Báo cáo Đề tài Đánh giá tác động biến đổi khí hậu đến biến động tài nguyên nước lưu vực sông Nhuệ - Đáy thuộc thành phố Hà Nội

trưởng có thể kết dính trực tiếp acemannan, tạo sự ổn định và kéo dài khả năng kích ứng tạo mô tế bào.[12][33] Thí nghiệm tại Thái Lan (2013), Lô hội có khả năng điều trị nhiễm trùng huyết và nhiễm độc gan chuột.[18] Masatoshi và các cộng sự (1991), đã thử hoạt tính kháng viêm trên ổ viêm của chân chuột đực dòng Wistar (trọng lượng từ 130 – 150 g) của Aloenin, Barbaloin, Aloe – emodin, hỗn hợp rượu mạnh thẳng C26 – C32) và β – sitosterol cho thấy % ức chế tương ứng 41,7 %; 28,8 %; 39,9 %; 61,9 %; 69,3 % so với Aspirin 61,7 %.[19] Pecere và các cộng sự (2000), phát hiện Aloe – emodin là một tác nhân chống ung thư với hoạt tính chọn lọc đối với khối u và mô thần kinh sự. Hợp chất Anthraquinone: Aloe – modin, Aloe – emodin, Barbaloin (Aloin),Các chất trong nhóm này là thành phần có hoạt tính kháng khuẩn trong cây Lô hội, trong đó Aloin là chất có hoạt tính chính.[23] Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 18 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên Mulabagal và các cán sự (2005), đã tiến hành đánh giá hoạt tính kháng viêm của Emodin, Aloe – emodin và Barbaloin trên tế bào gốc thay vì sử dụng tế bào khối u như các thử nghiệm trước đây, cho thấy nồng độ ức chế 50 % (IC50) lần lượt là 120, 30, 200 µM. Kết quả cho thấy thành phần hóa học của Lô hội có hoạt tính kháng viêm đáng kể, do đó cung cấp một cơ sở khoa học cho việc điều trị của các quá trình kháng viêm trong y học dân gian.[21] Năm 2007, Lê Thị Bích Uyển, khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chất chiết thô từ cây lô hội.[36] Năm 2014, Nguyễn Thành Tài - Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và kháng vi sinh vật gây bệnh của cao chiết lá lô hội.[37] Năm 2007, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh và ThS. Phan Nhật Minh, Viện công nghệ hóa học tại TP.HCM (Viện KH&CN Việt Nam) đã nghiên cứu quy trình chiết xuất Aloin từ lô hội.[38] 1.3. Các phương pháp chiết tách cao vỏ lá Lô hội[43] Chiết tách là phương pháp sử dụng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan các chất cần tách ra các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi được gọi là dịch chiết và phần không tan được gọi là bã dược liệu. Trong quá trình chiết tách sẽ xảy ra quy trình sau: Quá trình khuếch tán hay gọi là quá trình chuyển khối: là quá trình di chuyển vật chất từ pha này sang pha khác khi hai pha tiếp xúc trực tiếp với nhau. Quá trình thẩm thấu: là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất bán thấm, có nghĩa là màng đó chỉ cho dung môi đi qua mà không cho chất tan đi qua. Quá trình thẩm tích: là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất thẩm tích, có nghĩa là màng đó không chỉ chi dung môi đi qua mà còn cho cả chất tan đi qua, nhưng chỉ cho qua những chất có phân tử nhỏ. Các giai đoạn của quá trình chiết tách:  Giai đoạn 1: khuếch tán nội bao gồm các hiện tượng chuyển chất tan ra lớp dịch chiết ở ngoài mặt dược liệu, chủ yếu là quá trình khuếch tán qua các lỗ xốp màng tế bào và sự khuếch tán phân tử.  Giai đoạn 2: khuếch tán các chất từ bề mặt dược liệu đến các lớp dược liệu. Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 19 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên  Giai đoạn 3: khuếch tán theo dòng chuyển động của dịch chiết. 1.3.1. Phương pháp ngâm kiệt Phương pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt không có sự tham gia của nhiệt độ và khuấy trộn: Nguyên tắc của phương pháp: Khi cho dung môi vào bột dược liệu, do trọng lực dung môi chảy xuống các khe hở trong dược liệu. Trong thời gian dung môi được giữ lại và tiếp xúc với dược liệu, hoạt chất được hòa tan. Sau đó dịch chiết được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định, lớp dung môi này ngấm vào trong khối dược liệu và đẩy dịch chiết (lớp dung môi cũ đã hòa tan dược chất) ra ngoài. Lớp dung môi mới tiếp tục hòa tan các hoạt chất còn trong tế bào dược liệu. 1.3.2. Phương pháp chiết Soxhlet Là phương pháp ngâm nóng nhiều làn với một lượng nhỏ dung môi, đươc thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Nguyên tắc của phương pháp: Khi nhiệt độ đạt tới nhiệt độ sôi của dung môi, dung môi bốc hơi lên theo đường ống dẫn hơi của thiết bị và khi lên tới ống ngưng thì dung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh ngưng tụ thành thể lỏng rớt thẳng xuống dược liệu đặt trong ống chiết. Tại đây, dung môi ngấm vào dược liệu và chiết kiệt những chất hữu cơ nào có thể hoà tan. 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết 1.3.3.1. Nguyên liệu Mức độ phá vỡ của môi: Việc phá vỡ tối đa cấu trúc tế bào nguyên liệu tạo điều kiện tiếp xúc triệt để của chất tan và dung môi. Độ ẩm của vật liệu: Độ ẩm cao sẽ làm chậm quá trình khuếch tán và gây ra sự dính bết giữa các phân tử. Nước còn lại trong nguyên liệu sẽ liên kết protein và các chất háo nước khác, điều này ngăn chặn sự thấm của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán phân tử và đối lưu. 1.3.3.2. Dung môi Dung môi cần chọn sao cho có khả năng hoà tan tối đa các thành phần dược liệu. Việc lựa chọn dung môi dựa trên các vấn đề sau: Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 20 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên Độ phân cực của dung môi: Dung môi ít phân cực thì dễ hoà tan các chất không phân cực và khó hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hoà tan các chất ít phân cực. Người ta phân loại dung môi dựa vào độ phân cực như sau:  Dung môi không phân cực: ether dầu hoả, xăng, hexan, heptan, benzen, toluen,...  Dung môi phân cực yếu và vừa: chloroform, diclorethan, aceton, ethyl acetat,...  Dung môi phân cực mạnh: nước, glycerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn (methanol, ethanol, isopropanol...) Độ phân cực của một số dung môi được thể hiện ở bảng sau: Bảng 1. 1: Độ phân cực của các dung môi Tên dung môi P Hexan 0.0 Ether dầu hoả 2.9 Ethyl Acetate 5.3 Ethanol 8.8 Methanol 12.5 1.3.3.3. Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu Với khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định, khi lượng dung môi gia tăng, quá trình chiết diễn ra nhanh chóng và lượng dầu còn lại trong bã sẽ giảm. 1.3.3.4. Nhiệt độ Trong công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa, khi tăng nhiệt độ thì độ nhớt của dug môi giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. 1.3.3.5. Thời gian tách chiết Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 21 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (hoạt chất) sẽ được hoà tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng thấp. Do đó, thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu, nhưng nếu thời gian chiết dài quá dịch chiết lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. 1.4. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp khảo sát khả năng kháng vi sinh vật[44] 1.4.1. Giới thiệu một số loài vi khuẩn Khả năng kháng khuẩn của cao Lô hội đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba chủng Gram âm (Escherichia coli (E.coli) – ATCC 43895, Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005). 1.4.1.1. Escherichia coli Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học. Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề "Darmbakteriendes Säuglings und ihre Beziehungenzur Physiologie der Verdauung”.  Phân loại khoa học: - Giới (Kingdom): Bacteria - Ngành (Division): Proteobacteria - Lớp (Class): Gammaproteobacteria - Bộ (Order): Enterobacteriales - Họ (Family): Enterobacteriaceae - Giống (Genus): Escherichia - Loài (Species): E.coli Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi khuẩn có hình roi tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng. Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 22 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ. Hình 1. 21: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn E.coli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng không thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác. Sinh trưởng ở 15 – 40 ℃ nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37 ℃, pH từ 6.4 – 7.4. Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục khoảng 2 – 3 mm.  Độc tố: - Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể dẫn đến bệnh nặng. - Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ tăng. - Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác trong cơ thể. 1.4.1.2. Bacillus cereus Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.  Theo phân loại khoa học: - Giới (Kingdom): Bacteria Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 23 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên - Ngành (Division): Firmicutes - Lớp (Class): Bacilli - Bộ (Order): Bacillales - Họ (Family): Bacillaceae - Giống (Genus): Bacillus - Loài (Species): Bacillus cereus Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0.5 – 1.5 x 2 – 4 mm. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.  Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 oC, tối ưu 35 – 40 oC, độ ph 4.5 – 9.3; thích hợp 7 – 7.2. - Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. - Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng. - Trên môi trường MYP: khóm hồng chung quanh có vòng sáng. - Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng. - Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn. Hình 1. 22: Vi khuẩn Bacillus cereus trên kính hiển vi  Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố - Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng. - Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 24 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày. Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. 1.4.1.3. Salmonella Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz xác định Salmonella cholerasuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn. Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacilus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là Salmonella enteritidis.  Phân loại khoa học: - Giới (Kingdom): Bacteria - Ngành (Division): Proteobacteria - Lớp (Class): Gammaproteobacteria - Bộ (Order): Enterobacteriales - Họ (Family): Enterobacteriaceae - Giống (Genus): Salmonella lignieres 1900 Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0.7 µm đến 1.5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Phát triển tốt ở 6 ℃ – 42 ℃, thích hợp nhất là 35 ℃ – 37 ℃, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất là 7.2 . ở nhiệt độ 18 ℃ – 40 ℃ vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. Trên môi trường phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường chuyển sang màu vàng. Hình 1. 23: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 25 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên  Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: - Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. - Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kị khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột. 1.4.1.4. Staphylococcus aureus Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng. Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.  Phân loại khoa học: - Giới (Kingdom): Eubacteria - Ngành (Division): Firmicutes - Lớp (Class): Bacilli - Bộ (Order): Bacillales - Họ (Family): Staphylococcaceae - Giống (Genus): Staphylococcus - Loài (Species): Staphylococcus aureus Hình 1. 24: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 26 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên và thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ. Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người. Phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S. aureus là 18 – 40 ℃, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 ℃, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S.aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao. Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35 – 37 ℃. Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác.  Độc tố - Enzym: - Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm - Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15℃ hơn cả vi khuẩn. - Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S.aureus là một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 ℃ và có thể tồn tại nhiệt ở 100 ℃ trong vòng 30 – 700 phút. - Các enzyme ngoại bào: Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 27 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên • Protease phân giải protein của tế bào chủ. • Lipase phân giải lipid. • Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME). 1.4.1.5. Pseudomonas aeruginosa Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92 loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan nhiều đến y học. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực. Có pili, không bào tử.  Phân loại khoa học: - Giới (Kingdom): Bacteria - Ngành (Division): Proteobacteria - Lớp (Class): Gamma proteobacteria - Bộ (Order): Pseudomonadales - Họ (Family): Pseudomonas - Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa Hình 1. 25: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi  Sức đề kháng: - Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá. - Có khả năng đề kháng kháng sinh cao.  Kháng nguyên: - Kháng nguyên liên kết với tế bào: + Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh. Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 28 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên + Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những chủng P. aeruginosacó khuẩn lạc dạng M và dạng R. - Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch.  Phân loại trực khuẩn mủ xanh: Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa. Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95 % số chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định type kháng nguyên O chia P. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16).  Nội độc tố: Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết.  Ngoại độc tố: Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng. Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 29 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên 1.4.2. Phương pháp khuếch tán đĩa Nguyên tắc: Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37 oC. Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 100μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường MHA đặc. Chuẩn bị dịch thử bằng cách hòa tan cao trong DMSO 5% thành các nồng độ theo yêu cầu.. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10g/ml, Tetracyclin 30 g/ml, Amoxilin 10g/ml); đối chứng âm là DMSO 5%. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo đường kính (DK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: DK (mm) = D - d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch (giếng). Hình 1. 26: Đĩa petri có sẵn môi trường và vi khuẩn 1.5. Phương pháp định danh bằng sắc ký ghép khối phổ GC/MS[41] Hệ thống sắc ký khí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc ký khí nối với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bỏ khí mang N2, He để giảm áp suất của dòng áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc ký dùng mao quản, phần khối phổ sử dùng buồng ion hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ. GC – MS bao gồm:  Sắc ký khí ( GC): sắc ký khí là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích, các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh. Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 30 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên  Khối phổ (MS): khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm được ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân không cao (10 – 6 mmHg). Sau quá trình ion hóa, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một điện trường, được tách trong một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và điện tích của chúng và ghi nhận theo cường độ của các hạt đó. Dùng để xác định định định tính và định lượng. Hình 1. 27: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động: - Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí. - Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. nhiệt độ của lò này dao động từ 40 – 320 oC. - Cột (cloumn): Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này. Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc. Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 31 Chủ nhiệm: Nguyễn Than