kết ruột non lợn. Nhưng khác với Restore™, nó có tạo các liên kết hóa học với carbodiimide. GraftJacketR là một dạng sản phẩm có liên kết hóa học chéo của ECM trung bì để sửa chữa các mô mềm, dẻo. TissueMendR là một ECM thu nhận từ da thai bò và Permacol™ là ECM thu từ trung bì da lợn, cả hai sản phẩm này thương mại này được sử dụng để tái tạo các cấu trúc cơ – gân. Mỗi sản phẩm ECM được đề cập bên trên cũng tương tự như như ECM tự nhiên. Tuy nhiên các đáp ứng của vật chủ đối với các ECM khác nhau rõ rệt vì các phương pháp thu nhận khác nhau [71]. Ngoài ra, trên thị trường còn nhiều sản phẩm ECM nguyên vẹn được ứng dụng trong phục hồi tổn thương mô được tóm tắt trong bảng 1 (phụ lục). Việc sử dụng ECM tự nhiên vào trong công nghệ mô đã thu được hiệu quả cao hơn khi sử dụng ECM được tạo ra từ vật liệu tổng hợp như polylactic coglycolic acid (PLGA), collagen tinh sạch, hoặc các chất nền nhân tạo khác. Khả năng tạo một ECM in vitro tùy thuộc vào ứng dụng cụ thể của giàn giáo ECM. Một trong những phương pháp tạo ECM in vitro là loại bỏ các nghi ngờ về bệnh truyền 17 nhiễm từ động vật sang người. Tuy còn nhiều vấn đề cần xem xét, nhưng ECM tự nhiên vẫn được ứng dụng thành công nhất trong công nghệ mô [10]. 1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu ECM 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1998, Hynda K. Kleinman đã tạo ra màng nền có tên gọi là matrigel. Màng này có tác dụng kích thích sự tăng sinh và biệt hoá của tế bào biểu mô, tế bào nội mô thành mạch và các tế bào thần kinh. Theo nghiên cứu này, hầu hết các tế bào biểu mô và tế bào nội mô đều tạo được màng nền. Màng này được sử dụng cho các phân tích sinh học và nghiên cứu sự tập hợp các protein khuôn ngoại bào (ECM) [46]. Cùng với công trình nghiên cứu trên, nhóm của Hynda K. Kleinman đã mô tả cách sử dụng collagen dạng I như là giá thể nuôi cấy tế bào. Ngoài ra, họ còn tiến hành điều khiển và thao tác màng cơ bản để tạo ra các Matrigel. Collagen dạng I có vai trò kích thích tế bào tăng sinh và biệt hoá. Matrigel giữ cho hầu hết các tế bào không tăng sinh và không kích thích biệt hoá nhiều loại tế bào biểu mô và nội mô trong điều kiện in vitro. Matrigel cũng được sử dụng in vivo để tạo mạch, tăng sự phát triển của khối u và kích thích sự sống sót của các tế bào cấy ghép. Năm 1999, Israel Vlodavsky tiến hành tạo ECM từ tế bào nội mô giác mạc bò (BCE-ECM) và tế bào nội bì PF-HR9 chuột. Nghiên cứu này đã chứng minh hoạt động của tế bào được điều hòa bởi giá thể mà tế bào bám lên, di cư và tăng sinh. Do vậy, bề mặt nuôi cấy khi được phủ bằng ECM sẽ tạo ra sự tập trung các tế bào mạnh hơn và kích thích các tế bào này bám, tăng sinh, biểu hiện chức năng chuyên biệt. Các tác giả nhận thấy BCE-ECM giống với ECM của lớp phụ nội mô in vivo. Trong khi ECM từ tế bào PF-HR9 giống với thành phần màng nền của các tế bào biểu mô khác trong điều kiện in vivo. Tế bào sử dụng trong nghiên cứu được kích thích để tạo ECM. Chúng sẽ được nuôi cấy cho đến khi hợp dòng. Sau đó những thành phần tế bào sẽ được loại đi, bằng cách xử lí với Triton X-100 và NH4OH để thu nhận ECM nguyên [69]. 18 Năm 1999, Steven K. Akiyama và cs đã tiến hành tinh sạch fibronectin từ huyết tương người, vì đây là nguồn dồi dào fibronectin. Chất này giúp tế bào nuôi cấy bám dính, di cư và phát triển. Cũng trong năm này, tác giả đã tinh sạch thành công vitronectin từ huyết tương và huyết thanh của nhiều loài động vật. Theo như công trình, sử dụng 400ml huyết tương được chống đông bằng citrate, sẽ tạo ra 10 đến 20mg vitronectin với độ tinh sạch là 98%. Các thể tích tương tự của huyết tương những loài khác cũng được sử dụng [7]. Năm 2000, Anne Woods và John R. Couchman đã phân tách riêng proteoglycans, glycosaminoglycans. Chúng là những phân tử khó phân tách riêng vì kích thước lớn, độ âm điện cao. Proteoglycans có kích thước rất khác nhau từ nhỏ (Decorin trọng lượng khoảng 100 kDa) đến rất lớn (Aggrecan trọng lượng khoảng 1x106 kDa). Proteoglycans hiện diện trong ECM, chúng gắn với bề mặt tế bào qua phospholipid hay thành phần xuyên qua màng và trong những hạt nội bào nhỏ[71]. Năm 2002, Edna Cukirman đã phát triển kỹ thuật thu nhận ECM từ nguyên bào sợi nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu được tiến hành song song với việc so sánh ECM 2 chiều và ECM 3 chiều thu nhận được. Kết quả cho thấy ECM 3 chiều kích thích tế bào bám dính, tăng sinh nhiều hơn ECM 2 chiều và bề mặt nuôi cấy không ECM. Để làm được điều này, nguyên bào sợi được nuôi cấy với mật độ cao s

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf5_2.pdf
  • pdf0_2.pdf
  • pdf1_2.pdf
  • pdf2_2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf6_4.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
  • pdf10_3.pdf
Tài liệu liên quan