Bài giảng Di truyền vi khuẩn

Bài 5Di truyền vi khuẩn . Vật liệu di truyền của vi khuẩn và plasmid là ADN. Virus của vi khuẩn (bacteriophage hoặc phage) có ADN hoặc ARN là vật liệu di truyềnDi truyền vi sinh vậtVật liệu di truyềnDi truyền vi sinh vật. Hai chức năng thiết yếu của vật liệu di truyền là sao chép và biểu hiện . Vật liệu di truyền phải sao chép chính xác để truyền lại tất cả các tính trạng của cha mẹ . Biểu hiện vật liệu di truyền chuyên biệt ở điều kiện tăng trưởng xác định  kiểu hình đặc trưngĐặc điểm của di truyền vi sinh vật- Khuẩn lạc (dòng tế bào) là 1 cụm tế bào có nguồn gốc từ 1 tế bào ban đầu- Chủng: dòng tế bào mang 1 đặc điểm di truyền nào đó.Các đột biến ở vi sinh vật thường được phát hiện theo sự biến đổi các tính trạng sau: Hình thái: kích thước, hình dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không...- Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng...- Nuôi cấy: kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng, nhu cấu đoi các nhân tố tăng trưởng...- Tính đề kháng: kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt...- Miễn nhiễm: phản ứng kháng nguyên, kháng thể...Các đột biến có thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo nhờ các tác nhân gây đột biến. Mỗi gen có tần số đột biến đặc trưng.Di truyền vi sinh vậtCác sinh vật Prokaryote (vi khuẩn, virus) có quá trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính gọi là quá trình sinh sản cận hữu tínhĐặc điểm quá trình sinh sản cận hữu tính :- Truyền thông tin một chiều từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận- Tạo thành hợp tử một phần (merozygote). Tế bào thể cho (donor) chuyển một đoạn của bộ gen sang tế bào thể nhận (recipient), nên chỉ lưỡng bội một phần, còn các phần khác đơn bội.- Bộ gen thường chỉ là DNA trần, nên chỉ có một nhóm liên kết gen và tái tổ hợp thực chất là lai phân tử.Di truyền vi sinh vậtDi truyền vi sinh vậtĐV bậc cao 2 gamet → tạo hợp tử Vi khuẩn TB cho → TB nhậnhợp tử 1 phần1 phần1 chiềuCấu trúc Acid NucleicDi truyền vi sinh vậtADN = Acid Deoxyribonucleic3 thành phần chính:Deoxyribose –phân tử đườngPhosphate – tạo khungCác baseNitơ – Thymin, Adenin, Guanin, CytosinADN: cấu trúc, đặc tính, tổng hợpTất cả nucleotid có cấu trúc chungCấu trúc ADN Có năm base chính trong acid nucleicA, G, T, C có trong ADNA, G, U, C có trong ARN Cấu trúc ADN Các tiểu đơn vị nucleotide nối với nhau bởi liên kết phosphodiesterCấu trúc ADN Liên kết Hydrogen bổ sung nhau giữa các cặp base (A-T or G-C) Tương tác kỵ nước giữa các base hai chiềuCấu trúc ADN ADN tự nhiên là xoắn kép của chuỗi đối song gắn bổ sung vào nhau bằng:Sao chép ADN nhiễm sắc thểvi khuẩn Di truyền vi khuẩn. Thông tin của tế bào vi khuẩn nằm trên một phân tử ADN mạch kép vòng tròn đơn được gọi là genophore, hay “NST”. Gần đây đã phát hiện thấy rằng ít nhất ở một số vi khuẩn ADN tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi nhiễm sắc như histon ở NST Eukaryote. Ngoài ra ở một số vi khuẩn còn có thêm plasmid là phân tử ADN vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lậpNhiễm sắc thể của vi khuẩnDi truyền vi khuẩn. Là một vòng kín ADN sợi đôi xoắn kép. Dài khoảng 1mm, đường kính khoảng 2 nm, chứa 2,2 triệu cặp base nitơ (2,2 Mb). Cuộn xoắn để chứa được trong 1 tế bào < 2 m. Nhiễm sắc thể của E. coli chứa gần 4000 gen  . một số virus chỉ chứa 7 gen  . người ~ 30 000 gen Nhiễm sắc thể của vi khuẩnDi truyền vi khuẩnTế bào vi khuẩn E. coli. Phân tử ADN gắn trực tiếp vào màng sinh chất. Sự sao chép ADN tạo ra 2 bản sao gắn chung nhau trên màng sinh chất. Khi tế bào kéo dài ra các bản sao DNA tách xa nhau do phần màng giữa chúng lớn dần ra  Kiểu sinh sản vô tính này được gọi là ngắt đôi (Binary fission). Tế bào vi khuẩn chia nhanh hơn rất nhiều so với tế bào Eukaryote. Quá trình sao chép DNA được bắt đầu từ điểm xuất phát Ori kéo dài về 2 phia song song với quá trình kéo dài màng sinh chất, nơi có điểm gắn vào của DNA bộ gen, mọc dài tách 2 phân tử DNA về 2 tế bào conSao chép ADN vi khuẩn Di truyền vi khuẩnTế bào vi khuẩn phân chia theo trực phânCircular genetic map của E. coli Các kiểu sao chép ADN ở E. coli. Phân tử ADN cuộn xoắn có dạng hình tròn và tái bản bắt đầu tại điểm xuất phát Ori và đi theo hai chiều quanh vòng tròn . Các phân tử tái bản giống chữ cái Hy Lạp theta (). Kiểu này do John Cairns tìm ra năm 1962 nên còn gọi là kiểu Cairns. Kiểu tái bản theta (kiểu tái bản Cairns)Các kiểu sao chép ADN ở E. coliAutoradiograph of intact replicating chromosome of E coli. Bacteria were radioactively labeled with tritiated thymidine for approximately two generations and were lysed gently. Bacterial DNA was then examined by autoradiography. Insert shows replicating bacterial chromosome in diagrammatic form. The chromosome is circular, and two forks (X and Y) are present in replicating structure. The segments of chromosome represented by double lines had completed two replications in presence of tritiated thymidine, whereas segments represented by a solid line and a dotted line had replicated only once in presence of tritiated thymidine. The density of grains in the autoradiogram was twice as great in the segments of chromosome that had completed two cycles of replication in presence of tritiated thymnidine. Bar, 100 μm. From Cairns, J.P.: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 28:44, 1963. Hình phóng xạ tự ghi sự sao chép nhiễm sắc thể của E. coliCác kiểu sao chép ADN ở E. coli. Quá trình này xảy ra ở vi khuẩn thông qua quá trình tiếp hợp. Trong khi một mạch của ADN vẫn còn thắt nùi, thì enzym đã bắt đầu cắt sợi kia. Khi đó sợi đứt sẽ 'cởi' vòng và đóng vai trò khuôn tổng hợp sợi ADN bổ sung. Sau đó hai sợi tổ hợp lại thành dạng xoắn kép mới. Lúc bấy giờ một nùi nguyên ADN đã quay được 360o và lại được dùng làm khuôn để tổng hợp tiếp sợi bổ sung Cơ chế lăn vòng (rolling circle mechanisme)Các kiểu sao chép ADN ở E. coliTái bản bằng cơ chế lăn vòng Các kiểu sao chép ADN ở E. coliCác con đường chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhậnTiếp hợp (conjugation) Biến nạp (transformation) Tải nạp (transduction)Tải nạp - transductionTiếp hợp - conjugation Biến nạp - transformation Các con đường chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhậnChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Sự truyền ADN từ tế bào này (có F) sang tế bào khác qua sự tiếp giáp hai tế bàoTần số tổ hợp: 10-6Sự tiếp hợp1946, Joshua Lederberg và Edward Tatum (Nobel 1958)thí nghiệm với hai chủng E. coli K12 khuyết dưỡng Sự tiếp hợpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận TB choSợi còn lạiProtein tháo xoắnProtein màng mã hóa plasmidProtein vỏ đặc hiệu của TB nhậnSợi truyền quaMồiMồiTB nhậnVách tế bào Sự tiếp hợpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Tế bào cho ADN F+Tế bào nhận ADN F-Yếu tố F độc lập tích hợp với bộ gen (Hfr) tách ra từ bộ gen (F’)Yếu tố F là một episome chứa 19 gene và có khả năng làm tiếp hợp tế bào chứa nóF+Sự tiếp hợpYếu tố F độc lập Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận F+F-F+F-F+F+F+F+Sự tiếp hợpF+ x F-  F+ + F+Yếu tố F độc lập Gen được truyền qua ở mức độ thấpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Sự tiếp hợpYếu tố F tích hợp với bộ gen (Hfr)F+HfrChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-Sự tiếp hợpHfr x F-  Hfr + F-Gen được truyền qua ở mức độ caoChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Tham gia của HfrHfrF’Sự tiếp hợpYếu tố F tách ra từ bộ gen (F’)Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận F’F’F’F’F’F-F’F-Sự tiếp hợp F’F’ x F-  F’ + F’Gen trên F’ được truyền qua ở mức độ cao(giới nạp, F-duction, F-sexduction) Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Sự tiếp hợp- giữa các vi khuẩn cùng loài: E. coli, Streptococcus mutans, S. coelicolor- giữa các chi khác nhau  Escherichia với Shigella  Salmonella với Serratia  Escherichia với Salmonella  Bacteroides và các loài Clostridium Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Sự tiếp hợpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận - Dùng để xác định khoảng cách tương đối giữa các gen → 2 gen càng gần nhau, tiếp hợp càng dễ xảy ra- Có ý nghĩa trong phòng tránh sự tiếp hợp không có lợi, nhất là trong truyền gen đề kháng kháng sinhKhoảng cách trên bản đồ vi khuẩn luôn biểu hiện là phút do kỹ thuật này. Biến nạp (transformation) Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận ADN trần từ một tế bào vi khuẩn thể cho được truyền sang tế bào vi khuẩn thể nhận khác1928, Frederick Griffith, thí nghiệm trên Streptococcus pneumoniae, dạng R không có nang  dạng S có nang do hiện tượng biến nạp.1944, T. Avery, Mc. Leod và Mc. Carty xác định rõ tác nhân gây biến nạp là ADN.Biến nạpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do làm tan, DNA vòng của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau có khả năng gây biến nạp cho các tế bào thể nhận khácĐược nghiên cứu nhiều ở : Streptococcus pneumoniae,  Bacillus subtilis,  Haemophilus parainfluenzae Neisseria, Azotobacter, Rhizobium,  Staphylococcus aureus,  Agrobacterium radiobacter, E. coli K12 ... Biến nạpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố:+ Tính dung nạp của tế bào thể nhận . phải có trạng thái sinh lý đặc biệt để nhận đoạn ADN . Ví dụ: Streptococcus pneumoniae: 30 - 80 điểm nhận Haemophilus influenzae: 4-8 điểm nhận+ ADN phải ở dạng mạch kép, thường là đoạn nhỏ E.coli đoạn DNA biến nạp ~ 1/250 - 1/500 genom vi khuẩn+ Nồng độ của ADN Số lượng tế bào được biến nạp tăng tỉ lệ thuận với nồng độ của ADNBiến nạpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận 1. Thâm nhập của DNA . DNA gắn với điểm nhận của màng tế bào . Gắn có thể là thuận nghịch: gắn  nhả raCơ chế biến nạp2. Bắt cặp . DNA của thể nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở một đoạn  bắt cặp với đoạn DNA thể cho S vừa vô . Đoạn DNA của R ở đoạn có DNA của S bắt cặp sẽ bị cắt đứt và đẩy ra. . Trong quá trình bắt cặp, có những đoạn không tương đồng thì sẽ hình thành nên những vòng lồi, những đoạn đó gọi là Heteroduplex. Còn các đoạn bắt cặp tương đồng gọi là Homoduplex3. Sao chép Sau khi bắt cặp sẽ tạo phân tử DNA có đoạn lai R-S, tiến hành sao chép để tạo ra hai sợi kép: R-R và S-S.Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Cơ chế biến nạpTế bào nhậnCác mảnh ADN từ các tế bào choADN nhiễm sắc thểTế bào nhận bắt giữ ADN choTái tổ hợp xuất hiện giữa ADN cho và ADN nhậnPhân cắt ADN không tái tổ hợpGđ 1: Thâm nhập ADNGđ 2: Bắt cặpGđ 3: Sao chépBiến nạp tự nhiên. Biến nạp vi khuẩn có thể xảy ra trong tự nhiên, nhưng với tần số rất thấp.. Biến nạp vi khuẩn là một trong những ảnh hưởng rất lớn trong hiện tượng vi khuẩn đề kháng với các thuốc kháng sinh.Chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Biến nạp nhân tạo. Được tiến hành trong thí nghiệm: các tế bào được xử lý cho khả năng thấm được ADN. Có hai cách thông thường: phương pháp hóa học xử lý tế bào với CaCl2 lạnh phương pháp thẩm điệnsốc nhanh tế bào bằng dòng điện 100 – 200 volt1 g ADN  106 đến 107 tế bào biến nạpChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Tải nạp - transductionSự chuyển ADN từ VK này sang VK khác nhờ virus (phage)Virus xâm nhiễm tế bào VK, dùng bộ máy sao chép ADN của VK chủ để tạo ra nhiều bản sao ADN hay ARN của nó và đóng gói vào vỏ virus  virus chỉ chuyển một đoạn nhỏ ADN của tế bào cho và thực hiện bởi virus ôn hòaChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận Thí nghiệm . Trong ống hình chữ U, màng lọc vi khuẩn ngăn giữa hai ống  vi khuẩn không qua được nhưng phage qua được . Nhánh A : chứa vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan (trp+),  . Nhánh B : nuôi các vi khuẩn khác mất khả năng tổng hợp tryptophan (trp-). Sau khi nuôi một thời gian, ở nhánh B xuất hiện vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan. Nếu dùng màng ngăn không cho virus lọt qua thì không thấy hiện tượng này. tải gen trp+ từ nhánh A sang nhánh BPhage là nhân tố chuyển genPhage là nhân tố chuyển gen1951, Joshua Lederberg and Norton Zinder1965, K. Ikeda and J. Tomizawa Phage ký sinh ở tế bào E. coli có hai cơ chế sinh sản trong tế bào vi khuẩn . Chu trình tiêu giải . Chu trình tiêu giải tiềm ẩnSơ đồ chu trình tiêu giải và tiêu giải tiềm ẩnTải nạp - transductionChuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận . Sợi đuôi của phage gắn vào điểm nhận ở mặt ngoài tế bào E. coli, tạo lỗ thủng bơm DNA vào . Tế bào E. coli phiên mã và dịch mã các gen. DNA tế bào phân hủy, nucleotid dùng sao chép DNA của virus. Các protein tổng hợp thành ba phần: đầu, ống đuôi,sợi đuôi, ráp lại thành virion con. Tế bào bị phá vỡ, virion thoát ra ngoài. Thời gian một chu trình 20-30 phút ở 37 oC . Phage & tế bào vi khuẩn có sự đồng tiến hóaChu trình tiêu giảiChu trình tiêu giải. Phage sinh sản không làm chết tế bào . Phage gắn vào bề mặt tế bào E.coli và bơm DNA vào. DNA của phage T4 sẽ tạo vòng và tham gia vào: - Chu trình tiêu giải - Chu trình tiêu giải tiềm ẩn. DNA gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn ở điểm chuyên biệt: Prophage. DNA được sao chép như DNA của vi khuẩn.. Prophage có thể tách ra khỏi DNA của vi khuẩn do nhiệt, phóng xạ rồi bắt đầu chu trình tiêu giải.Chu trình tiêu giải tiềm ẩnCác kiểu tải nạp- Tải nạp chung: phage mang bất kỳ gen nào của vi khuẩn A sang vi khuẩn B . Bất kỳ gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp . Tải nạp do gói nhầm DNA của tế bào chủ khi phage trưởng thành . Các thể tái hợp đơn bội được tạo ra- Tải nạp chuyên biệt hay tải nạp hạn chế: chỉ chuyển một vài gen nhất định . Những gen được chuyển nằm sát chỗ phage gắn vào . Chỉ prophage kiểu l thực hiện . Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi NST của tế bào chủỨng dụng của tải nạpXác định bản đồ gen di truyền của VK Tạo ra các chủng VK kháng thuốcDùng trong điều trị bệnhTạo ra các vi sinh vật biến đổi gen Dùng thực khuẩn tiêu diệt VKTrong sản xuất vaccin tái tổ hợpYếu tố di truyền vận động Đoạn chèn (insertion sequence, IS) Gen nhảy (transposon) . Là một đoạn DNA của vi khuẩn di chuyển từ một vị trí trên nhiễm sắc thể đến vị trí mới trên cùng nhiễm sắc thể hoặc trên nhiễm sắc thể khác. Khi xen vào giữa gene, yếu tố IS làm gián đoạn trình tự mã hóa và làm bất hoạt sự biểu hiện của gene. Một số trường hợp, có tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã, yếu tố IS làm cản trở sự biểu hiện ở sau promotor trong cùng operonĐoạn chèn. Yếu tố IS được tìm thấy đầu tiên ở operon gal của E. coli, chia làm bốn nhóm: IS1, IS2, IS3 và IS4. Phân bố rải rác trên nhiễm sắc thể chính của vi khuẩn và trên các plasmid IS1 có khoảng 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể, dài 768 bp IS 6110, 10 bản sao trên nhiễm sắc thể vi khuẩn laoĐoạn chèn. Đều chứa đoạn DNA mã hóa cho protein transposase, là enzyme cần thiết cho sự di chuyển của yếu tố IS. Đoạn gene này nằm giữa 2 đoạn lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ngắn. IS1 có IR có kích thước 18-23 bpCác yếu tố IS riêng lẻ không chỉ có khả năng tự di chuyển mà khi hai yếu tố này nằm đủ gần nhau thì chúng có thể vận động như một đơn vị hoàn chỉnh và mang theo các gene nằm giữa chúng  Cấu trúc phức tạp này được gọi là transposon.Gen nhảy (transposon)Năm 1951, tại phòng thí nghiệm 'Cold Spring Harbor' ở Long Island (New York) bà Barbara Mc Clintock dựa trên sự biến đổi màu sắc và các biến dị trên phôi của hạt ngô nảy mầm, đã xác định được các yếu tố kiểm soát hiện tượng này : thay đổi vị trí trong genome trong quá trình phát triển phôi và các biến đổi ấy có tác động sâu sắc lên sự biểu hiện của các gen đặc thù. Đó là hiện tượng các gen nhảy. Các đoạn cài chứa một hay nhiều gen có thể di chuyển trên cùng một nhiễm sắc thể hay di chuyển từ nhiễm sắc thể này sang nhiễm sắc thể khácTransposonCó hai kiểu transposon ở vi khuẩnTransposonTransposon đơn giản (simple transposon)  ở giữa các trình tự IR, ngắn (<50 bp)  không mã hóa cho transposase Tn3 là một transposon đơn giảnTransposon dài hơn yếu tố IS, thường ~vài kb, chứa các gene mã hóa cho protein thêm vào