Bài giảng Flavonoid & Dược liệu chứa Flavonoid

ym glucose glucosidase galactose galactosidase  L-rhamnose Taka-diastase* neohesperidose naringinase anthocyanin anthocyanase acid glucuronic glucuronidase c. Thủy phân bằng enzym Mỗi loại enzym sẽ thủy phân 1 vài glycosid nhất định. Các loại enzym này có bán sẵn trên thị trường. 69 7.1. Dùng ROH + nước - Thường : MeOH, EtOH (70-90%) nóng hoặc nguội. (thu được các glycosid + genin ph.cực + tạp ph.cực) - Loại tạp kém phân cực bằng các d.môi kém ph.cực - Kết tinh / tủa trong các dung môi thích hợp - Thu được genin + tạp kém ph.cực (ch’ béo, chlorophyll).  loại tạp tiếp bằng các phương pháp thích hợp. - Thường áp dụng với các polymethoxy flavonoid 7.2. Dùng d.môi ph.cực trung bình (Cf, DCM ...) 7. Chiết xuất Flavonoid 70 7.3. Dùng dãy dung môi - Ngấm kiệt với (ROH + H 2 O), - cô, loại tạp kém phân cực bằng cách lắc với EP. lớp nước chứa flavonoid + tạp phân cực (đường ...) - Lắc lớp nước này với Et 2 O rồi với EtOAc, lớp Et 2 O chủ yếu chứa genin, lớp EA chủ yếu chứa glycosid + ít genin còn sót lớp nước chủ yếu chứa ose, - tiếp tục phân lập bằng các kỹ thuật khác (SKC) - áp dụng với các glycosid phân cực 71 bột dược liệu dịch nước dịch nước Et 2 O EtOAc dịch cồn dịch Et 2 O dịch EtOAc các Flavonoid ROH thu hồi ROH 7. Chiết xuất Flavonoid 72 7.4. Dùng cồn acid - Ngấm kiệt bằng ROH loãng chứa 0.1% - 1% acid (HCl, AcOH, tartric, citric...). - Cô dịch chiết ở nhiệt độ thấp hoặc đông khô. - Loại tạp, rồi tinh chế bằng các ph.pháp thích hợp. - Áp dụng đối với các flavonoid kém bền. 7. Chiết xuất Flavonoid 73 7.5. Dùng cồn kiềm - Chiết dược liệu với (ROH + H 2 O) + NaOH - Trung hòa dịch (= acid vô cơ loãng), cô dung môi, - acid hóa, Flavonoid (glycosid & aglycon) sẽ tủa. - Tinh chế bằng (C* + ROH nóng) thu dịch cồn nóng - Để nguội, để lạnh  Flavonoid sẽ kết tinh. - Kết tinh lại lần 2, nếu cần. - Thường áp dụng với các Citro-Flavonoid / chi Citrus 7. Chiết xuất Flavonoid 74 dược liệu dịch cồn dịch nước dịch kiềm dịch nước Citroflavonoid cồn nóng thu hồi cồn H + +C*, cồn nóng, lọc cồn kiềm dược liệu trung hòa, cô bớt 7. Chiết xuất Flavonoid tủa F thô dịch lọc H + để nguội, lạnh 75 Phân lập Flavonoid Nói chung, Flavonoid là các hợp chất phân cực, khó phlập. Độ phân cực Flavonoid thì : kém hơn đường, tannin xấp xỉ saponosid, anthraglycosid mạnh hơn sapogenin > anthraquinon > phytosterol > coumarin, tinh dầu, chất béo. Trong Flavonoid, độ phân cực giảm dần theo dãy: glycuronid glycosid > glycosid bidesmosid > monodesmosid; polymer > monomer tri-OH > di-OH > mono-OH (aglycon) 76 Phân lập Flavonoid Để phân lập 1 hỗn hợp Flavonoid  các Flavonoid tinh khiết, có thể dùng các kỹ thuật : chiết phân bố (lỏng – lỏng) SKC phân bố đảo (Si-gel RP; Diaion HP-20) SKC phân bố thuận (Polyamid, Cellulose) SKC rây phân tử (Sephadex G, Sephadex LH-20) Đáng chú ý là SKC với Diaion HP-20 và các Sephadex Trên cột Si-gel pha thuận, Nhôm oxyt; với d.môi phân cực kém / trung bình : Flavonoid thường bị giữ lại ở đầu cột ! 77 Phân lập Flavonoid SKC Diaion HP-20 với (H 2 O – MeOH; MeOH %  dần) - Flavonoid sẽ ra sau đường, tannin (là những chất phân cực hơn Flavonoid) SKC Sephadex G/LH-20 với (H 2 O – MeOH) - thường thì Flavonoid sẽ ra sau tannin (thường, M của tannin > M của Flavonoid) - Flavonoid có M lớn sẽ ra trước, M nhỏ hơn sẽ ra sau 78 8.1.1. Với kiềm đặc-nóng Phá vỡ cấu trúc (  phloroglucinol) dùng để xác định cấu trúc flavonoid. 8. ĐỊNH TÍNH 8.1. Phản ứng với kiềm (KOH, NaOH) 8.1.2. Với kiềm loãng Flavonoid tăng màu (tạo phenolat, Δ ’ có Δ liên hợp) Th.khảo các bảng màu chuẩn  cấu trúc flavonoid 79 isoflavonoid Φ màu / vàng nhạt  vàng nhạt/vàng sậm flavanon Φ màu  vàng  cam – đỏ flavon, flavonol vàng nhạt / vàng  cam (oxy hóa  nâu) chalcon, auron vàng cam  đỏ - tía anthocyanin đỏ hay tím  xanh Trên giấy lọc, sắc đồ, dùng hơi NH 3 : Flavonoid sẽ tăng màu. trước khi + kiềm sau khi + kiềm 80 8.2. Phản ứng với acid + HCl + H 2 SO 4 AC  đỏ (chỉ thị màu) flavon, flavonol  vàng sậm, cam (huỳnh quang !) chalcon  mất màu (flavanon) isoflavon isoflavanon  vàng LAC  đỏ (AC) - flavanon - catechin - LAC - chalcon - auron  cam  đỏ 81 8.3. Phản ứng Cyanidin (Shinoda, Shibata, Pew) a. với Mg* / HCl đ.đặc Flavon(ol), Flavanon(ol) Chalcon b. với Zn* / HCl đ.đặc Chỉ Flavanonol  đỏ đậm / magenta Flavanon  không màu / hồng nhạt đỏ đậm / magenta  AC, màu đỏ Flavonoid bột Mg, Zn EtOH HCl đ.đặc + 82 Lắc sản phẩm của phản ứng Cyanidin với octanol - dạng glycosid : dịch màu đỏ / lớp EtOH (dưới) - dạng aglycon : dịch màu đỏ / lớp octanol (trên) PHÂN BIỆT GENIN / GLYCOSID * octanol glycosid aglyc o n * I.I. Samokish, A.L. Shinkarenko, V.A. Makarov (1969) 83 8.4.1. Với d.dịch FeCl 3 loãng Flavonoid + FeCl 3  phức xanh (nâu, lá, đen). - để sơ bộ nhận định số lượng nhóm OH / phân tử. - càng nhiều OH (đ.biệt là o-di-OH): màu càng đậm - các dẫn chất 3',4',5' tri-OH : tạo màu xanh đen 8.4. Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại  xanh rêu nhạt  xanh đen 84 8.4.2. Với dd. acetat chì : Tạo phức tủa có màu - dd. acetat chì kiềm :  tủa vàng nhạt đến sậm với hầu hết các flavonoid (và cả các polyphenol) - dd. acetat chì trung tính:  tủa vàng nhạt đến sậm với các flavonoid có ortho-di-OH phenol . Màu tủa thay đổi tùy số lượng và vị trí các nhóm thế. nghiên cứu Flavonoid  không dùng chì acetat để loại tạp 85 8.4.3. Với dung dịch AlCl 3 / ROH - Là thuốc thử tăng màu (shift reagent), dùng để khảo sát cấu trúc flavonoid bằng quang phổ UV. - dựa vào Δλ max ,  số lượng & vị trí các nhóm -OH / khung. Chú ý : Thuốc thử này chỉ quan sát rõ dưới UV 365 nm. Dưới ánh sáng thường: không thấy rõ sự th.đổi 8.4.4. Với thuốc thử Martini-Bettòlo (SbCl 5 / CCl 4 ) flavon  tủa màu vàng đến cam chalcon  tủa màu đỏ đến tím 86 Flavonoid / Na 2 CO 3 + th’.thử diazonium  đỏ cam / đỏ 8.5. Phản ứng với thuốc thử diazonium (hay dùng p-nitroanilin đã được diazo-hóa) các flavonoid (+) khi - có H ortho hay para / -OH - H này không bị cản trở lập thể - Khi có -OH /C7  sẽ ghép vào vị trí 6 hay 8 . - không đặc hiệu : (+) với nhiều polyphenol khác. 87 8.6. Định tính bằng phương pháp sắc ký (SKG, SKLM) Dịch cồn của flavonoid được sắc ký (1, 2 chiều) - SKG (Whatman 3MM...) hay - SKLM (Si-gel NP, RP-18, cellulose, polyamid) Dung môi khai triển thông dụng (xem Wagner, 1996) MW = MeOH - H 2 O (1:1) BAW = nBuOH - AcOH - H 2 O (4:1:5;  ) CAW = CHCl 3 - AcOH - H 2 O (30:15:2) TBA = tBuOH - AcOH - H 2 O (3:1:1) FORESTAL = AcOH - H 2 O - HCl (30:10:3) EtOAc-EMK-HCOOH-H 2 O (5:3:1:1) 88 Phát hiện : - Vis hoặc UV 365 nm (not 254 nm) trước / sau khi  phun thuốc thử (kiềm, AlCl 3 /HCl, NaBH 4 /MeOH...) - Các thuốc thử khác : FeCl 3 , Chì acetat, diazo ... cũng được dùng (kém đặc hiệu). - Chú ý sử dụng thuốc thử vanillin – HCl, FBS No. 15 và NP/PEG No. 28 (xem slide sau)* - So màu, Rf ... với các chất trong tài liệu tham khảo có thể xác định được flavonoid cần nghiên cứu. * K.R. Markham,Techniques of Flavonoid Identification, Academic Press, 1982 hay H. Wagner, Plant Drug Analysis, A TLC Atlas, Springer, 1996 89 Trên SKLM, còn phát hiện bằng 3 thuốc thử : a. vanillin/EtOH và HCl đđặc (4 : 1) - catechin, PAC, AC, DHC : đỏ / đỏ tím ngay sau khi sấy. - flavanon, flavanonol : xuất hiện màu rất chậm. - Dương tính khi (C) = dihydro- γ -pyron và (A) có cấu trúc phloroglucinol b. thuốc thử Fast Blue Salt B *** (FBS; No. 15) - các Flavonoid cho màu xanh / tím-xanh. - có thể phun chồng thêm dung dịch NaOH / KOH 10% từ 1960’s: FBS = muối diazo C 41 H 12 Cl 2 N 4 O 2 .x ZnCl 2 . M = 475.46 Hòa C = 1 mg / 1 ml MeOH 75%. 90 c. acid diphenylboric 2-aminoethylester (1% / MeOH) (Natural Products Reagent / PEG*; No. 28 ) ph. nhóm aglycon và g lycosid từ màu với NPR / PEG Flavon apigenin vàng lục luteolin cam Flavonol kaempferol, isorhamnetin vàng lục quercetin, myricetin vàng cam - Δ ’ 3-OH hay 3’, 4’-di-OH : cho màu cam sau khi sấy. - Δ ’ 4’-OH : cho màu lục hơi vàng sau khi sấy. 91 8. ĐỊNH TÍNH FLAVONOID 8.7. Phương pháp HPLC Tin cậy và thông dụng nhất hiện nay. Nguyên tắc : Trong cùng 1 điều kiện, mẫu M chứa X chuẩn X Hàm lượng chất X sẽ tỷ lệ thuận với diện tích peak. Với nồng độ chuẩn biết trước, từ diện tích peak đo được ở X chuẩn và X/mẫu  X% trong mẫu. cho peak có cùng thời gian lưu. 92 8.8. Khảo sát flavonoid bằng các ph.pháp vật lý khác - Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) - Khối phổ (MS) - HPLC ghép khối phổ (LC-MS) - Điện di mao quản (CE) . . . Khảo sát cấu trúc Định tính, Đ.lượng 93 Dùng bộ 6 thuốc thử : (1) : MeOH PA (2) : HCl đđặc / MeOH (3) : AlCl 3 5% / MeOH (4) : H 3 BO 3 / MeOH (5) : MeONa 5% / MeOH (6) : AcONa bột. Khảo sát cấu trúc Flavonoid : Đo sự dịch chuyển phổ UV của [Flavonoid + thuốc thử] so với phổ UV của [Flavonoid] Tham khảo 94 - Ghi nhận  max của Flavonoid / thuốc thử (  n ) - Lập các giá trị Δ  n = (  2 -  1 ), (  3 -  1 ), (  4 -  1 ),  (  5 -  1 ), (  6 -  1 ) - So sánh với các giá trị Δ  n trong Markham, 1981 **   số lượng và vị trí các nhóm –OH trong khung. Tham khảo ** K.R. Markham, Technique of Flavonoid identification, Academic Press, 1981, (Thư viện Bộ môn Dược liệu). 95 th.thử / MeOH  max ( n –  1 ) nm – OH ở MeOH  1 – – NaOMe  2 40 – 65 3 và/hay 4’ AcONa bột  3 08 – 20 7 40 – 65 4’ AcONa + H 3 BO 3  4 15 – 30 vic/B 05 – 10 vic/A AlCl 3  5 30 – 70 3, 5 50 – 60 vic/A, B AlCl 3 + HCl đđ  6  6   5 = – (30 - 40) vic/B  6   5 = – 20 tri–OH/B  6   5 = 0 3, 5  6   1 = 50 – 60 3, 5 96 Nguyên tắc chung - chiết kiệt flavonoid, loại tối đa tạp chất - chọn ph.pháp định lượng thích hợp tùy theo đối tượng chiết xuất (genin hay glycosid), yêu cầu (F toàn phần hay 1 chất cụ thể)... Vài phương pháp định lượng flavonoid 9.1. Phương pháp cân Sai số cao, áp dụng với dược liệu nhiều flavonoid, ví dụ rutin # 30% trong nụ Hòe 9. ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID 97 nụ hoa Hòe dịch chiết cồn dịch thủy phân quercetin chiết = EtOH 95% nóng + H 2 SO 4 2% nóng lọc thu tủa quercetin % rutin % 1 quercetin (M = 302.24) # 2,02 rutin (M = 610.51) thu hồi cồn loại tạp = HCl 0.5%, làm lạnh, lắng, cân 98 cho flavonoid tinh khiết + thuốc thử tăng màu (diazonium, NaOH, AlCl 3 /HCl...), đo độ hấp thu A ở λ max của các dẫn chất màu So gam mẫu chuẩn  [flavonoid] / mẫu. Với những chất đã biết A 1 : từ A tại λ tương ứng  nồng độ C trong mẫu thử 1 9.2. Định lượng bằng quang phổ UV 99 Định lượng Flavonoid Cột : Silica RP-18 Lichrosphere 250 x 4.6 mm; 5 µm Pha động: AcCN – H 2 O (20 : 80)  (40 : 60); đệm pH 2.5 (TFA); 1 ml / phút Detector: UV 365 nm 9.3. Định lượng bằng HPLC (thường kết hợp với SPE) Là phương pháp thông dụng, tin cậy. Nên chú ý. Áp dụng đối với dược liệu, chế phẩm, dịch sinh học 100 (1) rutin, (2) quercetin-3-glc, (3) quercitrin, (4) myricetin, (5) luteolin, (6) quercetin, (7) apigenin, (8) kaempferol (9) isorhamnetin 5 10 15 20 25 phút 0 Pha động: AcCN–H 2 O (20:80)  (40 :60); đệm pH 2.5 (TFA); 1 ml/phút 101 8.94 14.13 19.88 28.21 31.62 rutin quercitrin quercetin kaempferol isorhamnetin cột : Phenomenex Luna C-18 (250 x 4.6 mm) Detector : PDA (350 nm) Pha động : MeCN – ForOH 0.3% (15:85; 15 phút)  (25:75) 102 10.1. Vai trò của flavonoid đối với thực vật - Dẫn dụ côn trùng, giúp cho sự thụ phấn. - Bảo vệ cây / tia UV từ mặt trời, - Bảo vệ cây / côn trùng, nấm mốc, vi sinh vật. - ức chế enzym, điều hòa sinh trưởng,   tạo nốt sần cố định đạm / họ Fabaceae. 10. TÁC DỤNG SINH HỌC & CÔNG DỤNG 103 10.2. Đối với cơ thể động vật a. t’.dụng kiểu vit. P (bền thành mạch, chống xơ mạch, chống xuất huyết mao mạch ...).  Đặc biệt : nhóm flavon, flavonol (rutin, diosmin) b. chống co thắt kiểu papaverin (tricin, daidzein) c. kháng khuẩn (avicularin, guajaverin / Ổi Guajava). d. tác dụng kiểu estrogen : genistein, daidzein. e. kháng virus (luteolin, 3-OMe-Flavon). f. trị viêm loét, dị ứng (liquiritin / Cam thảo); g. hạ ure-huyết, lợi tiểu, trị viêm thận, trị bí tiểu quercitrin / Diếp cá; F / Lespedeza (Lespenephrin*) 104 - Rotenon : độc / cá, dùng để bắt cá, trừ cá / hồ nuôi tôm Rotenon còn diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypta. - Mackiain : giải nọc độc của rắn và nhện - eupatorin, eupatoretin, centaureidin: antitumour in vitro Tính antioxidant, tính ức chế gốc tự do, bảo vệ gan (của flavonoid); tính phytoestrogen (của isoflavonoid) hiện đang được quan tâm. 105 - ortho di-OH / vòng B :  kiểu vitamin P - –OMe ở vòng A, B :  kháng khối u - –OH hoặc –OMe / C3 + carbonyl / C4 + nối đôi / C2–C3 - 3 O-glycosid : mất tính kháng-virus. - vòng C : đóng/mở ; không/có nhóm –OH : không ảnh hưởng đến tính bảo vệ gan của Flav. :  kháng virus. sự liên quan cấu trúc // tác dụng 106 Hoạt tính kiểu vitamin P, antioxidant : - nhóm carbonyl ở C4 là cần thiết. - flavon tác dụng > flavanon tương ứng  ( Δ ở C2 – C3 là cần thiết !) - nhóm –OH tự do  (–OMe) :  tác dụng (nhóm –OH tự do là cần thiết) - di-OH > mono / tri-OH. - di-OH ortho > di-OH meta. sự liên quan cấu trúc // tác dụng 107 10.3. Sử dụng flavonoid trong ngành dược - TDSH : rộng rãi sử dụng