Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phát triển phương pháp Chemometric để xác định đồng thời các chất có phổ hấp thụ phân tử xen phủ nhau và áp dụng trong phân tích dược phẩm

ng pháp chemometric-trắc quang khác (phương pháp bình phương tối thiểu dùng phổ toàn phần và phương pháp phổ đạo hàm) khi phân tích mẫu chuẩn phòng thí nghiệm (chứa 2 hoặc 3 chất phân tích). 4. Xây dựng quy trình phân tích theo phương pháp chemometric-trắc quang sử dụng thuật toán lọc Kalman (tính toán bằng chương trình phần mềm đã xây dựng được). 5 5. Áp dụng quy trình phân tích xây dựng được vào thực tế - phân tích các mẫu dược phẩm đa thành phần (chứa 2 hoặc 3 thành phần) đang lưu hành ở thị trường Việt Nam. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp lọc Kalman và chương trình tính i) Ghi phổ của dung dịch đơn chất phân tích (dung dịch chuẩn phòng thí nghiệm) và dung dịch hỗn hợp các chất phân tích, thu được bộ dữ liệu phổ (độ hấp thụ quang ở k bước sóng lựa chọn) ở dạng file có đuôi txt (số bước sóng lựa chọn tùy thuộc vào đặc điểm của các cấu tử trong hệ nghiên cứu); ii) Nhập file dữ liệu phổ đơn chất và hỗn hợp chất vào chương trình phần mềm máy tính (lập trình trên phần mềm Microsoft-Excel 2016) để tính các giá trị ε (hệ số hấp thụ phân tử) của các đơn chất; iii) Chạy bộ lọc Kalman: - Đưa ra giá trị khởi tạo ban đầu, gồm: ước lượng đầu tiên của trạng thái nồng độ Cest(0) và hiệp phương sai của sai số Pest(0) (nội dung nghiên cứu (1) sẽ đưa ra giá trị khởi tạo ban đầu); - Ngoại suy dự báo trạng thái nồng độ: ( ) ( 1)C Cpri k est k= − (2.1) - Ngoại suy hiệp phương sai của sai số: ( ) ( 1)P Ppri k est k= − (2.2) - Tính toán Lợi Kalman: ( ) 1 ( ) ( ) ( ) ( ) (k) ( ) ( ) T T k pri k k k pri k kK P P Rε ε ε − = + (2.3) - Cập nhật ước lượng trạng thái nồng độ: ( )( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )est k pri k k k k pri kC C K A Cε= + − (2.4) - Cập nhật hiệp phương sai của sai số: ( ) ( ) ( ) ( )est k k k pri kP INV K Pε  = −   (2.5) 6 Các bước tính toán trên được thực hiện từ bước sóng thứ nhất đến bước sóng cuối cùng. Cuối cùng, chương trình tính sẽ cho ra kết quả gồm: Nồng độ mỗi cấu tử trong hệ và hiệp phương sai của sai số. Hiệp phương sai này thường bé nhất ở bước sóng cuối cùng. 2.2.2. Phương pháp bình phương tối thiểu sử dụng phần mềm simulan (BPTT) Bước 1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn riêng từng cấu tử và hỗn hợp của chúng. Bước 2: Ghi phổ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn để tính ma trận hệ số hấp thụ của các cấu tử: ε= (εij )mxn Bước 3: Ghi phổ hấp thụ quang (A) của dung dịch hỗn hợp, nhập ma trận: A = (Ai1)mx1 Bước 4: Giải hệ m phương trình n ẩn số: A= ε. C để tìm ra nồng độ C. 2.2.3. Phương pháp phổ đạo hàm (PĐH) Bước 1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn riêng từng cấu tử và hỗn hợp của chúng. Bước 2: Ghi phổ hấp thụ quang và phổ đạo hàm, tìm bước sóng đo thích hợp mà tại đó giá trị phổ đạo hàm của một chất cần phân tích khác 0 hoặc cực đại, còn giá trị phổ đạo hàm của chất kia bằng 0. Bước 3: Sau khi xác định được bước sóng đo ở một bậc đạo hàm nhất định, tiến hành định lượng các chất theo phương pháp đường chuẩn hoặc thêm chuẩn. 2.2.4. Phương pháp xây dựng chương trình máy tính Phương pháp trắc quang – chemometric dùng phổ toàn phần kết hợp thuật toán lọc Kalman được viết trên phần mềm Microsoft-Excel với ngôn ngữ lập trình Visual basic for Applications (VBA). 2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu Tính toán các đại lượng thống kê (trung bình số học, độ lệch chuẩn, RSD); so sánh hai độ lặp lại (hay hai phương sai), dùng kiểm định F (F-test); So sánh hai giá trị trung bình, dùng 7 kiểm định t (t-test); So sánh hai phương pháp, dùng kiểm định t theo cặp (paired-t-test)... CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. LỰA CHỌN GIÁ TRỊ KHỞI TẠO BAN ĐẦU 3.1.1. Lựa chọn giá trị khởi tạo ngẫu nhiên Theo cách này, chọn giá trị khởi tạo ngẫu nhiên là có thể chọn một giá trị bất kì cho nồng độ Cest(0) và phương sai Pest(0) Đối với hỗn hợp chứa 2 chất hoặc 3 chất (là hỗn hợp các chất chuẩn trong phòng thí nghiệm), trong nghiên cứu này đều lựa chọn ngẫu nhiên giá trị khởi tạo ban đầu đối với mỗi chất đều là nồng độ Cest(0) = 0,3 µg/mL và phương sai Pest(0) = 1. Bảng 3.1. Kết quả xác định nồng độ TEL và HYD trong hỗn hợp theo phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo ngẫu nhiên(*) Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 TEL Co (µg/mL) 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 C (µg/mL) 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 RE (%) -70 -85 -90 -93 -94 -95 -96 -96 -97 HYD Co (µg/mL) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 C (µg/mL) 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 RE(%) -97 -96 -96 -95 -94 -93 -90 -85 -70 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Từ bảng 3.1 cho thấy rằng với các tỉ lệ nồng độ khác nhau, giữa nồng độ dung dịch chuẩn và nồng độ xác định được mắc sai số tương đối RE% rất lớn (nằm trong khoảng 69,7 % - 96,7 %). Giá trị nồng độ xác định được ở tất cả các hỗn hợp đều bằng giá trị nồng độ khởi tạo đưa vào ban đầu (0,3 µg/mL). Bảng 3.2. Kết quả xác định nồng độ AML, HYD và VAL trong hỗn hợp theo phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo ngẫu nhiên(*) AML Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 Co (µg/mL) 0,250 0,50 1,00 5,00 C (µg/mL) 0,300 0,300 0,300 0,304 8 RE (%) 20 -40 -70 -94 HYD Co (µg/mL) 0,325 0,65 1,30 5,00 C (µg/mL) 0,307 0,304 0,302 0,299 RE (%) -6 -53 -77 -94 VAL Co (µg/mL) 4,00 8,00 16,00 5,00 C (µg/mL) 0,301 0,300 0,300 0,299 RE (%) -93 -97 -98 -94 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Từ bảng 3.2 cho thấy rằng với các tỉ lệ nồng độ khác nhau, giữa nồng độ dung dịch chuẩn và nồng độ xác định được mắc sai số RE% rất lớn (nằm trong khoảng -5,5 % - 98,1 %). Giá trị RE % bé nhất (-5,5 %) ứng với nồng độ chuẩn là 0,325 (gần với nồng độ khởi tạo x = 0,3). Nồng độ chuẩn càng xa giá trị khởi tạo thì RE % càng lớn. Như vậy, với các kết quả kiểm chứng ở bảng 3.1 và bảng 3.2, có thể nhận thấy rằng phương pháp khởi tạo theo cách chọn giá trị nồng độ và phương sai ngẫu nhiên là chưa hoàn thiện, các kết quả tính toán được còn mắc sai số tương đối lớn. 3.1.2. Lựa chọn giá trị khởi tạo giả định Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát một cách lựa chọn giá trị khởi tạo giả định khác so với các nghiên cứu trước đây (đối với hệ 2 hoặc 3 chất): - Phương án 1: Giải hệ 2 (hoặc 3) phương trình với 2 (hoặc 3) ẩn số là nồng độ chất) ở 2 (hoặc 3) bước sóng gần nhau (phương trình phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang và nồng độ chất trong hỗn hợp với các hệ số hấp thụ phân tử biết trước, tính toán từ phổ của dung dịch chuẩn đơn cấu tử/hay đơn chất), sẽ xác định được nồng độ các chất trong hỗn hợp, và lấy chúng làm các giá trị khởi tạo nồng độ. Còn giá trị khởi tạo phương sai được lựa chọn ngẫu nhiên, chẳng hạn bằng 1. - Phương án 2: Lựa chọn giá trị nồng độ khởi tạo ngẫu nhiên (nhưng có chủ ý) là 0,3 µg/mL (cho mỗi chất bất kỳ trong hỗn hợp 2 hoặc 3 chất). Nhưng đối với phương sai, giá trị khởi tạo cho nó không chọn ngẫu nhiên, mà được tính toán theo phương trình Horwitz: Với nồng độ C = 0,3 µg/mL = 3.10-7, 9 tính toán được phương sai bằng 0,003 và lựa chọn giá trị này làm giá trị khởi tạo. 3.1.2.1. Đối với hệ hai cấu tử TEL và HYD Áp dụng phương pháp Kalman cho bộ dữ liệu phổ đơn chất và hỗn hợp 2 chất (trong khoảng bước sóng 220 nm – 340 nm) với cách lựa chọn giá trị khởi tạo giả định (theo phương án 1 và phương án 2), thu được các kết quả ở bảng 3.3 và 3.4. Bảng 3.3. Kết quả xác định nồng độ TEL và HYD trong hỗn hợp bằng phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo giả định – Phương án 1(*) Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 TEL Co (µg/mL) 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 C (µg/mL) 0,99 1,99 2,95 3,88 5,03 6,07 7,18 7,99 9,00 RE (%) -0,9 -0,6 -2 -3 -0,6 1 3 -0,1 0 HYD Co (µg/mL) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 C (µg/mL) 8,91 7,84 6,86 6,02 5,06 3,95 3,01 1,98 1,03 RE (%) -1,1 -2,0 -2,0 0,4 1,3 -1,2 0,3 -0,8 3 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Bảng 3.4. Kết quả xác định nồng độ TEL và HYD trong hỗn hợp bằng phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo giả định – Phương án 2(*) Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 TEL Co (µg/mL) 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 C (µg/mL) 0,30 0,30 0,31 0,31 0,32 0,35 0,38 0,42 0,48 RE (%) -70,0 -84,9 -89,8 -92,3 -93,5 -94,2 -94,6 -94,7 -94,6 HYD Co (µg/mL) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 C (µg/mL) 0,30 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,30 RE (%) -96,6 -96,2 -95,6 -94,8 -93,7 -92,2 -89,7 -84,7 -69,7 10 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Kết quả ở bảng 3.3 và 3.4 cho thấy: - Theo phương án 1, phương pháp Kalman cho kết quả tin cậy về nồng độ các chất trong hỗn hợp với các sai số RE < 3 % (đối với cả TEL và HYD). Tuy vậy, theo phương án này, cách thực hiện khá phức tạp và phụ thuộc vào 2 bước sóng lựa chọn để giải phương trình xác định các giá trị nồng độ khởi tạo. Mặt khác, khi áp dụng vào thực tế, do ảnh hưởng của pha nền (matrix), phép đo phổ có thể mắc sai số lớn hơn, nên phương án này có thể mắc sai số lớn hơn; - Theo phương án 2, phương pháp Kalman cho kết quả mắc sai số lớn, dù rằng giá trị phương sai khởi tạo đã được giả định phù hợp hơn so với cách chọn giá trị phương sai ngẫu nhiên (bằng 1) như ở trường hợp trước (mục 3.1.1). - Các kết quả trên cho phép nhận xét rằng, giữa nồng độ và phương sai, giá trị khởi tạo nồng độ đóng vai trò quan trọng hơn (hay quyết định hơn) đến sai số của kết quả cuối cùng (khi xác định theo phương pháp Kalman). Rõ ràng, cần phải có cách phù hợp hơn để lựa chọn giá trị khởi tạo nồng độ. 3.1.2.2. Đối với hệ 3 cấu tử AML, HYD và VAL Bảng 3.5. Kết quả xác định nồng độ AML, HYD và VAL trong hỗn hợp bằng phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo giả định – Phương án 1(*) Kí hiệu H1 H2 H3 H4 AML Co (µg/mL) 0,250 0,50 1,00 5,00 C (µg/mL) 1,731 0,478 0,530 5,032 RE (%) -30,8 -4,5 -47 0,6 HYD Co (µg/mL) 0,325 0,65 1,30 5,00 C (µg/mL) 2,794 0,495 1,610 5,910 RE (%) -14,0 -23,8 23,85 18,2 VAL Co (µg/mL) 4,00 8,00 16,00 5,00 C (µg/mL) 4,796 11,053 29,067 3,949 RE (%) 19,9 38,2 81,7 -21,03 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được 11 Bảng 3.6. Kết quả xác định nồng độ AML, HYD và VAL trong hỗn hợp bằng phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo giả định – Phương án 2(*) Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 AML Co (µg/mL) 0,250 0,50 1,00 5,00 C (µg/mL) 0,300 0,300 0,282 0,477 RE (%) 20,0 -40,0 -71,8 -90,5 HYD Co (µg/mL) 0,325 0,65 1,30 5,00 C (µg/mL) 0,301 0,304 0,368 0,443 RE (%) -7,4 -53,2 -71,7 -91,1 VAL Co (µg/mL) 4,00 8,00 16,00 5,00 C (µg/mL) 0,319 0,454 0,542 0,289 RE (%) -92,0 -94,3 -96,6 -94,2 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Kết quả ở bảng 3.5 và 3.6 cho thấy: - Theo phương án 1, ngoại trừ trường hợp đối với AML trong hỗn hợp H2 và H4 (sai số RE < 4,5 %), các trường hợp còn lại đều có sai số lớn với RE khoảng 14 % – 82 %. Như vậy, khác với hệ 2 cấu tử (nỗng độ của chúng chỉ mắc sai số với RE < 3%), đối với hệ 3 cấu tử, phương pháp mắc sai số lớn hơn nhiều. Rõ ràng, khi số cấu tử trong hệ tăng lên, ảnh hưởng qua lại của chúng sẽ lớn hơn, dẫn đến việc giải hệ 3 phương trình với 3 ẩn số (nồng độ chất trong hệ) sẽ mắc sai số lớn hơn. Rõ ràng, phương án 1 chỉ áp dụng được cho hệ 2 cấu tử. Mặt khác, phương án cũng khá phức tạp, vì sai số của phương pháp phụ thuộc vào các bước sóng được lựa chọn để thiết lập và giải phương trình. - Theo phương án 2, cũng tương tự như trường hợp hệ 2 cấu tử, mặc dù việc đưa ra giá trị khởi tạo cho phương sai tiếp cận với thực tế hơn (do được ước lượng từ phương trình Horwitz), song phương pháp vẫn mắc sai rất lớn với RE khoảng 7% – 97 %). Đến đây, có thể thấy rằng, cả 2 cách lựa chọn giá trị khởi tạo cho nồng độ và phương sai – lựa chọn giá trị khởi tạo ngẫu nhiên và lựa chọn giá trị khởi tạo giả định – đều chưa cho kết quả tốt (hay mắc sai số lớn), trừ khi giá trị khởi tạo nồng độ được chọn ngẫu nhiên, hoặc được tính toán như phương án 1 12 (thuộc cách lựa chọn gái trị khởi tạo giả định), gần với giá trị thực của nồng độ chất trong hệ. Rõ ràng, cần phải có một cách lựa chọn giá trị khởi tạo khác, sao cho giá trị nồng độ khởi tạo của chất trong hệ càng gần với giá trị thực của nó càng tốt. Xuất phát từ những lí do trên, cần phải đề xuất một giải pháp lựa chọn giá trị khởi tạo mới nhằm đáp ứng 3 yêu cầu: - Giá trị nồng độ khởi tạo càng gần với giá trị thực của chất trong hệ càng tốt; - Phương sai (hay sai số) của nồng độ không nên lựa chọn ngẫu nhiên, mà nên lựa chọn sao cho phù hợp với các hướng dẫn của quốc tế khi xác định một nồng độ C bất kỳ, chẳng hạn, dựa vào phương trình Horwitz để ước lượng giá trị phương sai khởi tạo; - Giải pháp khởi tạo đưa ra phải sao cho dễ dàng áp dụng vào thực tế khi phân tích một hỗn hợp chất bất kỳ, mà chưa biết trước nồng độ của chúng. 3.1.3. Lựa chọn giá trị khởi tạo gần đúng - Áp dụng phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (viết tắt là BPTT) để giải hệ m phương trình với n ẩn số (m là số bước sóng được lựa chọn để quét phổ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp các cấu tử, n là số cấu tử trong hệ), sử dụng phương pháp khử Gauss để đưa hệ phương trình về dạng n phương trình với n ẩn số; Các phương trình của hệ có dạng bội tuyến tính và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang; Nồng độ các cấu tử thu được từ việc giải hệ phương trình đó được chọn làm giá trị khởi tạo nồng độ Cest(0); Theo cách này, các giá trị nồng độ ước lượng ban đầu tương đối gần với giá trị thực của nồng độ cấu tử trong hệ đang nghiên cứu, bất kể là hệ đã biết trước nồng độ thực (chẳng hạn, dung dịch chuẩn của hỗn hợp các cấu tử) hoặc chưa biết trước nồng độ thực của các cấu tử trong hệ (chẳng hạn, mẫu thực tế); - Áp dụng phương trình Horwitz để ước lượng giá trị phương sai ứng với nồng độ C của mỗi cấu tử trong hệ và chấp nhận giá trị thu được là giá trị khởi tạo cho phương sai đối với mỗi cấu tử Pest(0). Giá trị phương sai Pest(0) ứng với nồng độ Cest(0) đối với mỗi cấu tử trong hệ được tính từ phương trình Horwitz như sau: 13 - Từ công thức (3.1), RSD (%) = ×100or (0) H witz est S C (3.1) Tính được độ lệch chuẩn S = [RSDHorwitz*Cest(0)]/100; Trong đó, RSDHorwitz được tính theo công thức (3.2), mà trong đó Cest(0) được biểu diễn bằng phân số. ( ) (0)1 0.5lgC% 2 estHorwitzRSD − = (3.2) - Từ S, tính được phương sai S2 = Pest(0). 3.1.3.1. Đối với hệ 2 cấu tử TEL và HYD Bảng 3.7. Kết quả xác định nồng độ TEL và HYD trong hỗn hợp bằng phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo gần đúng(*) Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 TE Co (µg/mL) 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 C (µg/mL) 0,99 1,99 2,95 3,88 5,03 6,07 7,18 7,99 9,00 RE (%) -0,9 -0,6 -2 -3 -0,6 1 3 -0,1 0 HY Co (µg/mL) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 C (µg/mL) 8,93 8,03 7,05 6,05 5,06 3,95 3,00 1,99 1,03 RE (%) -0,8 0,4 0,6 0,8 1,3 -1,2 0 0,7 2,7 (*)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Kết quả ở trên cho thấy: Đối với cả 9 hỗn hợp với tỷ lệ nồng độ (ppm/ppm) của TEL/HYD từ 1/9 đến 9/1, phương pháp Kalman đều cho ra các kết quả tin cậy với sai số rất nhỏ, RE ≤ 3 %. 3.1.3.2. Đối với hệ 3 cấu tử AML, HYD và VAL Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ AML, HYD và VAL trong hỗn hợp bằng phương pháp Kalman với cách lựa chọn giá trị khởi tạo gần đúng (*) Hỗn hợp H1 H2 H3 H4 14 AML Co (µg/mL) 0,250 0,50 1,00 5,00 C (µg/mL) 0,253 0,511 1,016 4,981 RE (%) 1,2 2,2 1,6 0,4 HYD Co (µg/mL) 0,325 0,65 1,30 5,00 C (µg/mL) 0,320 0,646 1,290 5,064 RE (%) -1,5 -0,6 -0,8 1,3 VAL Co (µg/mL) 4,00 8,00 16,00 5,00 C (µg/mL) 3,99 8,06 16,05 4,821 RE (%) -0,2 0,8 0,3 -3,6 *)Co: Nồng độ chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp; C: Nồng độ chất xác định được Các kết quả cho thấy, phương pháp cho ra các kết quả tin cậy về nồng độ của 3 cấu tử trong hệ với sai số nhỏ, RE ≤ 4 %. Như vậy, đối với cả hệ 2 và 3 cấu tử, giải pháp lựa chọn giá trị khởi tạo gần đúng đều cho kết quả tin cậy hơn 2 giải pháp lựa chọn giá trị khởi tạo ngẫu nhiên và giả định. Song, để khẳng định chắc chắn hơn về giải pháp lựa chọn giá trị khởi tạo gần đúng cũng như lợi thế của phương pháp Kalman (với giải pháp lựa chọn đó), cần có những nghiên cứu so sánh phương pháp Kalman với một số phương pháp truyền thống khác như: Phương pháp chemometric-trắc quang sử dụng thuật toán bình phương tối thiểu (viết tắt là BPTT), phương pháp phổ đạo hàm (viết tắt là PĐH) khi xác định nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp của chúng cả trong dung dịch chuẩn và mẫu thực tế (mẫu dược phẩm). 3.2. CHƯƠNG TRÌNH MÁY TÍNH ĐỂ TÍNH TOÁN THEO THUẬT TOÁN LỌC KALMAN Tiến trình tính toán được mô tả như ở hình 3.1: 15 Hình 3.1. Sơ đồ chương trình tính toán theo thuật toán lọc Kalman với giải pháp lựa chọn giá trị khởi tạo gần đúng (áp dụng cho hệ 2 và 3 cấu tử). Chương trình cho phép in ra các kết quả về nồng độ của mỗi cấu tử trong hỗn hợp và sai số tương đối RE tương ứng 3.3. KIỂM CHỨNG PHƯƠNG PHÁP KALMAN ĐỐI VỚI HỖN HỢP HAI CẤU TỬ. Kiểm chứng phương pháp khi xác định đồng thời hỗn hợp hai chất gồm Telmisartan (TEL) và Hydrochlothiazide (HYD); Paracetamol (PAR) và Cafein (CAF); Paracetamol (PAR) và Ibuprofen (IB). Dùng các phương pháp chemometric (phương pháp Kalman, BPTT và phổ đạo hàm) để tính toán. 3.3.1. Phổ hấp thụ quang và phổ đạo hàm Kết quả khảo sát phổ đạo hàm và phổ hấp thụ quang của các hỗn hợp cho thấy: Có thể xác định đồng thời hàm lượng của TEL và HYD, PAR và CAF, PAR và IB bằng phương pháp phổ toàn phần và phương pháp phổ đạo hàm. 3.3.2. Kiểm định phương pháp đối với dung dịch chuẩn phòng thí nghiệm 3.3.2.1. So sánh ba phương pháp chemometric-trắc quang Cả 3 phương pháp – phương pháp Kalman, phương pháp BPTT và phương pháp PĐH đều được áp dụng để xác định nồng độ các chất (hay cấu tử) trong dung dịch hỗn hợp của chúng. Các dung dịch hỗn hợp đó đều được chuẩn bị từ các 16 dung dịch chuẩn phòng thí nghiệm. Tiêu chí để đánh giá so sánh các kết quả của 3 phương pháp là sai số tương đối (RE). Kết quả khảo sát cho thấy: khi xác định nồng độ các chất, đối với phương pháp lọc Kalman, sai số lớn nhất là -3,7 % (khi xác định IB trong hỗn hợp PAR và IB), sai số bé nhất là 0 % (khi xác định HYD trong hỗn hợp TEL và HYD); đối với phương pháp BPTT, sai số lớn nhất là -3,7 % (khi xác định IB trong hỗn hợp PAR và IB), sai số bé nhất là 0 % (khi xác định TEL trong hỗn hợp TEL và HYD); đối với phương pháp quang phổ đạo hàm, sai số lớn nhất là 4,0 % (khi xác định IB trong hỗn hợp PAR và IB), sai số bé nhất là 0,0 % (khi xác định IB trong hỗn hợp PAR và IB). Các phương pháp cho kết quả chấp nhận với sai số RE (%) nhỏ do đó có độ đúng tốt. 3.3.2.2. Độ lặp lại của phương pháp khi phân tích dung dịch chuẩn phòng thí nghiệm Kết quả khảo sát cho thấy giá trị RSD của tất cả các chất trong hỗn hợp từ 0,1 đến 2%, đều nhỏ hơn giá trị ½ RSDH (5,3 – 8,0 %), chứng tỏ rằng các phương pháp đạt được độ lặp lại tốt. 3.4. KIỂM CHỨNG PHƯƠNG PHÁP KHI XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HỖN HỢP BA CHẤT Vì với hỗn hợp ba chất, để tìm được bước sóng tại đó phổ đạo hàm của một chất khác 0, còn phổ đạo hàm của hai chất còn lại bằng 0 là rất khó. Đây cũng chính là nhược điểm của phương pháp quang phổ đạo hàm. Chính vì vậy, trong phần này chỉ khảo sát phổ toàn phần và tính kết quả theo phương pháp Kalman và phương pháp CLS (khảo sát đối với hỗn hợp: Amlodipine (AML), hydroclorothiazid (HYD), valsartan (VAL). 3.4.1. Khảo sát phổ hấp thụ của hỗn hợp Kết quả khảo sát phổ hấp thụ của các hỗn hợp cho thấy, có thể xác định đồng thời hàm lượng của AML, HYD và VAL bằng phương pháp trắc quang – chemometric dùng phổ toàn phần. 3.4.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp khi phân tích dung dịch chuẩn phòng thí nghiệm các hỗn hợp. 3.4.2.1. Sai số của phương pháp 17 Kết quả khảo sát cho thấy với các tỉ lệ nồng độ khác nhau, giữa nồng độ dung dịch chuẩn và nồng độ xác định được mắc sai số RE (%) nhỏ. Đối với phương pháp lọc Kalman, sai số bé nhất là -3,6%, sai số lớn nhất là 2,2%; đối với phương pháp CLS, sai số bé nhất là - 3,2%, sai số lớn nhất là 2,2%. Như vậy, các phương pháp cho kết quả chấp nhận với sai số RE (%) nhỏ do đó có độ đúng tốt. 3.4.2.2. Đánh giá độ lặp của phương pháp khi phân tích dung dịch chuẩn phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy: Giá trị RSD của AML và VAL cả 3 lần đo lặp lại cho các mẫu từ H1 đến H4 là 0,4 % , của HYD từ 0,4 % đến 0,5 % < ½ RSDH, chứng tỏ rằng các phương pháp đạt được độ lặp lại tốt (bảng 3.21). Nồng độ trung bình của ba chất AML, HYD và VAL trong các mẫu H1, H2 được tính theo hai phương pháp là như nhau (p>0,05). Trong khi đó đối với mẫu H3 và H4 nồng độ trung bình xác định được theo hai phương pháp khác nhau (p<0,05). Để đánh giá sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê hay không, sử dụng kiểm định t (t-test) để so sánh giá trị trung bình của hai phương pháp, kết quả thu được ở bảng 3.23 và hình 3.9. Từ bảng 3.23 áp dụng phương pháp kiểm định t theo cặp (paired-t-test) cho thấy: Khi sử dụng hai phương pháp Kalman và BPTT để tính toán nồng độ AML, HYD và VAL ở mẫu H4 đều thu được ttính > tlt. Vì vậy có thể kết luận nồng độ trung bình tính được từ hai phương pháp là khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (với p< 0,05). 18 Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với hỗn hợp AML, HYD và VAL Mẫu Thông số AML HYD VAL Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB H1 CK (µg/mL) 0,253 0,252 0,254 0,253 0,320 0,320 0,321 0,320 3,990 3,980 4,010 3,993 RSDK (%) 0,4 0,3 0,4 CS (µg/mL) 0,253 0,253 0,254 0,253 0,319 0,319 0,321 0,319 3,993 3,981 4,009 3,994 RSDS (%) 0,4 0,4 0,4 ½ RSDH 9,9 9,5 6,5 H2 CK (µg/mL) 0,511 0,510 0,514 0,512 0,646 0,645 0,650 0,647 8,060 8,044 8,109 8,071 RSDK (%) 0,4 0,5 0,4 CS (µg/mL) 0,511 0,510 0,514 0,512 0,645 0,644 0,649 0,646 8,059 8,043 8,107 8,070 RSDS (%) 0,4 0,5 0,4 ½ RSDH 8,9 8,6 5,9 H3 CK (µg/mL) 1,016 1,013 1,020 1,016 1,290 1,286 1,296 1,291 16,050 15,994 16,114 16,053 RSDK (%) 0,4 0,4 0,4 CS (µg/mL) 1,017 1,013 1,021 1,017 1,284 1,279 1,290 1,284 16,037 15,980 16,101 16,040 RSDS (%) 0,4 0,5 0,4 ½ RSDH 8,0 7,9 5,5 H4 CK (µg/mL) 4,981 4,971 5,008 4,987 5,064 5,054 5,089 5,069 4,821 4,811 4,844 4,825 RSDK (%) 0,4 0,4 0,4 CS (µg/mL) 4,841 4,831 4,865 4,846 5,109 5,099 5,135 5,114 4,873 4,864 4,898 4,878 RSDS (%) 0,4 0,4 0,4 ½ RSDH 6,3 6,3 6,3 CK, RSDK: Nồng độ, độ lặp lại tính được theo phương pháp Kalman; CS, RSDS: Nồng độ, độ lặp lại tính được theo phương pháp Simulan. 19 3.6. Áp dụng thực tế 3.6.1. Kiểm soát chất lượng phương pháp phân tích 3.6.1.1. Độ lặp lại Kết quả khảo sát các mẫu thuốc chứa các hỗn hợp TEL và HYD; PAR và CAF; PAR và IB; AML, HYD và VAL cho thấy độ lặp lại RSD lần lượt là: từ 0,8 % đến 5,7 %; từ 0,3 % đến 0,9 %; từ 0,2 % đến 1,2 %, từ 2,2 % đến 2,3 % (đều < ½ RSDH). Như vậy quy trình phân tích đã áp dụng để xác định đồng thời TEL và HYD trong mẫu thuốc cho độ lặp lại tốt. 3.6.1.2. Độ đúng Phân tích mẫu thêm chuẩn: - Kết quả phân tích đối với các hỗn hợp 2 cấu tử (hỗn hợp TEL và HYD, hỗn hợp PAR và CAF, hỗn hợp PAR và IB) và hỗn hợp 3 cấu tử (AML, HYD và VAL) cho thấy: Cả 3 phương pháp Kalman, bình phương tối thiểu, phổ đạo hàm đều đạt được độ đúng tốt với độ thu hồi thỏa mãn yêu cầu: Theo AOAC (Hiệp hội các nhà hóa học phân tích Mỹ), khi phân tích những nồng độ cỡ 1 ppm - 10 ppm (ppm ≈ µg/mL), nếu đạt được độ thu hồi trong khoảng 80 - 110 %, là đạt yêu cầu. Cụ thể: Phương pháp Kalman và BPTT đạt được độ thu hồi từ 90 % (khi xác định AML trong hỗn hợp AML, HYD và VAL) đến 107 % (khi xác định IB trong hỗn hợp PAR và IB). Phương pháp PĐH đạt được độ thu hồi từ 93 % đến 113 % (khi xác định TEL trong hỗn hợp TEL và HYD). Điển hình như kết quả độ thu hồi của AML trong hỗn hợp AML, HYD và VAL được thể hiện ở bảng 3.40. Đối với hỗn hợp hai chất: Tuy độ lặp lại của 3 phương pháp Kalman, BPTT, PĐH (đánh giá qua S hoặc S2) có khác nhau, nhưng chúng đều đạt được độ đúng tốt (đối với cả PAR và IB) khi so sánh với phương pháp HPLC với p > 0,05. Đối với hỗn hợp ba chất cho thấy: Kết quả của phương pháp Kalman và phương pháp BPTT đều cho kết quả không sai khác có ý nghĩa thống kê so với phương pháp HPLC (do các giá trị ttính đều nhỏ hơn giá trị ttới hạn với p > 0,30). Tuy vậy, dựa vào các giá trị p (mức ý nghĩa thống