Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces Cavourensis YBQ59

g BOX-PCR của 16 chủng xạ khuẩn được lựa chọn cho 15 băng có kích thước khác nhau trên bản điện di tương ứng với 15 vùng gen khác nhau trên hệ gen của các chủng xạ khuẩn (Hình 3.5). Xác định quan hệ di truyền cho thấy đa số các chủng xạ khuẩn có độ tương đồng di truyền <90%, chỉ có hai cặp xạ khuẩn (HBQ46 và HBQ47) và (HBQ9 và HBQ33) có hệ độ tương đồng di truyền >90%, chứng tỏ các chủng XKNS nghiên cứu có độ sai khác về di truyền trong hệ gen của XKNS. Kết quả nghiên cứu trên bước đầu đánh giá đa dạng XKNS, cho thấy các chủng XKNS phân lập từ cây quế có độ đa dạng di truyền cao hay tần suất phân lập các chủng trùng 42.1% 17.8% 22.6% 14.5% 2.0% 1.0% 0.0% Xám Trắng Vàng Đỏ Xanh Tím A B 8 lặp về di truyền thấp. Ngoài ra, đặc điểm hình thái của 16 xạ khuẩn trên cũng cho thấy tính đa dạng về mầu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào. Hình 3.5. Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR. Băng M: Thang DNA chuẩn (100 bp). 3.1.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng 09 VSV kiểm định của 297 chủng XKNS được tổng hợp trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế Chủng vi sinh vật kiểm định Số chủng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định Tỷ lệ (%) Hòa Bình (111) Lai Châu (81) Yên Bái (105) Hòa Bình Lai Châu Yên Bái Tổng số Vi khuẩn Gram âm E. coli ATCC 11105 25 6 9 22,5 7,4 8,6 13,5 P. vulgaris ATCC 49132 29 5 20 26,1 6,2 19,0 18,2 S. TyphimuriumATCC 14028 1 6 19 0,9 7,4 18,1 8,8 E. aerogenes ATCC 13048 28 4 8 25,2 4,9 7,6 13,5 P. aeruginosa ATCC 9027 0 6 16 0,0 7,4 15,2 7,4 Vi khuẩn Gram dương S. lutea ATCC 9341 28 4 4 25,2 4,9 3,8 12,1 MRSE ATCC 35984 28 10 22 25,2 12,3 21,0 20,2 B. cereus ATCC 11778 28 8 15 25,2 9,9 14,3 17,2 Nấm men C. albicans ATCC 10231 10 2 13 9,0 3,7 12,4 8,4 9 Trong số 297 chủng xạ khuẩn được thử nghiệm, có 96 chủng (chiếm 32,3%) kháng ít nhất một VSV kiểm định, chiếm đa số là các chủng xạ khuẩn Hòa Bình (n=40; 41,7%), tiếp đến Yên Bái (n=36; 37,5%) và Lai Châu (n=20; 20,8%). Tổng số 96 chủng xạ khuẩn có 37 chủng thể hiện phổ kháng khuẩn rộng (cùng kháng nhiều hơn 6 loại vi sinh vật kiểm định). Trong số 96 chủng phân lập, tác dụng ức chế tác nhân gây bệnh cao nhất đối với MRSE (n = 60, 62,5%), P. vulgaris (n = 54, 56,3%), tiếp đến là B. cereus (n = 51, 53,1%), E. coli và E. aerogenes (n = 40, 41,7%), S. lutea (n = 36, 37,5%), S. Typhimurium (n = 26, 27,1%), C. albicans (n = 25, 26,0%) và P. aeruginosa (n = 22, 22,9%). 3.1.4. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh Trong khuôn khổ của luận án đã phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA của 82/96 chủng XKNS sinh kháng sinh và xác định được trình tự của 82 chủng XKNS có độ tương đồng cao (97,9 - 100%) so với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI). 82/96 chủng XKNS đã được phân loại tới loài và đã được đăng ký trên GenBank (NCBI). Kết quả phân loại các chủng được tập hợp theo các chi, họ thuộc ngành xạ khuẩn (Actinobacteria) trên Bảng 3.2 cho thấy, 82 chủng XKNS được phân thành 6 chi thuộc 6 họ khác biệt: Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae, Microbacterium thuộc họ Microbacteriaceae, Brevibacterium thuộc họ Brevibacteriaceae, Micromonospora thuộc họ Micromonosporaceae, Saccharothrix thuộc họ Actinosynnemataceae và Nocardia thuộc họ Nocardiaceae. Trong đó, số chủng thuộc chi Streptomyces chiếm tỷ lệ cao nhất (92,7%), tiếp theo là chi Microbacterium (2,5%), còn các chi Micromonospora, Nocardia và Saccharothrix chiểm tỷ lệ thấp nhất (mỗi loại chiếm 1,2%). Bảng 3.2. Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA STT Họ Chi Số lượng chủng Tỷ lệ (%) 1 Brevibacteriaceae Brevibacterium 1 1,2 2 Microbacteriaceae Microbacterium 2 2,5 3 Micromonosporaceae Micromonospora 1 1,2 4 Nocardiaceae Nocardia 1 1.2 5 Actinosynnemataceae Saccharothrix 1 1,2 6 Streptomycetaceae Streptomyces 76 92,7 Tổng số 82 100 XKNS trên cây quế có sự đa dạng mức độ loài tương đối cao, chi Streptomyces là chi phổ biến nhất tại Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái, chi Microbacterium xuất hiện 10 tại ở tại hai khu vực Hòa Bình và Lai Châu, còn chi Nocardia chỉ xuất hiện ở Hòa Bình. Tuy nhiên, một số chủng thuộc các chi hiếm Saccharothrix chỉ phân lập được từ Lai Châu (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, số lượng XKNS khác nhau giữa các vị trí lấy mẫu có khả năng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu khác nhau. 3.1.5. Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Theo nhiều tài liệu trên thế giới công bố, một số sản phẩm trao đổi chất bậc hai có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư của xạ khuẩn được tổng hợp bởi 3 nhóm enzyme chính là PKS-I, PKS-II và NRPS. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ba gen pks-I, pks-II và nrps mã hóa enzyme có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh (Minotti và cs., 2004). Hình 3.6. Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96 chủng xạ khuẩn nội sinh cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái Trong nghiên cứu này, xác định sự có mặt của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh là một trong những đặc điểm sinh học của XKNS sinh kháng sinh. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại các gen của 96 chủng xạ khuẩn cho băng DNA có kích thước khoảng 1400 bp (đối với gen pks-I), 600 bp (pks-II) và 750 bp (nrps), tương ứng với kích thước mồi sử dụng khuếch đại gen pks-I, pks-II, nrps đã đưa ra. Điều đó cho thấy, 03 cặp mồi suy biến (K1F/M6R; A3F/A7R; KSαF/KSαR) sử dụng trong thí nghiệm là phù hợp. Tỷ lệ mang gen pks-I, pks-II và nrps lần lượt là 38,5% (n=37/96), 61,5% (n=59/96) và 36,5% (n=35/96) (Hình 3.6). Hoạt tính kháng VSV kiểm định và khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học (PKS-I, PKS-II và NRPS) là khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính sinh học của các chủng XKNS có thể liên quan trực tiếp tới sự có mặt của các gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS và các chủng XKNS trên cây quế có thể là nguồn sinh các chất kháng sinh và kháng ung thư quan trọng. 0 10 20 30 40 50 60 PKS-I PKS-II NRPS 23 23 11 5 17 11 9 19 13 37 59 35 Số lư ợn g ch ủn g xạ k hu ẩn Gen mã hóa Hòa Bình Lai Châu Yên Bái Tổng số 11 3.1.6. Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn phần lớn cho thấy độc tính đối với các khối u ở người hoặc các dòng tế bào ung thư (Minotti và cs., 2004; Nakashima và cs., 2013). Ngoài ra, nhóm chất anthracycline từ xạ khuẩn là một trong nhóm chất có hiệu quả nhất được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiều loại ung thư (McGowan và cs., 2017). Trong số 96 chủng XKNS tuyển chọn có 70 chủng (72,9%) có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline (chuyển màu cam với môi trường acid và tím trong môi trường kiềm). Trong đó, các chủng phân lập được từ cây quế ở Yên Bái sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline chiếm tỷ lệ cao nhất (31,3%), tiếp theo là Hòa Bình (28,1%), Lai Châu (13,5%). Đặc biệt, 14/96 chủng XKNS không có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline, nhưng 14 chủng này lại có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ít nhất 3 VSV kiểm định, do các hợp chất được tạo ra bởi các xạ khuẩn có thể không thuộc nhóm anthracycline. 3.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định cũng như khả năng mang các gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp kháng sinh và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin, trong luận án này nghiên cứu sinh đã lựa chọn chủng S. cavourensis YBQ59 thể hiện phổ kháng rộng, kháng mạnh với 8/9 chủng VSV kiểm định cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời, chủng YBQ59 mang gen mã hóa PKS- I, PKS-II, NRPS và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Trong đó các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, P. vulgaris, S. Typhimurium và P. aeruginosa là những tác nhân gây bệnh cần ưu tiên kiểm soát và phát triển kháng sinh điều trị theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) công bố vào tháng 2/2017. Ngoài ra, chủng YBQ59 thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với S. epidermidis kháng methicillin gây bệnh cơ hội phổ biến ở người khó điều trị (Otto, 2009). Vì vậy, chủng YBQ59 được tuyển chọn cho những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khai thác hệ gen, điều kiện lên men, thu hồi và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học. 3.2.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng YBQ59 phát triển tốt trên môi trường ISP2 ở pH 7,0, nhiệt độ 30°C với nồng độ NaCl là 2%. Nhiệt độ, pH, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng đối với việc ứng dụng xạ khuẩn trong lên men thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 sử dụng được hầu hết các nguồn carbon (11/13) thử nghiệm ngoại trừ D-glucosamine, D-sorbitol, nhưng chỉ sử dụng được 6/13 nguồn nitơ thử nghiệm (L-asparagin monohydrat, L-arginin, L-valin, L-methionin, L- threonin, L-cystein) và chủng YBQ59 còn có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào 12 như urease, gelatinase, amylase, cellulase và xylanase. Dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa của chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 có đặc diểm hình thái và sinh lý-sinh hóa giống loài S. cavourensis (El-Naggar và cs., 2016). Dựa vào so sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA chủng YBQ59 được định danh là Streptomyces cavourensis YBQ59 với mã số GenBank MF950891. 3.2.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 Dữ liệu được giải trình tự trên máy giải trình tự gen thế hệ mới IonTorrent PGM chủng YBQ59 thu được 2.856.000 đoạn DNA ngắn (read, từ 25-373 bp) với tổng dung lượng dữ liệu là 512.914.080 bp. Tiền xử lý được bộ dữ liệu tinh sạch với 2.042.979 (71,5%) đoạn trình tự có điểm chất lượng trên 20 và độ dài từ 36 đến 211. Lắp ráp de novo dữ liệu tinh sạch của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm VelvetOptimser với kích thước k-mer = 87, ghép nối dữ liệu cho thấy kích thước genome được dự đoán là 10.232.294 bp, bao gồm 4.428 đoạn ghép nối (contig), chỉ số N50=12.307 bp, contig dài nhất: 161.472 bp với độ bao phủ trung bình 26X và tỷ lệ GC trong hệ gen là 64%. Dự đoán và chú thích gene nhờ kết hợp ba phần mềm Prodigal, GeneMarkS (Besemer và cs., 2001) và NCBI Prokaryotic genome annotation pipeline (PGAP) version 4.5 (Tatusova và cs., 2016). Đã chú giải được 8.958 trình tự gen mã hoá protein (protein-coding), 76 gen tRNA, 4 operons rRNA và 3.145 gen giả định (pseudogene). Trong số các gen chú giải bằng NCBI có 6758 gen có kết quả chú giải trên cơ sở dữ liệu Gene Ontology (GO) chiếm 73% số lượng gen thu được chia thành 03 nhóm: nhóm Biological Process (các quá trình sinh học) chứa thông tin các quá trình mà các gen chú giải tham gia, nhóm Cellular component (thành phần trong tế bào hoặc bào quan) cung cấp thông tin vị trí hoạt động của các gen và nhóm Molecular Function (chức năng phân tử) cho biết chức năng của mỗi gen. Thống kê kết quả thu được từ Blast2GO PRO (Conesa và cs., 2005), cho thấy nhóm Biological Process có số lượng gen thực hiện quá trình chuyển hóa nhiều nhất với 6292 gen, nhóm Cellular component có nhiều gen hoạt động trong tế bào hơn so với các vị trí khác với 3083 gen và nhóm Molecular Function cho biết số lượng gen thực hiên chức năng chuyển hóa chiếm phần lớn với 5961 gen. Ngoài ra, chú giải hệ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 sử dụng cơ sở dữ liệu KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa và Goto, 2000) chỉ ra có 140 con đường chuyển hóa (pathway) liên quan đến sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Bên cạnh đó, tổng cộng 717 enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó 158 enzyme trực tiếp liên quan đến 13 quá trình tổng hợp kháng sinh như macrolide, ketolide (12, 14, 16 macrolide), các cấu trúc peptide nonrobosomal, cấu trúc polyketide loại I và loại II và dự đoán khả năng sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 bao gồm penicillin, cephamycin C, nocardicin A, clavaminate, erythromycin A/B, oleandomycin, picromycin, methymycin, neomethymycin, avermectin, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, mithramycin, tetracenomycin C, elloamycin, rebeccamycin, vancomycin và validamycin A. Hình 3.7. Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) và kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) Ghi chú: Màu tím đậm chỉ ORF, mũi tên chỉ chiều tổng hợp protein. A: Nhóm gen bao gồm 2 gen chính ctg328_1 và ctg328_2 được dự đoán mang chức năng tổng hợp beta-ketoacyl, ngoài ra còn có 2 NRPS/PKS motif tên PKSI-KS_m6 và PKSI-KS_m3, 1 domain và 1 vùng hoạt động cysteine. B: gen ctg1114_1 mã hóa cho 3-oxoacyl synthase III, gen ctg1114_2 theo blast hiện chưa xác định được chức năng Hơn nữa, phân tích hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm antiSMASH v3.0 (Weber và cs., 2015) cho thấy, hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 chứa 37 nhóm gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trao đổi thứ cấp, trong đó 14 con đường sinh tổng hợp liên quan tới sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học như NRPS, PKS-II, hybrid PKS-NRPS, PKS-III, Beta-ketoacyl synthase và những hoạt chất dự đoán được từ hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 bao gồm bacteriocin, bleomycin, calyculin, coelimycin, colonic acid, chlorizidine A, desferrioxamine B, ectoine, arylpolyene, macrotetrolides, naringenin, landepoxcin, terpene và svaricin. Dữ liệu chú giải hệ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 đã được đăng ký trên NCBI dưới mã số QLNH00000000. A A B 14 Trong số các nhóm gen có gen ctg328_1 tham gia vào con đường sinh tổng hợp chất kháng ung thư bleomycin có độ tương đồng 59% với gen bleom_AAG02357_H nguồn gốc từ Streptomyces verticillus ATCC 15003 (Du và cs., 2000) và ctg328_2 tham gia vào con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh jamaicamide với ctg328_1 có độ tương đồng 51% với gen JamM_AAS98784_H nguồn gốc từ Lyngbya majuscula (Edwards và cs., 2004) (Hình 3.7A). Hai gen ctg1114_1 và ctg1114_2 khác tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh macrotetrolide (Hình 3.7B). 3.2.3. Lựa chọn môi trường cơ sở và điều kiện lên men thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng S. cavourensis YBQ59 sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cao nhất trên môi trường lên men MT6 với đường kính vòng vô khuẩn kháng S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984 lần lượt đạt 25,6 mm và 27,1 mm. MT6 (g/l): CaCO3 1,0; tinh bột tan 10,0; bột đậu tương 10,0; nước cất 1000 ml được lựa chọn làm môi trường lên men chủng YBQ59 trong các nghiên cứu tiếp theo. Điều kiện lên men thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng S. cavourensis YBQ59 nuôi ở 25-37°C, pH 6,0-8,0; tỷ lệ tiếp giống 5%, độ thông khí bề mặt (surface aeration) 20%, chủng cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. Khi khảo sát độ thái lên men chủng S.cavourensis YBQ59 trên bình lên men Bioflo 110 5 lít kết quả cho thấy thời điểm thích hợp thu hồi kháng sinh ở 72-78 giờ lên men với đường kính VVK trên VSV kiểm định S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984 lần lượt đạt 34,0 và 41,2 mm. 3.2.4. Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng S. cavourensis YBQ59 có khả năng kháng 7/8 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính VVK trên 20 mm và hoạt tính kháng sinh mạnh nhất đối với chủng MRSE ATCC 35984 (đường kính VVK đạt 41,2 mm), tiếp theo là S. Typhimurium ATCC 14028 có hoạt tính kháng khuẩn với đường kính VVK 34,0 mm. Chủng S. cavourensis YBQ59 có hoạt tính kháng nấm men C. albicans ATCC 10231 cao (đường kính VVK đạt 21,5 mm) (Bảng 3.3). Kết quả trên cho thấy chủng S. cavourensis YBQ59 rất có tiềm năng sinh các hợp chất kháng sinh ứng dụng trong điều trị nhiễm khuẩn ở người. Chủng S. cavourensis YBQ59 có hoạt tính ức chế đối với cả 3 dòng tế bào ung thư ở mức độ khác nhau (Bảng 3.4). Hoạt tính gây độc tế bào được thể hiện thông qua phần trăm tế bào sống sót, ở cả hai nồng độ 30 µg/ml và 100 µg/ml lượng tế bào ung thư còn sống nhỏ hơn 50% trên dòng tế bào A549 và Hep3B, riêng với dòng tế bào ung thư vú MCF7 chủng S. cavourensis YBQ59 ức chế được ở nồng độ 30 15 µg/ml. Từ đó, ta có thể nghiên cứu các ứng dụng để sản xuất các loại thuốc có khả năng ức chế hoạt động của các dòng tế bào ung thư gan Hep3B, ung thư phổi A549 và ung thư vú MCF7. Trong khuôn khổ luận án các hợp chất tách được bước đầu sàng lọc khả năng kháng tế bào ung thư. Việc đánh giá khả năng gây độc đối với tế bào thường sẽ được nghiên cứu sâu khi các hoạt chất được lựa chọn trong phát triển nghiên cứu lâm sàng tiếp theo. Bảng 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch lên men chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng vi sinh vật kiểm định Đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm)* Vi khuẩn Gram âm E. coli ATCC 11105 25,3e ± 0.12 P. vulgarisATCC 49132 27,5d ± 0.11 S. Typhimurium ATCC 14028 34,0c ± 0.08 P. aeruginosa ATCC 9027 23,6f ± 0,21 E. aerogenes ATCC 13048 25,5e ± 0.09 Vi khuẩn Gram dương S. lutea ATCC 9341 0h MRSAATCC 35984 41,2a ± 0.14 B. cereus ATCC 11778 30,2b ± 0.17 Nấm men C.albicans ATCC 10231 21,5g ± 0.13 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê theo đánh giá của Fisher (p <0,05). Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của dịch lên men chủng S. cavourensis YBQ59 Dòng tế bào ung thư Tỷ lệ tế bào sống sót (%) Nồng độ 30 (µg/ml) Nồng độ 100 (µg/ml) A459 38,2b±2,54 32,0b±1,01 Hep3B 39,8b±1,71 30,3b±1,58 MCF7 50,2a±2,04 41,3a±1,91 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê theo đánh giá của Fisher (p <0,05). 16 3.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S. cavourensisYBQ59 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp Sơ đồ quy trình phân tích các hoạt chất thứ cấp từ dịch lên men của chủng S. cavourensis YBQ59 được trình bày trên Hình 3.8. Hình 3.8. Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S. cavourensis YBQ59 Cặn chiết ethyl acetat từ dịch lên men của chủng S. cavourensis YBQ59 được phân đoạn bằng các cột sắc ký lặp lại nhiều lần bằng cột pha đảo gel thường và cột pha đảo silica gel C18 đã đưa ra các thông số vật lý và dữ liệu phổ MS, NMR của các hợp chất của chủng S. cavourensis YBQ59 để thu được 8 hợp chất sinh học: 1- monolinolein – M2B5.1 (1), bafilomycin D - M2B5.0 (2), nonactic acid - M2B9.8 (3), daidzein - M2B8.3 (4), 3′-hydroxydaidzein - M2B7.5 (5), 5,11-epoxy-10- cadinanol - M2B3.8 (6), prelactone B - M2B3.8 (7) và daucosterol - M2B6.17 (8) đã được phân lập (Hình 3.8). * Hợp chất 1-monolinolein – M2B5.1 (1) O O HO OH 1 2 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 10' 11' 12' 13' 14' 15' 16' 17' 18' Hình 3.9. Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein B (1) (C21H38O4) 17 Hợp chất M2B5.1 thu được dưới dạng chất dạng dầu vàng. Phổ 1H NMR trên vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu của một nhóm methyl tại δH 1,37 (3H, t, J = 1,5 Hz, H-18′), dịch về vùng trường yếu hơn xuất hiện 5 tín hiệu proton của các nhóm oxymethine và oxy methylene tại δH 3,70 (1H, m, Hb-3); 3,83 (1H, d, J = 7,5 Hz, Ha- 3); 3,93 (1H, t, J = 4,0 Hz, Ha-1); 4,15 (1H, dd, J = 6,0; 11,5 Hz, H-2); 4,21 (1H, dd, J = 4,5; 11,5 Hz, Hb-1). Trên vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 4 proton olefin trong khoảng 5,32 → 5,38 (4H, m, H-9′, H-10′, H-12′, H-13′). Trên phổ 13C NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy hợp chất chứa 21 nguyên tử carbon trong đó trên vùng trường trung bình xuất hiện 3 tín hiệu δC 65,1 (C-1); 70,2 (C-2); 63,3 (C-3) gợi ý cho thấy hợp chất chứa dẫn xuất một phân tử glycerol. Còn lại là 18 nguyên tử carbon gồm 1 nhóm carbonyl, 4 nhóm methine, 12 nhóm methylene và 1 nhóm methyl. Kết quả phân tích ESI-MS của hợp chất cho thấy có một ion phân tử tại m/z = 377,2 [M + Na]+. Hợp chất này được đặc trưng bởi một ester của glycerol và acid béo không no nhiều nối đôi bằng cách so sánh dữ liệu của MS và NMR với các công bố khác. Từ những phân tích này và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo kết luận được hợp chất M2B5.1 là glyxerilin linoleate hoặc 1-monolinolein (1) (Hình 3.9) (Tuntiwachwuttikul và cs., 2004). Hợp chất 1-monolinolein trước đây đã được tìm thấy ở một loài Streptomyces khác và nó có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự nhân lên của virut gây bệnh dịch tả ở lợn (Sola và cs., 1986). * Hợp chất bafilomycin D - M2B5.0 (2) O HO O OH O OH H O O 1 8 15 24 25 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 O HO O OH O OH H O O 1 8 15 24 25 Hình 3.10. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2) (C35H56O8) Hợp chất M2B5.0 thu được dưới dạng bột màu vàng. Ở phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) cho 29 tín hiệu, trong đó vùng trường yếu xuất hiện 7 tín hiệu của proton olefin tại δH 5,18 (1H, dd, J = 9,0; 15,0 Hz, H-13); 5,74 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 5,81 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11); 6,28 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-20); 6,48 (1H, dd, J = 10,5; 15,0 Hz, H-12); 6,64 (1H, s, H-3) và 6,91 (1H, dd, J = 9,0; 15,5 Hz, H-21), dịch chuyển về vùng trường mạnh hơn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm oxymethine tại δH 3,18 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-23); 3,30 (1H, m, H-7); 3,76 (1H, m, H-17); 3,81 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-14), bên cạnh xuất hiện 2 tín hiệu singlet đặc trưng cho nhóm oxymethyl tại δH 3,22 (3H, s, 14-OCH3) và 3,67 (3H, s, 2-OCH3). 18 Kết hợp trên phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) và phổ HSQC cho thấy hợp chất cho 35 tín hiệu của carbon. Trên phổ HMBC xuất hiện những tương tác chính: 4-CH3 trương tác với C-3; C-4 và C-5; 6-CH3 với C-5; 6 và 7; 8-CH3 với C-8; 10-CH3 với C-9; C-10 và 11; H-15; 16 với 16-CH3; 18-CH3 với C-17; C-18 và C-19; 22-CH3 với C-21; C-22 và C-23; 24-CH3 với C-23; C-24 và C-25. Từ những dữ kiện này cho thấy các nhóm methyl được thế vào các vị trí tại C-4; C-6; C-8; C-10; C-16; C-18; C-22 và C-24. Ngoài ra còn có các tương tác 2-OCH3 với C-2; 14-OCH3 với C-14 kết luận được có hai nhóm oxymethyl được thế vào vị trí C-2 và C-14 của hợp chất. Phân tích phổ ESI-MS cho một ion phân tử tại m/z = 605,2 [M + H]+. Từ những phân phân tích trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố xác định được hợp chất M2B5.0 là bafilomycin D (2) với công thức phân tử C35H56O8 và khối lượng phân tử M = 604 (Hình 3.10) (Kim và cs., 1993). Như đã đề cập, hợp chất phân lập trước đây từ loài S. cavourensis cho thấy hoạt tính chống nấm (Xu và cs., 2013; Pan và cs., 2015). * Hợp chất nonactic acid - M2B9.8 (3) 1 O HO O H H OH 2 3 4 5 6 7 8 9 O HO O H H OH Hình 3.11. Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) Hợp chất M2B9.8 thu được dưới dạng dầu không màu. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD 3 OD) cho 11 tín hiệu vùng trường mạnh xuất hiện hai tín hiệu nhóm methyl tại δH 1,13 (1H, d, J = 6,5 Hz, 2-CH3); 1,18 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-9), dịch về vùng trường yếu hơn từ δH 1,57 → 2,47 là những tín hiệu của nhóm methine và nhóm methylene. Bên cạnh đó xuất hiện 3 tín hiệu của nhóm oxymethine tại δH 3,92 (1H, m, H-8), 4,01 (1H, m, H-3) và 4,04 (1H, m, H-6). Kết hợp trên phổ 13C NMR và phổ DEPT cho thấy hợp chất có 10 nguyên tử carbon, trong đó gồm các nhóm: 2 nhóm methyl, 3 nhóm methylene, 4 nhóm methine và 1 nhóm carboxyl. Trên phổ HMBC xuất hiện những tương tác chính: 2-CH3 tương tác với C-1; 2 và 3; H-9 với C-7; 8; H- 8 với C-6; H-5 với C-4; 7. ESI-MS (âm) phân tích xác định một ion phân tử tại m/z = 201,2 [M - H]’. Đồng thời đối chiếu những dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo xác định được hợp chất M2B9.8 là nonactic acid (3) (Hình 3.11) (Huang và cs., 2015). * Hợp chất daidzein – M2B8.3 (4) (4’,7-dihydroxyisoflavone) Hợp chất M2B8.3 thu được dưới dạng chất kết tinh màu vàng nhạt. Trên phổ 1H NMR tại vùng trường yếu xuất hiện tín hiệu của 3 proton vòng thơm tại δH 6,85 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,93 (1H, dd, J = 2,0; 9,0 Hz, H-6); 7,97 (1H, d, J = 9,0 Hz , H- 5) đặc trưng cho hệ vòng thơm ABX, các tín hiệu tại δH 6,81 (2H, dd, J = 2,0; 6,5 Hz, H-3′, H-5′); 7,38 (2H, dd, J = 2,0; 6,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho hệ vòng thơm 19 A2B2. Ngoài ra còn một tín hiệu proton xuất hiện ở vùng trường yếu hơn tại δH 8,27 (1H, s, H-2). 2 5 O 8 6 4a 8a 4 O HO OH 1' 2' 3' 4' 5'6'