Chuyên đề Amino axit, Peptit và Protein

rường, aminoaxit di chuyển về phía điện cực nào khi (a) pH pI và pH = pI ? Giải thích. (a) pH pI : anion C chiếm ưu thế nên di chuyển về phía anot và (c) khi pH = pI điện tích cân bằng nên amino axit không chuyển dịch. Viết cân bằng điện ly của lysin (một bazơ) và tính điểm đẳng điện của nó. Xem giá tri pKa trong bảng 22-2. ¨ (+2) (+1) (0) (-1) Điện tích tổng cộng của mỗi dạng được ghi trong ngoặc đơn ở trên, dạng có điện tích bằng không tồn tại giữa hai dạng có pKa tương ứng là 8,95 và 10,53. Như vậy pI = (8,95+10,53)/2 = 9,74. Bảng 22-2 . Tính axit-bazơ của amino axit. Amino axit Mạch nhánh trung hòa pK*a 1 pK*a 2 pI Glycin 2,34 9,60 5,79 Alanin 2,34 9,69 6,00 Valin 2,32 9,62 5,96 Leucin 2,36 9,60 5,98 Isoleucin 2,36 9,60 5,98 Methionin 2,28 9,21 5,74 Prolin 1,99 10,60 6,30 Phenylalanin 1,83 9,13 5,48 Tryptophan 2,83 9,39 5,89 Asparagin 2,02 8,80 5,41 Glutamin 2,17 9,13 5,65 Serin 2,21 9,15 5,68 Threonin 2,09 9,10 5,60 Amino axit Mạch nhánh ion pK**a 1 pKa 2 pKa 3 pI Axit aspatic 1,88 3,65 9,60 2,77 Axit glutamic 2,19 4,25 9,67 3,22 Tyrosin 2,20 9,11 10,07 5,66 Cystein 1,96 8,18 10,28 5,07 Lysin 2,18 8,95 10,53 9,74 Arginin 2,17 9,04 12,48 10,76 Histidin 1,82 6,00 9,17 7,59 * Trong tất cả các amino axit pKa1 ứng với sự điện ly của nhóm cacboxyl và pKa2 ứng với sự điện ly của nhóm amoni. ** Trong tất cả các amino axit pKa1 ứng với sự điện ly của nhóm cacboxyl trong RCH(+NH3)COOH. Lập lại bài tập 13 cho sự phân ly của axit aspatic. ¨ (+1) (0) (-1) (-2) Dạng có điện tích bằng không tồn tại giữa hai dạng có pKa tương ứng là 1,88 và 3,65. Như vậy pI = (1,88 + 3,65)/2 = 2,77. (a) Phân loại các amino axit trong bảng 22-1 theo ảnh hưởng gốc R của chúng đến giá trị điểm đẳng điện pI. (b) pH trong dịch của tế bào có giá trị trong khoảng từ 6 đến 7, dạng nào của amino axit (cation, anion, lưỡng cực) chiếm ưu thế trong tế bào ? (a) Các amino axit với gốc R trung hòa (hidrocacbon, amit, rượu) có giá trị pI nằm trong khoảng giống nhau (5,5 - 6,3). (b) Các amino axit chủ yếu tồn tại ở dạng lưỡng cực, do pH của tế bào rất gần với giá trị pI của chúng. Giá trị điểm đẳng điện của các amino axit loại axit nằm trong khoảng axit, với pH từ 6 đến 7 chúng tồn tại phần lớn ở dạng anion. Giá trị điểm đẳng điện của các amino axit loại bazơ nằm trong khoảng bazơ, trong tế bào chúng nhận proton H+ và tồn tại chủ yếu ở dạng cation. Cystein (chứa nhóm -SH) và tyrosin (chứa nhóm phenolic -OH) là những axit rất yếu, cả hai có pI trong khoảng 5 - 6 và được xếp vào loại amino axit trung hòa. Viết công thức cấu tạo của histidin tại pH < 1,28 và viết phương trình cho biết proton nào tách ra khi pH tăng đến trên 1,82. ( H+ tách ra từ nhóm cacboxyl) Công thức phù hợp nhất cho mononatri glutamat (bột ngọt, một loại gia vị thường được sử dụng) là gì ? Na+[-OOCCH2CH2CH(+NH3)COO-] Trình bày phương pháp tách và nhận biết amino axit trên cơ sở của sự điện di. Nếu đặt một băng giấy lọc tẩm ướt bởi dung dịch hỗn hợp amino axit giữa hai điện cực thì các phân tử mang điện sẽ chuyển dịch về phía điện cực này hoặc điện cực kia với một vận tốc nào đó phụ thuộc vào điện tích của chúng và điện thế được áp dụng. Điện tích của phân tử lại phụ thuộc pH. Băng giấy lọc sẽ đổi màu do phản ứng của thuốc thử với amino axit, so sánh vị trí của màu hình thành trên băng giấy và mẫu chuẩn sẽ xác định được amino axit. Chọn pH để tách một hỗn hợp gồm axit aspatic, threonin và histidin bằng phương pháp điện di. Giải thích sự lựa chọn đó. Sử dụng pH = 5,60. Đây chính là pI của threonin (xem bảng 22-2), do vậy amino axit này không dịch chuyển. Axit aspatic (pI = 2,77) nhường proton tạo thành anion nên dịch chuyển về phía anot. Histidin (pI = 7,59) nhận proton tọa thành cation, di chuyển về phía catot. Làm thế nào để tách lysin (pI = 9,6) ra khỏi glycin (pI = 5,97) bằng phương pháp điện di ? Áp điện vào một bản giấy lọc tẩm dung dịch hỗn hợp hai amino axit trên. Điều chỉnh pH đến 5,97 hoặc 9,6. Tại pH = 5,97, glycin sẽ không chuyển động, còn lysin chuyển đến catot. Tại pH = 9,60, lysin sẽ không chuyển động còn glycin chuyển về phía anot. Trình bày phương pháp tách hỗn hợp amino axit bằng sắc kí trao đổi ion. Nhồi đầy cột bằng nhựa trao đổi ion có lớp chất mang trên bề mặt. Sử dụng nhựa trao đổi cation khi hầu hết các amino axit là cation (ví dụ R-SO3-Na+ trao đổi ion Na+ của nó với các amino axit tích điện dương trong môi trường axit). Quá trình tách diễn ra phụ thuộc tốc độ chuyển động xuống của các amino axit tích điện dương khi xảy ra sự trao đổi ion. Tốc độ chuyển động tỉ lệ nghịch với độ lớn của điện tích dương trong phân tử amino axit. Ví dụ các amino axit loại bazơ như lysin, asginin và histidin có điện tích +2 tại pH = 3 sẽ trao đổi với Na+ đầu tiên, chúng chịu lực hút mạnh nhất, di chuyển chậm nhất nên sẽ thu đựoc ở đỉnh cột. Các amino axit có mức điện tích trung gian +1 chịu lực hút ít hơn, di chuyển nhanh hơn nên bị hấp thụ phía cuối của cột. Sau đó quá trình rửa giải, thu hồi, phân tích mỗi phần và ghi nhận dữ liệu được thực hiện tự động nhờ máy phân tích amino axit. ĐIỀU CHẾ Điều chế valin Me2CHCH(+NH3)COO- bằng : (a) phản ứng Hell-Volhard-Zelinsky, (b) kử amin hóa, (c) tổng hợp Gabriel. (a) Me2CHCH2COOH Me2CHCHBrCOOHVal (b) Me2CHCOCOOH Val (c) Điều chế : (a) methionin, MeSCH2CH2CH(+NH3)COO- (Met) và (b) axit aspatic HOOCCH2CH(+NH3)COO- (Asp) từ dietylmalonat (DEM). Đầu tiên monobrom hóa DEM, rồi cho sản phẩm tác dụng với K phtalimit để tạo este N-phtalimidomalonic (B). (a) (EtOOC)2CH2 (EtOOC)2CHBr (A) (b) Điều chế : (a) leucin (Leu) và (b) tyrosin (Tyr) từ dietyl axetamidomalonat (C) DEM + HONO ® [O=N-CH(COOEt)2] ® HO-N=C(COOEt)2 AcNHCH(COOEt)2 (C) (a) (b) Sử dụng tổng hợp Strcker để điều chế phenylalanin (Phe) Sử lý một andehit với NH3 và CN - tạo ra một a-aminonỉtil, thủy phân chất này tạo sản phẩm là một a-amino axit . PhCH2CHO PhCH2CH(NH2)CN PhCH2CH(+NH3)COO- (Phe) Nếu các bước tổng hợp Strecker tạo một amino axit. R-CHO+:NH3 D R-CH=NHR-CH( -NH)CNRCH(NH2)CNRCH(+NH3)COO- imin a-aminonỉtil a-amino axit Viết công thức cấu tạo các chất từ G đến I : MeSH +CH2=CHCHO® G [H]I G là MeSCH2CH2CHO, hình thành do cộng kiểu Michael; H là sản phẩm tổng hợp Streker sau đó tạo sản phẩm là methionin I. [MeSCH2CH2CH(NH2)CN] ® MeSCH2CH2CH(+NH2)COO- H I Trình bày phương pháp tổng hợp prolin từ axit hexandioic (axit adipic). Chuyển một nhóm -COOH thành -NH2 qua thoái phân Hofmann. Nhóm -CH2COOH còn lại chuyển thành -CHBrCOOH bằng phản ứng Hell-Volhard-Zelinsky, sau đó khép vòng SN2. HOOC(CH2)3CH2COOH H2NCO(CH2)3CH2COOH H2N(CH2)3CH2COOH H2N(CH2)3CHBrCOOH Pro Mô tả hai phương pháp chuyển hỗn hợp racemic của amino axit thành các đối quang của chúng. Phải sử dụng một tác nhân bất đối. (1) Nhóm -NH3+ của amino axit racemic được dấu bằng cách chuyển thành một amit, sau đó cho nhóm -COOH tự do phản ứng với một đối quang của một bazơ bất đối. Hai muối là đồng phân dia được hình thành qua sự kết tinh phân đoạn. Sau đó tách bazơ và thủy phân nhóm amit. Cũng có thể este hóa nhóm -COO-, sau đó một đồng phân đối quang của một axit bất đối được sử dụng để hình thành hai muối amoni là đồng phân dia. Kết tinh phân đoạn, tách axit và thủy phân hoàn toàn este. (2) Phản ứng của một đối quang được xúc tác bởi enzim. Đầu tiên, amino axit được chuyển thành dẫn xuất N-axetyl. Sau đó ủ với một lượng nhỏ enzim, enzim này làm xúc tác cho quá trình thủy phân L-amino axit đã được axetyl hóa, trong khi D-amino axit không đổi. Tách L-amino axit ra khỏi N-acetyl-D-amino axit có thể làm được dễ dàng do amino axit là một chất lưỡng tính còn amit lại là axit. Thủy phân cẩn thận N-acetyl-D-amino axit (để tránh hiện tượng racemic hóa) thu được D-amino axit. (a) Sử dụng enzim transaminaza để điều chế một a-amino axit bất đối như thế nào ? (b) Viết chất tham gia phản ứng điều chế axit aspartic bất đối bằng phản ứng chuyển vị amin này. (c) Cho biết đặc thù lấp thể của nó. (a) Trong sự có mặt của enzim transaminaza, axit L-glutamic phản ứng với a-xetoaxit cơ sở của L-amino axit cần điều chế trong sự chuyển đổi đặc thù lập thể mà vẫn giữ tính bất đối (bài tập 84). Đặc trưng là Glu đã nhường nhóm amin trong quá trình chuyển vị amin. RCOCOOH + HOOCCH2CH2CH(+NH3)3COO-RCH(+NH3)COO- + HOOCCH2CH2COCOOH a-xetoaxit axit L-glutamic L-aminoaxit axit a-xetoglutaric (b) HOOCCH2COCOOH axit oxaloaxxetic (c) Axit aspatic có cấu hình L do cấu hình được giữ nguyên trong quá trình chuyển vị amin (a) Quan hệ giữa chất tham gia và sản phẩm trong phản ứng chuyển vị amin là gì ? (b)Cần dùng a-xetoaxit nào để tạo (i) alanin, (ii) leucin, (iii) serin và (iv) glutamin ? (c) Amino axit nào không thể điều chế bằng phương pháp chuyển vị amin ? (a) axit glutamic + axit oxaloaxetic ® axit a-xetoglutaric + axit aspatic oxi hóa -1 khử -1 khử - 2 oxi hóa - 2 (b) (i) CH3COCOOH (ii) (CH3)2CHCH2COCOOH (iii) HOCH2COCOOH (iv) H2NCOCH2CH2COCOOH (c) Prolin và hydroxyprolin, do chúng là amin bậc 2, chỉ có các amin bậc 1 mới tham gia loại phản ứng này. Từ axit acrilic điều chế : (a) axit g-aminobutyric, chất truyền thông tin thần kinh có tên gọi GABA, và (b) axit b-aminopropionic (b-alanin), một thành phần của vitamin B3 (axit pantothenic C9H17O5N). (a) Nhóm CN - phản ứng với axit acrilic bằng phản ứng cộng kiểu Michael đưa thêm nhóm -NH2 và C vào : CN - + H2C=CHCOO- NºCCH2CH2COO- H3N+CH2CH2CH2COO- (b) H3N: + H2C=CHCOO- ® H2NCH2CH2COO- H3N+CH2CH2COO- PHẢN ỨNG (a) Cho biết sản phẩm của phản ứng giữa alanin MeCH(+NH3)COO- với : (i) (CH3CO)2O, (ii) EtOH/HCl, (iii) PhCOCl/NaOH, và (iv) Ba(OH)2. (b) Cho biết sản phẩm của phản ứng giữa HONO với (i) RCH(+NH3)COO- và (ii) RCH(NH2)COOEt. (a) Amino axit tham gia phản ứng theo tính chất đặc trưng của nhóm cacboxyl và nhóm amin (i) CH3CONHCHMeCOOH (N-axyl hóa) (iii) PhCONHCHMeCOO-Na+ (N-axyl hóa và tạo muối) (ii) Cl-H3N+CHMeCOOEt (este hóa) (iv) (H2NCHMeCOO)2-Ba2+ (tạo muối) (b) (i) HOCHRCOOH + N2 và (ii) -N=+N=CRCOOEt (tạo este etyl của axitdiazo bởi sự mất nguyên tử Ha). Khi đun nóng, amino axit đề hidrat hóa liên phân tử tạo diamit vòng. (a) Viết sản phẩm phản ứng nếu xuất phát từ glyxin. (b) Khi đun nóng este metyl của rac-alanin thì tạo thành hai đồng phân lập thể dia, một trong hai phân tử có khả năng quang hoạt. Viết công thức cấu tạo và cho biết hóa học lập thể của chúng. Dạng cis có thể phân ly được (a) (b) cis, racemic trans, mezo Cho biết cấu tạo sản phẩm tạo thành khi đun nóng : (a) b-amino axit, (b) g-amino axit, (c) d-amino axit và (d) e-amino axit. (a) RCH=CHCOO-NH4+ (b) (c) (d) +NH3(CH2)5COO- ® -NH(CH2)5CO-NH-(CH2)5CO- (nylon 6) Sự khép vòng nội phân tử 7 cạnh xảy ra khó khăn, nên đã dễ dàng xảy ra phản ứng liên phân tử. Vì chất đầu có hai nhóm chức, nên đã xảy quá trình polime hóa. Điều chế (a) este etyl N-acetylphenylalanin và (b) este metyl N-benzoylhistidin từ amino axit tương ứng. (a) PhCH2CH(+NH3)COO-+ EtOHPhCH2CH(+NH3)COOEtPhCH2CH(NHCOCH3)COOEt Quá trình axyl hóa nhóm amin xảy ra sau quá trình este hóa để tránh sự thủy phân liên kết peptit trong môi trường axit (của phản ứng este hóa). (b) Do quá trình este quá được tiến hành bằng CH2N2 nên có thể axyl hóa trước. PEPTIT VÀ PROTEIN (a) Liên kết peptit là gì ? (b) Phân biệt một peptit, oligopeptit, polipepetit và protein. (c) Cho biết phương thức chuẩn mô tả trật tự liên kết của các aminoaxit trong phân tử peptit. (d) Gọi tên tripeptit Tyr.Thr.Try. (a) Liên kết peptit (amit) : (b) Peptit là một amit được hình thành bằng phản ứng liên phân tử giữa nhóm amin của amino axit thứ nhất với nhóm cacboxyl của amino axit thứ hai. Từ hai amino axit (giống hoặc khác nhau) tạo ra một dipeptit, ba amino axit tạo một trpeptit...Nếu có từ 4 đến 10 mắt xích amino axit, peptit được gọi là oligopeptit. Polipepetit là một mạch gồm nhiều amino axit. Trong thực tế sử dụng thường không phân biệt rõ ràng hai thuật ngữ peptit và polipeptit. Protein cấu thành từ một hay nhiều mạch peptit mà mỗi mạch như vậy chứa tới vài trăm amino axit. Tổng số mắt xích có thể dao động từ 50 đến trên 1000. (c) Theo qui định, amino axit chứa nhóm amin tự do (N-đầu mạch) được viết bên trái và amino axit chứa nhóm cacboxyl tự do (C-cuối mạch) được viết bên phải. Tiếp vị ngữ "in" được thay thế bằng "yl" cho tất cả các amino axit trong mạch từ trái sang phải, trừ amino axit có nhóm cacboxyl tự do (C-cuối mạch) là được giữ nguyên. (d) Tyrosylthreonyltryptophan (Chú ý rằng tryptophan là amino axit duy nhất có tên gọi không kết thúc bằng "in"). (a) Gọi tên các dipeptit khác nhau được hình thành từ alanin và glyxin. (b) Sử dụng alanin, glyxin và tyrosin có thể tạo được bao nhiêu tripeptit ? (c) Trong số các peptit của câu (b) có bao nhiêu phân tử đồng thời chứa cả 3 loại amino axit ? (d) Có bao nhiêu tetrapeptit được hình từ 3 amino axit của câu (b) ? (a) Bốn dipeptit : Ala.Ala; Ala.Gly; Gly.Ala; Gly.Gly. (b) 3´3´3 = 33 = 27 tripeptit. (c) 3´2´1 = 3! = 6 tripeptit. (d) 34 = 81 tetrapeptit. Giải thích tại sao liên kết C-N trong nhóm peptit lại ngắn hơn và bền hơn liên kết đơn C-N thông thường và tại sao việc quay liên kết này bị hạn chế ? Liên kết C-N của peptit có một phân tính chất của liên kết đôi do sự dịch chuyển electron không liên kết trên nguyên tử N về phía nguyên tử O của nhóm C=O, các nguyên tử trong nhóm CO-N đồng phẳng. Viết công thức cấu tạo cho (a) alanylvalin và (b) valylalanin (a) MeCH(+NH3)CO-NHCH(CHMe2)COO- (b) Me2CH CH(+NH3)CO- NHCH(Me)COO- Cho nhận xét về quá trình tổng hợp được đề nghị dưới đây : H3N+CHRCOO- H3N+CHRCOCl H3N+CHRCOCl + H3N+CHR'COO- ® H3N+CHRCONHCHR'COO- Trong quá trình cộng tạo ra sản phẩm mong muốn, phân tử clorua axit sẽ phản ứng với phân tử khác tạo dipeptit, sau đó các dipeptit lại phản ứng tiếp tạo peptit cao hơn : H3N+CHRCOCl + H3N+CHRCOCl ® H3N+CHRCONHCHRCOCl ® ... Nếu không bảo vệ nhóm amin thì không thể đảm bảo rằng phân tử chỉ phản ứng ở nhóm -COOH của nó. Đồng thời cũng nên để ý rằng HCl sinh ra trong sản phẩm sẽ gây ra sự racemic hóa và tạo điều kiện cho phản ứng thủy phân liên kết peptit xảy ra. Như vậy quá trình tổng hợp trên là không thể được. Nêu nguyên tắc bảo vệ nhóm chức trong tổng hợp peptit. Trước hết, các nhóm amin và cacboxyl không tham gia liên kết peptit phải được che để không còn khả năng phản ứng, sau đó che luôn các nhóm chức có khả năng phản ứng trong gốc R, để ngăn cản không cho chúng tham gia vào các bước tổng hợp kế tiếp. Phương pháp bảo vệ được chọn ở đây phải không gây ra sự racemic hóa và không làm biến đổi cấu trúc hóa học của mạch nhánh. Sau khi hoàn thành quá trình tổng hợp, các nhóm đã bảo vệ phải được giải phóng trở lại như lúc đầu bằng một phương pháp thật em dịu để đảm bảo không gây ra sự sắp xếp lại, sự racemic hóa hay sự phân cắt liên kết peptit. (a) Cho biết sản phẩm tạo thành trong phản ứng giữa p-toluensulfonyl clorua với một amino axit. (b) Làm thế nào để giải phóng nhóm tosyl ? (c) Có nhóm chức nào khác bị khử ? (a) H3N+CHRCOO- p-MeC6H4SO2NHCHRCOOH (b) Na trong NH3 lỏng. Riêng nhóm sulfonyl thơm bị khử. Bất cứ este của axit cacboxilic nào : -COOR ® -CH2OH (+HOR), nhóm disulfua : -S-S- ® 2-SH (a) Benzyl clocacbonat PhOCOCl (cũng còn gọi là cacbobenzoxy clorua - CBzCl) là một tác nhân thông dụng bảo vệ nhóm amin của một amino axit. Viết công thức cấu tạo sản phẩm phản ứng của nó với một amino axit. (b) Làm thế nào để giải phóng nhóm này ? (a) PhCH2O-CO-NH-CH(R)COOH (A), hoặc CBz-NH-CH(R)COOH. Sản phẩm là một uretan (một cacbamat), hoặc semieste và semiamit của axit cacbonic. (b) Thủy phân có xúc tác tách liên kết benzyl-O hình thành một axit cacbamic không bền, axit này tiếp tục đề cacboxilat hóa. A PhCH3 + [HOOCNHCHRCOOH] ®CO2 + RCH(+NH3)COO- Nếu mạch nhánh chứa S (một chất độc đối với xúc tác Pd) thì khi đó phải dùng Na trong NH3 lỏng. Một nhóm khác có thể bảo vệ nhóm -NH2 là t-butoxycacbonyl (Boc) t-BuO=O, xuất phát từ t-butylcacbonat hoặc t-butoxycacbonyl azit. (a) Viết công thức cấu tạo dẫn xuất Boc của một amino axit. (b) Làm thế nào để giải phóng nhóm này ? (a) t-BuOCO-NHCHRCOOH (b) Vì nhóm bảo vệ là một este t-butyl nên có thể thủy phân dễ dàng trong axit khan (CF3COOH hoặc HBr trong HOAc). Quá trình tách tạo t-Bu+ và một axit cacbamic, axit này phân hủy cho ra CO2 và amino axit. ® t-Bu+ + ® CO2+H3N+CHRCOO-+Me2C=CH2 + H+ Tổng hợp dipeptit glyxylprolin CBzCl + H3N+CH2COO- CBzNHCH2COOH CBzNHCH2COCl ® + CO2 + PhCH3 Làm thế nào để bảo các nhóm chức trên mạch nhánh sau trong suốt quá trình tổng hợp peptit ? Làm thế nào để giải phóng chúng ? (a) -OH trong serin, (b) -SH trong cystein, (c) -COOH trong axit glutamic, (d) -NH2 trong lysin, (e) imidazyl trong histidin, và (f) guanadyl trong argenin Xem bảng 22-3 Nhóm cần được bảo vệ Nhóm bảo vệ Phương pháp giải phóng (a) -OH acetyl benzyl kiềm yếu H2/Pd (b) -SH benzyl Na trong NH3 lỏng (c) -COOH este metyl hoặc etyl este benzyl kiềm yếu kiềm yếu , H2/Pd (d) -NH2 Cbz Boc p-toluensulfonyl H2/Pd CF3COOH, HBr trong HOAc Na trong NH3 lỏng (e) N - benzyl Na trong NH3 lỏng (f) -NH-C(NH2)=NH H+ trung hòa Nguyên tắc hoạt hóa nhóm cacboxyl cuối mạch với mẫu thử. Chuyển nhóm -COOH thành nhóm este hoạt động -COOR, với R là nhóm dễ giải phóng như p-O2NC6H4- hoặc một thioeste RCOSC6H4NO2-p. Hình thành một hợp chất axyl hoạt động như AA-COZ, với Z là -O-PO(OR)2, -OCOR hoặc -N3. Việc hoạt hóa C-cuối mạch của một amino axit, sau đó kết hợp với một amino axit thứ hai được thực hiện bởi tác nhân dixclohexylcacbodiimit (DCC) C6H11-N=C=N- C6H11. (a) Viết công thức cấu tạo sản phẩm của phản ứng giữa DCC với RCOOH. (b) Viết phản ứng giữa sản phẩm thu được ở câu (a) và một amin R'NH2. (c) Giải thích phản ứng này. (a) RCOOH + C6H11-N=C=N- C6H11 ® (A) (b) A + R'NH2 ®RCONHR' + C6H11-NH-CO-NH- C6H11 (một dẫn xuất của ure) Phản ứng này là một quá trình chuyển vị axyl, với nhóm -CO- của axit được hoạt hóa thành tác nhân nucleofin bởi RNH2. Tổng hợp este metyl của alanylglyxin sử dụng DCC. Bước 1 : Bảo vệ N-cuối mạch của alanin : H3N+CHMeCOO- + CBzCl (xem bài 44) ® CbzNHCHMeCOOH (B) Bước 2 : Phản ứng với DCC B + DCC ® (C) Bước 3 : Phản ứng với este metyl của glyxin C + H2NCH2COOMe ® CbzNHCHMeCONHCH2COOMe (D) + C6H11NHCONHC6H11 Bước 4 : Giải phóng nhóm bảo vệ D H2NCHMeCONHCH2COOMe. Mô tả tổng hợp peptit theo quá trình pha rắn Merrifield. Pha rắn là chuỗi polistiren (-CH2 -CHPh-)n . Tuy nhiên, với vòng benzen phải có nhóm thế p- CH2Cl nhô ra ngoài bề mặt. Pha rắn có thể biểu diễn là [P]-CH2Cl, với [P] là mạch chính polystiren. Mạch peptit sau khi bảo vệ nhóm amin bằng Boc sẽ bắt đầu liên kết với pha rắn từ C-cuối mạch tạo este benzyl, sau đó giải phóng nhóm Boc. [P]-CH2Cl + -OOCCHRNHBoc [P]-C6H4-CH2OOCCHRNHBoc [P]-C6H4-CH2OOCCHRNH2. Một amino axit thứ hai (đã được bảo vệ bằng Boc, do vậy không tự dime hóa) được thêm vào, cùng với DCC. Bước thứ hai (thêm amino axit và tái tạo nhóm -NH2 ) được lấp lại nhiều lần theo yêu cầu. Giữa mỗi bước, mạch [P]-peptit hình thành được rửa bằng dung môi thích hợp để giải phóng lượng thuốc thử dư và sản phẩm phụ. Như vậy sẽ không phải tách và tinh chế, hàm lượng sản phẩm sinh ra sẽ cao. Chất phản ứng Boc-amino axit và CF3COOH được thêm vào bằng một hệ thống tự động. Quá trình giải phóng peptit khỏi polime và giải phóng nótt nhóm Boc cuối cùng được thực hiện bằng HF khan. Amino axit nào có thể tạo cầu nối hai mạch peptit ? Cho ví dụ minh họa. Cystein, qua cầu nối disulfua. Cầu nối cũng xảy ra với các nhóm thế trên cùng mạch XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC Phương pháp tách riêng các peptit ? Peptit còn chứa một nhóm a-+NH3 tự do và một nhóm a-COO- tự do cuối mạch. Hơn nữa, nhóm R còn lại trên mạch của một vài amino axit có nhóm thế góp phần vào tính lưỡng tính của peptit. Như vậy, mỗi peptit có đường cong chuẩn độ và điểm đẳng điện riêng. Trên cơ sở này có thể tách riêng các peptit bằng phương pháp sắc kí, phương pháp điện di hoặc kết hợp cả hai phương pháp này. Làm thế nào để thủy phân peptit ? Đun nóng peptit với axit mạnh hoặc bazơ mạnh sẽ thủy phân tất cảc các liên kết peptit giải phóng các amino axit thành phần. Có thể thủy phân từng phần có lựa chọn với sự tham gia của các của enzim proteolytic (cắt mạch protein). Ví dụ như trypsin chỉ thủy phân một liên kết peptit hình thành từ nhóm cacboxyl của lysin hoặc argenin, chymotrypsin thủy phân một liên kết peptit hình thành từ nhóm cacboxyl của phenylalanin, tyrosin hoặc tryptophan. Khi thủy phân hoàn toàn (a) và thủy phân từng phần (b) tetrapeptit Ala.Met.Gly.Val thì sản phẩm là gì ? (a) Các amino axit là Ala, Met, Gly và Val. (b) Dipeptit là Ala.Met, Met.Gly và Gly.Val; tripeptit là Ala.Met.Gly và Met.Gly.Val. (a) Viết phản ứng của một chuỗi peptit Pep-NHCOCHRNH3+ với dansylclorua, 5-dimetylamino-1-naphtalensulfonyl clorua. (b) Giải thích việc sử dụng quá trình dansyl hóa để phân tích nhóm đầu mạch. (a) (b) N-đầu mạch được chuyển thành nhóm sulfoamit. Peptit được thủy phân trong axit thành các amino axit thành phần và dẫn xuất dansyl của amino axit N-đầu mạch (sulfoaxit không bị thủy phân trong axit), tách riêng các sản phẩm và nhận biết. Dễ dàng xác định peptit đã dansyl hóa và amino axit N-đầu mạch do hiện tượng huỳnh quang. (a) Viết phản ứng của thuốc thử Sanger , 1-flo-2,4-dinitrobenzen (DNFB), với một mạch peptit Pep-NHCOCHRNH3+. (b) Phản ứng này được sử dụng để xác định N-đầu mạch như thế nào ? (a) (b) Thủy phân N-DNP-peptit trong môi trường axit thành các amino axit thành phần và N-2,4-dinitrophenylaminoaxit (N-DNP-aa, với aa là amino axit N-đầu mạch), chất này có màu vàng, đem sắc kí so sánh với mẫu chuẩn ta biết được amino axit N-đầu mạch. Nhóm e-NH2 của lysin cũng phản ứng với dansylclorua (và thuốc thử Sanger). (a) Lysin N-đầu mạch khác gì so với lysin phía trong mạch peptit ? (b) Lysin trong mạch khác gì các amino axit N-đầu mạch không có thêm nhóm bazơ ? (a) Sau khi thủy phân, lysin N-cuối mạch được tách ra như một disulfoamit, vì cả hai nhóm amin đều phản ứng với dansylclorua. Lysin trong mạch được tách ra dưới dạng monosulfoamit. (b) Amino axit N-đầu mạch có một nhóm a-sulfoamit và có thể so sánh với một a-monosulfoamit chuẩn. Sulfoamit của lysin trong mạch không tồn tại ở vị trí Ca. Trình bày phương pháp xác định amino axit C-cuối mạch. Ủ peptit với enzim cacboxypeptitdaza, enzim này tạo phản ứng thủy phân liên kết peptit tại amino axit C-cuối mạch. Kéo dài thời gian ủ, các amino axit C-cuối mạch được tách ra. Nghiên cứu tốc độ xuất hiện mỗi amino axit mới sẽ cho ta thông tin về trật tự của một số hữu hạn các amino axit C-cuối mạch. (a) Viết phản ứng thoái phân Edman của Pep-NHCOCHRNH3+. (b) Ưu thế của việc sử dụng thoái phân Edman xác định amino axit N-đầu mạch là gì ? (a) Trong thoái phân Edman, PhN=C=S phản ứng với -NH2 của amino axit N-cuối mạch. (b) Do điều kiện thủy phân êm dịu nên chỉ có amino axit cuối mạch tách ra, phần còn lại của amino axit không thay đổi. Sau đó nó tự động khép vòng, điều này làm cho quá trình tách xảy ra hoàn toàn và xác định được trật tự trong amino axit còn lại. Cho biết cyanobromua Br-CºN được sử dụng trong việc tách chọn lọc một peptit như thế nào ? Các ekephalin là cấu tử pentapeptit của các endorphin. Xác định trật tự các aminoaxit trong ekephalin từ các dữ kiện sau : Thủy phân hoàn toàn ekephalin (A) thu được Gly, Phe, Leu và Tyr, còn thủy phân từng phần thu được Gly.Gly.Phe và Tyr.Gly. Cho A phản ứng với dansyl clorua sau đó thủy phân và xác định bằng phương pháp sắc kí thì thấy có sản phẩm là dẫn xuất dansyl của tyrosin. Thí nghiệm với dansyl clorua cho biết aminoaxit N-đầu mạch là Tyr, kết hợp với các mảnh sinh ra do sự thủy phân từng phần Tyr.Gly....Gly.Gly.Phe (bỏ bớt một Gly do A chỉ là pentapeptit) ta có được trật tự Tyr.Gly.Gly.Phe. Đến đây thấy rằng Leu phải là aminoaxit C-cuối mạch, như vậy trật tự liên kết của các aminoaxit trong ekephalin là Tyr.Gly.Gly.Phe.Leu. Khi thủy phân hoàn toàn 1 mol tripeptit B thu được 2 mol Glu, 1 mol Ala và 1 mol NH3. X không phản ứng với 2,4-dinitroflobenzen và X chỉ có một nhóm cacboxyl tự do. Thủy phân X nhờ enzim cacboxipeptidaza thu được alanin. Xác định công thức cấu tạo của B. Thủy phân B nhờ enzim cacboxipeptidaza thu được alanin Þ aminoaxit C-cuối mạch là Ala và như vậy tripeptit B có cấu tạo theo trật tự : Glu-Glu-Ala. B không phản ứng với 2,4-dinitroflobenzen và B chỉ có một nhóm cacboxyl tự do Þ nhóm -NH2 của aminoaxit N-đầu mạch đã tạo lactam với nhóm cacboxyl của Glu thứ nhất. Khi thủy phân hoàn toàn 1 mol tripeptit B thu được 1 mol NH3 Þ nhóm cacboxyl của Glu thứ hai tồn tại ở dạng amit -CONH2. Vậy : Thủy phân hoàn toàn hexapeptit (C) thu được Ala, Arg, Gly, Lys, Try, Val và NH3. Ủ hexapeptit C với chymotrypsin thu được một dipeptit là Arg.Try và một tetrapeptit (D) chứa Gly, Lys, Ala và Val. C hoặc D đều không phản ứng khi ủ với cacboxypeptitdaza. Khi thủy phân từng phần D thu được Ala.Val, Gly.Lys, Lys.Ala và NH3. Khi thực hiện phản ứng thoái phân Edman đơn với D thì thu được chất E (công thức cho dưới đây). Xác định cấu trúc của C. Sự hình