Bài giảng Cấu trúc sinh học phân tử của HBV ý nghĩa trong lâm sàng - Đặng Thị Nga

CẤU TRÚC SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA HBVÝ NGHĨA TRONG LÂM SÀNGĐẶNG THỊ NGADỊCH TỂ LỊCH SỬ VỀ BỆNH VIÊM GAN DO VIRUS B Hippocrate (thế kỷ thứ V trước công nguyên)1898 được gọi là bệnh Botkin 1963 Bruch Blumberg đã tìm thấy một loại KT trong máu của bệnh nhân bị haemophili đã được truyền máu nhiều lần. KT này phản ứng lại với KN trong mẫu huyết thanh của một thổ dân châu Úc (được gọi là KN Au - Australia antigen). Sau đó KN này được tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân bị VGSV . Ngày nay KN Au được xác định chính là KN bề măt của VGSV B, viết tắt là HBsAgNăm 1970 Dane, J.Cameron và cộng sự đã phân lập được HBV hoàn chỉnh gọi là tiểu thể Dane, và từ đây người ta phát hiện nhiều dấu ấn khác của HBV như HBeAg, anti-HBe, HBcAg, anti-HBc HBV HBV thuộc họ Hepadaviridae, là một loại virus hướng gan có cấu trúc DNA. Đây là một loại virus gây bệnh cho người và một số loài linh trưởng khácTrong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân đôi của virus, người ta tìm thấy 3 hình dạng khác nhau của virus - Tiểu thể Dane (còn gọi là virion hoàn chỉnh)- Cấu trúc hình cầu - Cấu trúc hình ống HBV cá một phần vỏ với 3 loại protein S,M,L (KN HBsAg)Một phần nhân với - Màng bọc protein gọi là capside - Sợi đôi DNAPhần nhân và màng bọc này gọi là nucleocapsid (đủ thành phần để cấu tạo một virion)Cả phần vỏ và phần nucleocapside tạo ra một virion thực sựCẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV Bộ gen của HBV được cấu tạo từ một phân tử DNA vòng, có khoảng 3200 nucleotide (3,2 kb). DNA này bao gồm hai chuỗi, có chiều dài khác nhau: * Chuỗi dài nằm ngoài, (kí hiệu là L) có tính cực âm (-), tạo nên một vòng liên tục có chiều dài cố định 3200 nucleotide và gần như khép kín (3,2 kb) mã hoá cho các thông tin di truyền của siêu vi. * Chuỗi ngắn nằm trong, (kí hiệu là S) có tính cực dương (+), chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của bộ gen.CẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV Đặc điểm DNA của HBV là ở chổ không phải xoắn 2 vòng như các DNA của các virus khác mà chỉ xoắn một đoạn cuối và xếp thành hình tròn DNA của HBV không sao chép thẳng thành một DNA của virus mới khi vào trong tế bào gan, mà lại sao chép qua bước tạo ra 2 sợi mRNA nhờ RNA của tế bào kí chủ2 sợi mRNA này được gọi là tiền genome, chứa đựng toàn bộ thông tin di truyền của virus. Từ 2 sợi mRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion, và lúc này thì virion lại có DNA polymerase để sao chép từ mRNA ra DNA của hệ gen (tiến trình sao chép ngược). Như vậy DNA polymerase tác dụng như một men sao chép ngượcKhi sợi DNA dài đã hình thành thì sợi mRNA cũng tự phá hủy. Quá trình nhân đôi của sợi DNA được bắt đầu tại trình tự DR2 của sợi đầu và được tiếp tục nhờ sự khép vòng của sợi DNA.Sợi ngắn DNA có độ dài khác nhau do hoạt động của DNA polymerase, vì khi phần capside được bao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của DNA polymeraseCẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV Quy luật kinh điển là một gen-một protein, nhưng ở đây số lượng nucleoside của HBV rất ít, chỉ 3200, vì vậy các đoạn gen gối chồng lên nhau ; người ta đã xác định có 4 đoạn gen kí hiệu là S, C, P, X.CẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV TỔ CHỨC BỘ GEN HBV Chỉ có sợi DNA (-) mới được mã hoá. Trên sợi DNA này có 4 đoạn gen tương ứng với 4 khung dọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hoá để tổng hợp các protein của siêu vi như protein bề mặt, protein của lõi, polymerase và protein X, qua trung gian của các mRNA; có nhiều dài thay đổi lần lượt là 2,1kb; 2,4kb; 3,5kb và 0,5 kb. Gen pre-S1, pre-S2 và S: tổng hợp protein của KN bề mặt (HBsAg).Gen pre-C và C: tổng hợp protein của KN lõi (HBcAg và HBeAg)Gen X: tổng hợp Protein có tác dụng chuyển hoạt hoá (transactivation). Gen P tổng hợp PolymeraseTỔ CHỨC BỘ GEN HBV Gen S Bao gồm vùng S, Pre-S1 và Pre-S2 mã hóa để tổng hợp các protein bề mặt hay HBsAg. Vùng S và Pre-S2 có chiều dài cố định trong khi đó vùng Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân typ khác nhauGen SGen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 24kd gồm 226 acid amin. Protein này gồm hai thành phần này là p24 và Gp27 (Glycoprotein) đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa sốĐoạn S và Pre-S2 tổng hợp protein M (Medium) có chiều dài 33 kd gồm281 acid amin. Protein này gồm hai loại Glycoprotein là Gp33 và Gp 36. Vùng Pre-S2 có vai trò giúp cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ nó liên kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh người, đồng thời trên tế bào gan cũng có các thụ thể gắp với albumin trùng hợp trong huyết thanh người pHSA (Polymerized Human Serum Albumin ). Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng đề kháng với sự nhiễm HBV.Gen S, Pre-S1 và Pre_S2 tổng hợp protein L (Large) có chiều dài 39 kd gồm 2 loại p39 và Gp42. Chuỗi protein Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân typ khác nhau; đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của tế bào gan sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào.Gen SCả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt của virion, trong đó Protein S chiếm đa số. Protein M chiếm 5 đến 10% và Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của virionProtein bề mặt hay HBsAg Nguời ta phát hiện vùng S có ít nhất 5 quyết định khàng nguyên của HBsAg. Tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên này mà người ta phân biệt ra các phân typ khác nhau. Mỗi phân typ đều có chung phần quyết định kháng nguyên a và khác nhau tùy theo sự ghép cặp của các quyết định kháng nguyên d hoặc y ghép với w hoặc r để tạo nên các phân typ như adw, ayw, adr, ayr. Chính vùng a có liên quan đến tính miễn dịch vì nó quyết định cho sự tổng hợp Anti HBsHBsAgaayadwadraywayra1-2dwa3dwa1ywada3ywa2-3ywa2-1ywProtein bề mặt hay HBsAgProtein bề mặt hay HBsAgHBsAg in Cytoplasm of Ground Glass HepatocytesHBsAgGEN CGen C gồm vùng C và pre-CNếu quá trình đọc mã thực hiện suốt chiều dài của đoạn pre-C và C sẽ tổng hợp được HBeAg. Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C sẽ mã hóa cho việc tạo nên một đoạn peptide tín hiệu. Đoạn peptide tín hiệu này giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan được trong huyết thanh. Vì vậy HBeAg được gọi là KN hòa tan. KN này không tham gia vào cấu trúc của virion và chức năng của nó chưa được biết rõ. Sự hiện diện của HBeAg phản ảnh tình trạng nhân đôi của siêu vi và có liên quan đến tính lây nhiễmNếu quá trình đọc mã chỉ đi suốt đoạn C thì sẽ tổng hợp nên KN lõi hay còn gọi là HBcAg. HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên nó không được bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó không thể tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhânHBcAgHBcAg in Nuclei and CytoplasmHBcAgGEN PGen P chiếm 80% chiều dài của bộ genSản phẩm của gen P là một men vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA, vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNADNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiền genome (sợi RNA này được tạo ra từ khuôn mẫu DNA của HBV dưới tác dụng của RNA polymerase của tế bào gan)Như vậy sản phẩm của gen P liên quan đến cơ chế sao chép ngược của virus, và tham gia một phần vào việc tạo ra capside bao bọc bên ngoài cấu trúc của tiền genomeCấu trúc và chức năng của PolymeraseGen P mã hóa để tổng hợp polymerase của virus. Men này có đặc tính tương tự như các men sao chép ngược khác.Cấu trúc của polymerase bao gồm:Ở đầu N-tận của polymerase của virus có một acid amin là Tyrosin tương đối hằng định, được sử dụng làm chất mồi (primase) để khởi phát quá trình tổng hợp DNA của virusTiếp theo là vùng “khoảng trống” (Spacer) có trình tự rất thay đổi, nó giúp cho men này không thay đổi chức năng khi có đột biến xãy ra.Kế đến là vùng có hoạt tính của men sao chép ngược, bao gồm một trình tự các a.amin tương đối hằng định đó là Tyrosin-Methionin-Asparagin-Asparagin. Trình tự này có lẽ là vị trí xúc tác của men sao chép ngượcỞ đầu C-tận là vùng của men Ribonuclease H (RNase H), có chức năng làm thoái biến khuông RNA trong lúc tổng hợp sợi DNA(-)GEN XChức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác, nhưng có lẽ nó đóng vai trò chuyển hoạt hóa (transactivation) trong quá trình nhân đôi của virus. Sự chuyển hoạt hóa như vậy có thể làm tăng sự nhân lên của HBV và cả những virus ngoài HBV như HIVProtein X còn có liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng của tế bào, cho nên có vai trò trong cơ chế sinh ung thư của tế bào gan bị nhiễmSỰ ĐỘT BIẾN GEN CỦA HBVKỹ thuật PCR giúp cho các nhà khoa học phát hiện các biến đổi trên trình tự chuỗi DNA của bộ gen HBVSự đột biến gen của HBV có lẽ là hậu quả của 2 yếu tốTốc độ nhân đôi của HBV khá nhanhKhả năng đọc và sữa chữa trong quá trình nhân đôi của bộ gen không hoàn chỉnh: virus sử dụng DNA polymerase trong suốt quá trình nhân đôi nhưng men này lại thiếu chức năng sữa chữa trong khi sao chépBiến chủng Pre-CĐoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAgMột số trường hợp xãy ra đột biến ở vùng pre-C tại vị trí nucleotide 1896, Guanosin được thay thế bằng Adenin tạo nên một trình tự TAG (thay thế TGG). TAG là một codon kết thúc. Chính codon kết thúc này chấm dứt việc giải mã vùng pre-C, cho nên sự tổng hợp HBeAg không được thực hiện mặc dù quá trình nhân đôi của HBV vẫn tiếp diễn ( HBV DNA (+), AND polymerase (+) ), và sự tổng hợp HBcAg vẫn không ảnh hưởng nên vẫn tạo được phần lõi.HBeAg và HBcAg có chung vùng “quyết định miễn dịch” chính, cho nên antiHBe vẫn được thành lập mặc dù không có sự hiện diện của HBeAg. Đột biến này có liên quan đến điều trị bằng interferonViệc tồn tại kéo dài của HBV biến chủng pre-C trong máu bệnh nhân thường làm tăng men gan và các biến chứng khác như xơ gan, Kgan, hoặc nguy cơ viêm gan bùng phát (cơ chế có lẽ do đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh của kí chủ đối với HBV nhằm thải trừ HBV thông qua sự phá hủy tế bào gan bị nhiễm ồ ạt)Biến chủng Pre-CBiến chủng này có liên quan đến những trẻ em được sinh ra từ những bà mẹ mang HBV.Nghiên cứu trên 345 trẻ của các bà mẹ có HBsAg(+) và HBeAg(+), mặc dù sau khi sinh ra những đứa trẻ này đươc chích miễn dịch thụ động và chủng ngừa vaccin viêm gan B đầy đủ 3 mũi (24giờ, 1tháng, 2tháng),vẫn có 41 trẻ bị nhiễm HBV mặc dù antiHBs(+)Dùng phương pháp PCR để khảo sát chuỗi gen của HBV ở những đứa trẻ này người ta thấy có một điểm đột biến trên vùng quyết định KN “a” của HBsAg so với HBsAg mẹ. Vùng thường xãy ra đột biến là ở vị trí a.amin 145. Đây là trường hợp chủng ngừa thất bại.Đột biến trên gen S còn tạo ra các phân typ HBsAg khác nhauBiến chủng trên vùng HBsAgBiến chủng trên vùng HBsAgĐột biến trên DNA polymerase Một số thông tin viết về biến chủng trên men DNA polymerase của HBV đã được ghi nhậnBiến chủng này có liên quan đến việc sử dụng Lamivudine kéo dàiBiến chủng này làm ngăn cản sự tương tác giữa thuốc với DNA polymerasecuar HBV, nhưng men này vẫn hoạt động bình thườngÝ NGHĨA CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN TRONG LÂM SÀNGHBsAgLà dấu ấn đầu tiên của siêu vi xuất hiện trong huyết thanh bệnh nhân, khoảng 2 – 6 tuần trước khi có biểu hiện lâm sàng và 2 – 12 tuần sau khi tiếp xúc.HBsAg đạt đến nồng độ cao nhất tương ứng với thời kỳ vàng da rõ trên lâm sàng, sau đó giảm dần.HBsAg có thể (+) kéo dài từ 1 – 3 tháng và trở về (-)5–10% trường hợp HBsAg biến mất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng28% trường hợp (-) khi triệu chứng lâm sàng vừa cải thiệnDo đó, khi HBsAg(-) vẫn không loại trừ tình trạng nhiễm HBV mà phải tìn thêm các marker khác (như anti HBc hoặc HBV DNA).Ngoài ra có thể tìm HBsAg trong mô gan bằng hòa mô miễn dịch hay miễn dịch huỳnh quangKN pre-S1 và KN pre-S2 xuất hiện sớm với nồng độ thấp, sau đó giảm song song với HBsAg. Các KN này còn phản ảnh tình trạng nhân đôi của siêu viHBeAgHBeAg được tổng hợp vượt trội trong giai đoạn nhân đôi của siêu vi,và là bằng chứng của tính lây nhiễm caoHBeAg không có ý nghĩa về mặt chẩn đoán khi HBsAg(+), nhưng nó lại có giá trị về mặt tiên lượngHBeAg tồn tại kéo dài trên 8 tuần sau khi bắt đầu có triệu chứng lâm sàng sẽ là dấu hiệu chỉ điểm sớm cho khả năng bệnh diễn biến sang giai đoạn mạn tínhHBeAg thường(+) trong VGSV B mạn và hầu như (-) ở những người mang HBsAg mạn tính không triệu chứngTrong trường hợp có xuất hiện biến chủng pre-C thì HBeAg(-) nhưng antiHBe(+) và HBV DNA(+) Ý NGHĨA CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN TRONG LÂM SÀNGHBcAgHBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên nó không được bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó không thể tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhânÝ NGHĨA CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN TRONG LÂM SÀNGÝ NGHĨA CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN TRONG LÂM SÀNGHBV DNAHBV DNA(+) chứng tỏ siêu vi đang ở giai đoạn hoạt động nhân đôi trong tế bào kí chủ, cũng là bằng chứng của tính lây nhiễm caoTrong VGSV B cấp, HBV DNA biến mất trước hay cùng lúc với HBeAg, và trước khi HBsAg(-)HBV DNA còn có giá trị tiên lượng vì sự tồn tại kéo dài trên 8 tuần sau khi có triệu chứng lâm sàng sẽ là dấu hiệu chỉ điểm sớm cho khả năng bệnh diễn biến sang giai đoạn mạn tínhChỉ định của các phương pháp điều trị kháng virus thường dựa trên kết quả HBV DNA(+), và giúp đánh giá điều trị. Nồng độ HBV DNA tăng cao trước khi điều trị thường có đáp ứng kém với interferon. Ý NGHĨA CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN TRONG LÂM SÀNGÝ NGHĨA CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN TRONG LÂM SÀNGINTERFERONInterferon α bắt đầu được sử dụng trong điều trị VGSV B mạn tính từ đầu thập niên 70, và sau đó nhanh chóng trở thành một phương thức trị liệu chủ yếu.Cơ chế tác dụng chủ yếu của Interferon α là Kháng siêu vi trực tiếp (như úc chế quá trình giải mã, ức chế quá trình xử lý protein, ức chế sự trưởng thành của siêu vi, ức chế quá trình sao chép)Điều hòa miễn dịch(IFN có tác dụng làm gia tăng khả năng trình diện KN trên bề mặt của tế bào gan để các lympho T gây độc cảm ứng ly giải các tế bào gan bị nhiễm HBV)ÁP DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊÁP DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊÁP DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊINTERFERONCÁC THUỐC TƯƠNG TỰ NHƯ NUCLEOSIDESự phát triển của các thuốc tương tự như nucleoside thế hệ mới đã trở nên thuận lợi hơn nhờ những nghiên cứu của điều trị HIVNhiều thuốc ức chế men sao chép ngược của siêu vi trong điều trị nhiễm HIV chứng tỏ có hiệu quả chống lại HBVHiệu quả lâm sàng của Lamivudin trên bệnh nhân VGSV B được phát hiện tình cờ trong quá trình điều trị HIV ở nhóm bệnh nhân bị nhiễm cả HIV và HBVÁP DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊCÁC THUỐC TƯƠNG TỰ NHƯ NUCLEOSIDECơ chế tác dụng của các chất tương tự như NucleosideNucleoside là những đơn vị cấu tạo chuỗi RNA và DNACác chất tương tự như Nucleoside là những chất tổng hợp có cấu trúc tương tự như nucleoside tự nhiênCơ chế tác dụng của các thuốc có gốc này là ức chế quá trình tổng hợp DNA của siêu vi vì có khả năng cạnh tranh chỗ gắn kết của các nucleoside tự nhiên trên chuỗi DNA. Sau khi các chất tương tự nucleoside gắn vào chuỗi DNA rồi thì các nucleoside nội sinh kế tiếp của siêu vi không gắn kết được nữa. Vì vậy quá trình tổng hợp chuỗi DNA của siêu vi bị kết thúc nữa chừng.ÁP DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊXIN CẢM ƠN QUÍ THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ QUAN TÂM THEO DÕI