Đề tài Chiết xuất và phân lập isoflavonoid từ cây đậu nành (Glycine max)

oàn, bộ xương và tăng cường sức đề kháng. Khi hệ thần kinh thiếu năng lượng, chất lecithin ở Đậu nành sẽ phục hồi năng lượng đã mất. Browman– Birk Inhibitor (BBI) [2] BBI là một hoá thảo mới nhất tìm thấy trong Đậu nành, có khả năng ngăn cản tiến trình phát triển mầm ung thư. Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã thí nghiệm và thành công trên các mẫu tế bào trong ống thí nghiệm và trong các thú vật qua hai dạng tinh chế PBBI và cô đặc BBIC. Theo báo cáo kết quả tường trình tại hội nghị khoa học thế giới về vai trò của Đậu nành trong việc phòng và trị bệnh (1996) thì PBBI và BBIC đã kiểm soát được sự phát triển tiến trình ung thư miệng, vú, ruột già, gan, phổi, thực quản cả các tế bào trong ống thí nghiệm lẫn ở các con chuột bạch và chuột đồng. Hiện nay BBI đã được dùng trên con người ở vài trung tâm nghiên cứu và kết quả sơ bộ rất khả quan. BBIC đã được thẩm định là loại thuốc mới bởi cơ quan F.D.A(the U.S.Food and Drug Administration). Omega – 3 fatty axit [2] Omega – 3 fatty axit là loại chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm luợng cholesterol xáu LDL đồng thời làm gia tăng lượng cholesterol tốt HDL trong máu. Nhiều nghiên cứu khoa học đã xác nhận tiêu thụ nhiều Omega – 3 fatty axit giúp ngăn chặn sự phát triển của các bệnh tim mạch. Isoflavone Do những tính năng kì diệu trong việc phòng và điều trị bệnh, đặc biệt là các căn bệnh thời đại, isoflavone đang là hoá thảo thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học hiện nay. THÀNH PHẦN VÀ HOẠT TÍNH ISOFLAVONE TRONG ĐẬU NÀNH Thành phần isoflavone trong Đậu nành Năm 2005, các nhà khoa học Brazil dã tiến hành phân tích 18 mẫu Đậu nành. Mục đích của thí nghiệm là xác định thành phần hợp chất isoflavon từ đó so sánh tỷ lệ các chất trong 18 mẫu. Qua phân tích, cho thấy isoflavon trong Đậu nành là một hợp chất phenolic gồm có: aglucone (daidzein, genistein và glyxitein), ß – glucozit (genistin, daidzin, glyxitin), ß – glucozit kết hợp với nhóm malonyl ( 6 ” - O – malonyldaidzin, 6 ” – O – malonylgenistin và 6 ” – O – malonylglycitin), ß - glucozit kết hợp với nhóm axetyl ( 6 ” – O – axetyldaidzin, 6 ” – O - axetylgenistin và 6 ” – O – axetylglycitin). [10] Bằng các phương pháp sắc kí HPLC/DAD và phổ UV các nhà khoa học Bồ Ðào Nha cũng đã xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt Đậu nành. Sau khi so sánh với các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện trước đó với kết quả phân tích trong thí nghiệm, các khoa học gia khẳng định trong hạt Đậu nành các aglucone chiếm một lượng nhỏ, hợp chất chính trong hạt Đậu nành là các dẫn xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß – glucozit. Báo cáo còn chỉ ra trong hạt Đậu nành còn chứa các aglucone : sissotrin, ononin; các dẫn xuất axetyl của ß – glucozit : 6 ” – axetylsissotrin, 6 ” – axetylononin; các dẫn xuất malonyl của ß – glucozit : 6 ” - malonylsissotrin, 6 ” – malonylononin. [11] Năm 2006 các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt Đậu nành. Kết quả nhận được, tổng tỷ lệ trung bình của isoflavone là 2887µg/g trong phôi, 575µg/g trong hạt, 325µg/g trong lá mầm, 33µg/g trong vỏ hạt. Các khoa học gia cũng đã phân tách được 12 đồng phân isoflavone trong 90 phút/mẫu thí nghiệm bằng phương pháp HPLC – PDA. [4] Cấu trúc cơ bản của isoflavon gồm 2 vòng bezen: A và B nối với một dị vòng pyron. [12] Hình 1 Cấu trúc hóa học của các Aglucon R1 R2 R3 Daidzein -H -H -OH Genistein -H -OH -OH Glyxitein -OCH3 -H -OH Formononetin -H -H -OCH3 Biochanin A -H -OH -OCH3 Daidzin Genistin Glycitin Hình 2 cấu trúc hóa học của các β Glucozit. Hoạt tính của isoflavon trong Đậu nành. [4] Các hoạt chất có tác dụng “phytoestrogen” trong hạt Đậu nành gồm chủ yếu là daidzin, genistin. Genistin và daidzin là những phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, tính phân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hoá. Muốn cho dễ hấp thu và trở nên có giá trị sinh học, phải thuỷ phân chúng thành các aglycon, tức làm mất thành phần glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần có xúc tác enzym đặc hiệu là glycosidase. ống tiêu hoá của người không tạo được glycosidase, nên cơ thể không thể thuỷ phân được isoflavon và isoflavon chưa có giá trị sinh học. Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo glycosidase cần cho quá trình thuỷ phân nêu trên, giúp cho sự hấp thu các isoflavon. Các aglycon sẽ hấp thu ở ruột non. Nồng độ đỉnh của aglycon trong máu chỉ đạt được 4-6 giờ sau khi uống chất chiết xuất từ hạt Đậu nành, tức là khi các glycozit đã được thuỷ phân qua xúc tác enzym của tạp khuẩn tại ruột. Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase giúp cân bằng tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thuỷ phân daidzin và genistin sang daidzein và genistein có hoạt tính “phytoestrogen”. Sau khi hấp thu, genistein và daidzein sẽ trãii qua các quá trình chuyển hoá khác nhau, chủ yếu xảy ra tại gan, ưa nước hơn, dễ đào thải qua pha giải độc (pha II) qua thận và mật (có chu kì ruột – gan), qua cả sữa mẹ. Chất chuyển hoá chính của genistein là hydroxy – O – demethylangolensin. Những chất chuyển hoá chính của daidzein là O – demethylan – golensin, glyxitein và equol. Equol là thành phầ rất quan trọng cho hoạt tính của isoflavon Đậu nành trong điều trị các triệu chứng mãn kinh, vì hoạt tính estrogen của equol mạnh gấp 5 lần hoạt tính này của chất mẹ daidzein và lần gấp 2 lầnhoạt tính của genistein. Các phytoestrogen của Đậu nành có nhiềutác dụng sinh học khác nhau. Một trong những tác dụng quan trọng là sự gắn thuốc chỉ vào các thụ thể estrogen đặc hiệu, sau dó kích thích thụ thể tạo nên “tác dụng estrogen”. Thụ thể estrogen (ER) thuộc một họ lớn các thụ thể hormon trong tế bào. ER kích thích quá trình dinh dưỡng của các mô có chứa thụ thể. Người ta chia ra hai loại ER là alpha ER (αER) và beta ER (ß ER), phân phối khác nhau trong các mô: αER có mặt tại màng trong tử cung, trong chất đệm của buồng trứng và ở tuyến vú. Còn ß ER mặt khác, tồn tại trong các tế bào nội mô của thành mạch máu, ở não, thận và trong các tế bào của bàng quang và niệu đạo, trong tế bào của niêm mạc ruột và phổi, tế bào xương. Vậy những tác dụng khi kích thích αER sẽ khác hăn tác dụng khi kích thích ß ER. Estradiol là hormon estrogen sinh lý chủ yếu, sự kích thích chủ yếu αER và cho những tác dụng nội tiết rất quen thuộc trên màng trong tử cung và ở vú. Trái lại, genistein, daidzein và các chất chuyển hoá của chúng kích thích chủ yếu vào ß ER, vì vậy rất khó có tác dụng trên màng trong tử cung và vú, trong khi đó lại có nhiều tác dụng thuận lợi khác nhau trên các triệu chứng của mãn kinh. Ái lực của isoflavon trong Đậu nành tại ER thấp hơn ái lực của hormon estrogen hàng 500 – 10000 lần. Vì vậy những tác dụng của isoflavon trong Đậu nành luôn luôn yếu hơn rất nhiều so với tác dụng của hormon estrogen thực thể, nên thoả mãn được sự cân bằng tinh tế về hormon cần xác định sau khi mãn kinh. Hơn nữa, tính ưu việt của isoflavon là kích thích được sự tổng hợp globulin trong máu có chức năng gần các hormon sinh dục ( Sex Hormone Binding Globulin; SHBG). Kết quả là nếu SHBG (vừa được tăng sinh) mà làm tăng sự gắn được cơ chất estradiol trong tuần hoàn, sẽ khiến tác dụng estrogen chậm lại, từ dó trung hoà được một số tác dụng không mong muốn của estradiol tại màng trong tử cung và tại vú. Tác dụng của isoflavon Đậu nành trong phòng và điều trị bệnh [8] Nghiên cứu thăm dò trên lâm sàng, đã chỉ ra những tác dụng có lợicủa Đậu nành trên các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavon trong Đậu nành làm giảm cường độ bốc hoả, giảm số lần đổ mồ hôi đêm, mang lại lợi ích hiển nhiên nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh. Phụ nữ dùng placebo sẽ thức giấc trung bình 1,89 lần do bốc hoả và đổ mồ hôi, nhưng ở nhóm điều trị bằng isoflavon Đậu nành, số lần thức giâc sẽ giảm chỉ còn 1,52 lần. Isoflavon Đậu nành không gây thay đổi có ý nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung. Không có người nào phàn nàn về rối loạn vú, không thấy tăng các tác dụng phụ estrogen không mong muốn. Những nghiên cứu khác ở phụ nữ mãn kinh cho thấy có giảm tuần tự số lần bốc hoả trong mỗi tuần, giảm ở nhóm dùng isoflavon rõ hơn hăn so với ở nhóm dùng placebo, không gây tác dụng phụ nào, dù không đặc hiệu hoặc có liên quan tới tác dụng estrogen (tới màng trong tử cung, qua xét nghiệm tế bào học của âm đạo hoặc trên các thông số hormon). Vì vậy, có thể khuyến cáo dùng isoflavon Đậu nành cho phụ nữ nào có chống chỉ định dùng liệu pháp hormon thay thế (HRL) hoặc không muốn dùng HRL vì lý do cá nhân. Isoflavon trong Đậu nành cũng thu được sự cải thiện toàn bộ về chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh. Ăn các thực phẩm giàu isoflavon đã cải thiện rõ rệt những triệu chứng của tuổi mãn kinh (bốc hoả, đổ mồ hôi đêm, mất ngủ, trầm cảm, khô âm đạo, đau khi giao hợp) so với ở nhóm phụ nũ dùng chế độ dinh dưỡng thông thường. Uống isoflavon Đậu nành còn cho thấy có cải thiện ý nghia về quá trình dinh dưỡng da. Tuy nhiên, không nên dùng liều quá cao đề tránh gây ra những tác dụng estrogen không mong muốn. Tác dụng trên chuyển hoá của xương Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ châu Á thấp hon hẳn so với ở các nước phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử dụng nhiều thức ăn chế từ Đậu nành. Hiệu lực của isoflavon Đậu nành trên quá trình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về mật độ khoáng ở xương (BMD) tới các đốt sống L2 – L4 khi so sánh với phụ nữ theo chế độ ăn nghèo Đậu nành. Hiệu lực của isoflavon Đậu nành trên chuyểnhoá của xương cũng được khẳng định trong các nghiên cứulâm sàng khác và còn được xác minh qua các nghiên cứu trên chuột cống cắt bỏ buồng trứng. Isoflavon còn làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính của huỷ cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogen của thuốc này. Tác dụng trên tim mạch Chế độ dinh dưỡng giàu Đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành (CHD). Isoflavon Đậu nành có những tác động khác nhau chống rối loạn lipit – máu ở người mãn kinh, có thể cắt nghĩa được sự giảm các nguy co tim mạch. Đậu nành và chiết xuất của Đậu nành cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã được sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ: - Làm giảm huyết áp tâm trương - Làm giảm cholestreron toàn phần, giảm cholesteron “xấu” (tức LDL – cholesteron), giảmtriglyxerid, tăng HDL – C, giảm tỷ số cholesterol toàn phần / HDL – C, giảm tỷ số LDL – C / HDL – C; - Chống tiểu cầu; - Ngan chặn sự tiến triển của các mảng xơ vữa - Cải thiện tính đàn hồi độngmạch; - Chống oxy hoá, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự lipoperoxy hoá của lecithin và của LDL – cholesterol sản sinh ra các sản phẩm cuối cùng có hại, vì các sản phẩm này có ái lực rất cao với thành động mạch và gây ra những mảng xơ vữa. Dựa vào các kết quả trên, cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) Hoa Kỳ đã chấp nhận từ năm 1999, dùng Đậu nành cùng chế độ dinh dưỡng nghèo axit béo no, nghèo cholesterol để làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành. Tác dụng trên các chức năng nhận thức Liệu pháp thay thế hormon (HRT) đã chứng tỏ có tác dụng thuận lợi trong điều trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ cao tuổi. Vì vậy, có thể suy ra là phytoestrogen cung có thể có các lợi ích tương tự. Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormon Tỷ lệ một số loại u phụ thuộc hormon (như u ở màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng) thay đổi rất rõ rệt từ quần thể nọ sang quần thể kia, nhưng tỷ lệ này rất thấp ở phụ nữ châu Á. Nhận xét này về dịch tễ cho thấy có liên quan tới chế độ dinh dưỡng giàu đạu nành ở dân cư châu Á. Các nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng đã chứng minh hiệu lực của phytoestrogen làm giảm nguy cơ ung thư ở màng trong tử cung, ở vú và buồng trứng. Kết quả chưa hoàn toàn chắc chắn, cần các nghiên cứu tiếp theo để mang lại một kết luận rằng isoflavon đậu nành có thể ngăn ngừa hữu hiệu các loại u nêu trên. Nhưng chắc chắn rằng isoflavon đậu nành không làm tăng nguy cơ ung thư, mặc dầu isoflavon có tác dụng estrogen, có thể do isoflavon đậu nành chủ yếu kích thích β ER. Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavon của đậu nành Đậu nành và isoflavon của đậu nành dung nạp tốt, loại trừ một vài trường hợp hiếm gây rối loạn nhẹ đường tiêu hóa. Đậu nành thuộc họ đậu (Fabaceae). Người dị ứng với rau đậu có thể dị ứng với thức ăn chế từ đậu nành ( sữa đậu nành, đậu phụ, bột đậu nành, tương,…). Những phản ứng này là do protein chứa trong đậu nành. Một số qui trình chiết tách isoflavon trong đậu nành Tại Hàn Quốc [4] Các nhà khoa học đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành phần isoflavon trong phôi, lá mầm, vỏ hạt và hạt đậu nành. Trong quá trình nghiên cứu, các khoa học gia nhận định, phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) là phương pháp tối ưu nhất để phân tách isoflavon từ các mẫu thí nghiệm. Quá trình phân tách được thực hiện như sau: Chín mẫu đậu nành sử dụng trong thí nghiệm có kích cỡ hạt đa dạng từ trung bình đến lớn, trọng lượng 25-40g/100 hạt. Điều kiện gieo trồng và chăm sóc các mẫu tốt, thu hoạch vào vụ mùa 2004 tại Hàn Quốc, sau đó cất giữ bảo quản trong kho và đem phân tích vào năm 2005. Mẫu được nghiền sơ bộ qua máy nghiền để tách riêng các thành phần: phôi, mầm, vỏ hạt.Các mẫu được đê khô, làm lạnh, sau đó nghiền thành bột mịn. Trộn 2 gram bột mẫu với10ml axetonitrit (ACN) và 2ml HCl 0,1N. Hỗn hợp được để trong 2h ở nhiệt độ phòng trước khi đem lọc qua giấy lọc Whatman. Sau khi lọc kiệt, dịch cô được để lạnh khô ở - 40oC rồi hoà tan lại trong 10ml metanol 80% và lọc qua tia lọc 0,45µm. Phân tích bằng sắc kí lỏng cao áp dựa theo phương pháp đã được thực hiện bởi Wang và Murphy (1994) và Kim, Jung, Ahn và Chung (2005). Hệ thống sắc kí lỏng cao áp được sử dụng dể nghiên cứu gồm : máy sắc kí lỏng cao áp hãng Shimadzu, sử dụng detector photodiot array phân giải cao ( hãng SPD M10A) cùng với lắp cột sắc kí 250mm x 4,6 mm I.D x 5µm; quá trình dò bằng detector UV 254nm. Bộ tổng hợp dung môi linear HPLC gradient, sử dụng pha động gồm dung môi A ( 0,1 % glacial axetic axit trong nước cất ) và dung môi B ( 0,1% glacial axetic axit trong ACN ). Bơm 20µl mẫu vào máy sắc kí lỏng cao áp. Quá trình tách các pic tốt nhất khi dung môi B tăng từ 15% đến 35% trong thời gian là 60 phút, giữ ở 35% trong 5 phút, và trở về 15% trong 5 phút với tốc độ dòng 1ml/phút. Tổng thời gian phân tách một mẫu khoảng 85 phút, sau dó chuyểnsang mẫu kế tiếp. Cả dung môi và nước cất sử dụng trong sắc kí lỏng cao áp HPLC phải đạt độ tinh khiết 99,9% và đã hút chân không. Tại Brazil [10] Cũng bằng HPLC, các nhà khoa học Brazil đã xác định được thành phần isoflavon trong 18 mẫu Đậu nành khác nhau. Quá trình phân tách được thực hiện như sau: Mười tám mẫu cây Đậu nành được gieo trồng tại các thời điểmm khác nhau trong vụ mùa 2002/2003 tại Brazil. Sự phân loại mẫu dựa trên số ngày kể từ khi gieo trồng đến khi thu hoạch. Các mẫu được đem phân tích thành phần isoflavon và độ hoạt động của ß- glucosidase. Nghiền 30g hạt mỗi mẫu thành bột, lấy khoảng 250mg mẫu chiết trong ống nghiệm với 3ml hệ dung môi dimetyl sunfoxit ( DMSO) : metanol ( 1:4 v/v ) trong 15-17h ở nhiệt độ phòng và sau đó li tâm. Phần nổi trên mặt được lọc qua tia lọc 0,43µm. Bơm 20µl mẫu vào sắc kí lỏng cao áp hãng Shimadzu ( LC – 10AT VP), sử dụng detector photodiot array phân giải cao ( SPD – M10A VP) và lò ( CTO – 10AS VP) gia ở nhiệt độ 26oC. Sử dụng cột sắc kí CLC – ODS (M) C18 kích cỡ 250mm x 4,6 I.D x 5µm. Pha động gồm dung môi 1 là nước và dung môi 2 là axetonitrit. Quá trình tách các pic, ban đầu 100% nước và 0% axetonitrit, thay đổi tới 45% nước và 55% axtonitrit trong thời gian 25 phút. Isoflavon được dò ra ở 260nm. Giữ 100% axetonitrit trong 2 phút và quay trở lại điều kiện ban đầu trong khoảng thời gian 8 phút kế tiếp. Tổng thời gian phân tách một mẫu khoảng 40 phút. Tốc độ dòng là 1ml/phút. Thành phần isoflavon được biểu thị mg/100g bột khô. Tại Bồ Ðào Nha [11] Quá trình phân tách được thực hiện như sau: 100 mgram của hạt Đậu nành đem tán thành bột ( kích cỡ 250 mesh) hoà với1000µl etanon : nước( 1:1). Dịch chiết được quay li tâm tốc độ 10.000 rpm/10phút. Sau dó bơm 50µl mẫu dung dịch nổi trên mặt vào máy sắc kí lỏng cao áp, tốc độ dòng 0.8ml/phút. Pha động H2O /CH3CN được bơm vào cột LichroSorb RP18, nhiệt độ 24oC . Quá trình dò được thực hiện bằng detector diot phân giải khoảng buớc sóng từ 200nm – 400nm. Xác định cấu trúc của flavonoid dựa vào phân tích phổ UV. Tại Australia Một nhóm các nhà khoa học cũng sử dụng HPLC để phân tích sự thay đổi thành phần isoflavon trong các sản phẩm chế biến từ Đậu nành [13 ] Ngoài phương pháp HPLC để phân tách và xác định thành phần isoflavon trong Đậu nành. Bằng viềc kết hợp các phương pháp phân tích khác nhau, các nhà khoa học đã tách và xác định được hầu hết các thành phần hoạt chất chứa trong Đậu nành Nhóm các nhà khoa học Hàn Quốc và Nhật Bản đã thực hiện qui trình chiết tách saponin từ Đậu nành như sau: Bột Đậu nành được tách dầu trong bộ chiết Soxhlet với n- hexan. Sau khi tách dầu được chiết xuất với metanol. Thu hồi dung môi, phần còn lại tiếp tục chiết với butanol 80%. Thu hồi butanol bằng phễu tách. Dịch chiết được làm khô trong chân không. Phần bã được hoà tan lại trong nước và làm lạnh khô. Sắc kí lớp mỏng chỉ ra hai vết y hệt nhau. Ngược lại sắc kí lỏng cao áp, sử dụng pha động Choloroform và metanol đã chỉ ra dịch chiết chứa soyasaponin I và soyasaponin II. [10]. Khi phân tích thành phần polyphenol trong hạt Đậu nành, các nhà khoa học Serbia đã định tính được tannin bằng sắc kí lớp mỏng xenlulo, định tính được các flavonoid và proanthoxyanidin sử dụng sắc kí lớp mỏng silicagen. [14]. Trong một nghiên cứu của nhóm các nhà khoa học Hoa Kỳ và Tây Ba Nha đã đề cập đến phương pháp chiết các protein từ Đậu nành của nhóm các tác giả De Mejia, Vasconez, De Lumin, Nelson (2004), phương pháp phân tích các amino axit bằng HPLC của nhóm tác giả Martinez – Villaluenga, Gule – Wicz, Frias, Gule Wiczand Vidal– Valverde (2007). [15] Phần 2 THỰC NGHIỆM MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ ĐẬU NÀNH Chiết xuất hai aglycones isoflavone (daidzein, genistein) và coumestrol từ rễ đậu nành bằng Dimethyl sulfoxide. Phân lập bằng HPLC xac định bằng GC MS.[16] Thực nghiệm Hóa chất, dung môi, thiết bị Genistein chuẩn (ICN Pharmaceuticals, Inc. of Plainview, NY). Daidzein chuẩn (Dr. John Ingham, Đại học Reading, Anh). Coumestrol chuẩn (công ty Eastman Kodak, Rochester, NY). Methanol quang phổ ( Burdick & Jackson, Inc, Muskegon, MI). Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Fisher, Pittsburgh, PA). Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) (Supelco Inc, Bellefonte, PA). Khí Nitơ (D & R, Decatur, IL). Máy khuấy Eberbach. Máy ly tâm Damon IEC B-20A. Hệ thống HPLC bao gồm: bộ điều khiển model Beckman 420, đầu dò thay đổi bước sóng model Beckman 100-40, cột ODS Ultraphere C18 (4.6mm × 25cm), bơm tiêm tự động Micromeritics 725 với cỡ loop 100µl. Phát hiện ở bước sóng 280nm. Bộ phận ghi tín hiệu model Beckman C-R1A. Bộ phận thu gom phân đoạn model Beckman 204. Máy sấy đông khô model Uni-trap 10-100 (Virtis, Inc). Hệ thống GC-MS Packard Hewlett 5985. Cột GC là cột thủy tinh dài 6 foot, lỗ hẹp, được nhồi với SP-2100 3%. Khí mang là Helium và tốc độ dòng 30ml/ phút. Nhiệt độ tăng từ 50-200 0C với tốc độ tăng 25 0C/ phút. Chiết xuất Đậu nành “Wells II” (Glycine max (L.) Merrill) trồng trong nhà kính, lấy rễ ở giai đoạn tăng trưởng R-2. Rễ được rửa sạch rồi trộn đều với DMSO (tỉ lệ 2 : 1) bằng máy khuấy Eberbach trong 2h ở tốc độ chậm. Gạn lấy dịch chiết DMSO đem ly tâm với tốc độ 294.000 m/(giây)2 trong 10 phút, lọc qua một màng lọc Millipore 5µm. Phân tích HPLC và GC – MS Pha động HPLC gồm dung môi A và B. Dung môi A bao gồm 65% methanol và 35% nước. Dung môi B gồm 15% methanol và 85% nước. Chạy gradient như sau: 0-21 phút, gradient tuyến tính từ 80- 30% B; 21-70 phút, chạy đẳng dòng 30% B; 70-70.5 phút, gradient tuyến tính từ 30-80% B; và ở 80 phút, chu kỳ được lặp lại. Tốc độ dòng là 1.0ml/ phút. Bảng 1. Thời gian lưu của Daidzein, Genistein, Coumestrol Hợp chất Thời gian bắt đầu thu chất (phút) Thời gian kết thúc thu chất (phút) Daidzein 29.2 32.3 Genistein 38.2 42.0 Coumestrol 55.3 58.8 Để tăng lượng chất rửa giải, gom chất rửa giải từ 12 mẫu dịch chiết rễ đậu nành. Chất rửa giải được sấy đông khô để loại dung môi methanol và nước. Các tinh thể thu được hòa tan trở lại trong methanol dùng cho quang phổ. Chuẩn bị mẫu cho GC – MS: bốc hơi tới khô một phần của mỗi dung dịch methanol dưới khí N2. Phân tích trực tiếp các tinh thể thu được và dẫn chất trimethylsilyl (TMS) của các tinh thể. Dẫn chất TMS được tạo ra từ việc hòa tan một phần tinh thể trong 0.2ml chất silylation BSTFA, sau đó đun nóng nhẹ dung dịch ở 60oC trong 15 phút. Kết quả và bàn luận Phổ đồ HPLC điển hình của dịch chiết rễ đậu nành được biểu diễn ở hình 1. Trên 80 phút phân tích, phương pháp này mất 16h. Việc sử dụng cột lớn hơn nên giảm đáng kể thời gian phân tích, nhưng phải bảo đảm phân tích đầy đủ của những hợp chất quan tâm từ dịch chiết DMSO. Phổ UV của dịch methanol tương ứng mỗi peak 1 được thể hiện ở bước sóng hấp thu cực đại là 238, 249, 259 và 303nm. Những giá trị này tương tự như các chất thu được từ daidzein chuẩn và những chất được báo cáo trong thư viên phổ. Phổ khối của peak 1 thể hiện phân tử ion là M/Z = 254 và những phân mảnh ion chính là 137 và 118. Phổ khối của dẫn chất TMS của peak 1 có phân tử ion M/Z = 398 và những phân mảnh ion chính là 353 và 184. Những phổ này là cần thiết cho việc xác định những phổ thu được là của daidzein chuẩn. Peak 2 có bước sóng cực đại tại 264 và 340nm. Phổ đồ trên 250nm thì giống như phổ của genistein chuẩn và như phổ được báo cáo trong thư viện phổ. Sự hấp thu dưới 250nm xác định sự không tinh khiết. Phổ khối của peak 2 thể hiên phân tử ion là M/Z =270 và phân mảnh ion chính là 153 và 118. Phổ khối của dẫn chất TMS của peak 2 không hiển thị phân mảnh ion mong muốn là 471, 414 và 399. Những phổ này của peak 2 là cần thiết cho việc xác định những phổ thu được là của genistein chuẩn. Phổ của dẫn chất TMS của genistein chuẩn chỉ thể hiện peak ion phân tử rất nhỏ ở M/Z = 486. Bước sóng hấp thu cực đại của peak 3 là 212, 242, 307 và 347 nm. Phổ UV ở peak 3 thì giống với coumestrol chuẩn. Phổ khối có ion phân tử là M/Z= 268 và phân mảnh ion chính là 240. Những giá trị này thu được với coumestrol chuẩn và tương ứng với phổ được báo cáo trong thư viện phổ. Dẫn chất TMS của peak 3 có ion phân tử là M/Z = 412 và phân mảnh ion chính là 397 và 369. Chất rửa giải tương ứng với peak 4 được thu thập từ 62 -66 phút và được phân tích. Phổ UV của dung dịch methanol tương ứng với peak 4 thể hiện bước sóng hấp thu cực đại ở 227, 291, 313 và 325 nm. Ion phân tử trong phổ khối của peak 4 là M/Z = 338, với phân mảnh ion chính là 323 và 305. Dẫn chất TMS có ion phân tử là M/Z = 482 và phân mảnh ion chính là 467, 393 và 377. Dữ liệu này đề nghị rằng peak 4 là một hỗn hợp của glyceolin I, II, III, tất cả chúng được biết như là phytoalexins ở phần trên mặt đất của đậu nành. Kĩ thuật được mô tả ở trên cung cấp một phương pháp nhanh và đơn giản cho việc chiết xuất và phân lập những loại hợp chất này. Sự phân tích định lượng cũng có thể sử dụng các kĩ thuật này. Hình 1. Phổ đồ HPLC Chiết xuất các isoflavone (daidzin, genistin, daidzein và genistein) từ trụ dưới lá mầm của đậu nành bằng n – hexan.[17] Nguyên tắc Loại chất béo ra khỏi đậu nành đã được lên men bằng vi sinh bằng một dung môi không phân cực. Chiết với dung môi phân cực và cô đến cắn. Hòa tan cắn với 1 dung môi phân cực thứ hai, rồi pha loãng với nước tạo tủa. Các aglycone isoflavone phân cực kém hơn các glycosid isoflavone sẽ kết tủa. Tách và rửa kết tủa với dung môi phân cực thứ hai ở trên rồi bay hơi loại dung môi. Chất rắn thu được chứa một hoặc nhiều aglycone của isoflavone đậu nành. Ví dụ Chuẩn bị nguyên liệu bằng cách lên men trụ dưới 2 lá mầm đậu nành với koji – kin, một loại nấm thuộc chi Aspergillus oryzae. Xay thành bột thô với cỡ hạt khoảng 100 meshes. Trộn bột với lượng n-hexane gấp khoảng 3 lần, đun hồi lưu ở nhiệt độ sôi của n-hexane (690C) trong 3 giờ (dao động 2 – 5 giờ tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu). Dùng máy sấy hơ nóng loại dung môi. Lặp lại quy trình chiết trên vài lần nữa để loại hoàn toàn chất béo. Chấm sắc kí cho thấy dịch n – hexan không chiết luôn các isoflavone (đó là lí do dùng dung môi này để chiết xuất). Nguyên liệu đã được loại chất béo thu được có khối lượng khoảng 89% so với nguyên liệu ban đầu. Cho thêm lượng ethyl acetate gấp khoảng 3 lần, đun hồi lưu ở nhiệt độ xấp xỉ nhiệt độ sôi của ethyl acetate (77.1 0C) trong trong 3 giờ (dao động 2 – 5 giờ tùy thuộc lượng nguyên liệu). Dịch ethyl acetate được cô áp suất giảm. Lượng cắn thu được bằng 2 – 5% khối lượng nguyên liệu ban đầu. Có thể lặp lại qui trình này vài lần để tăng tỉ lệ phục hồi. Cắn này hòa tan với một lượng nhỏ ethanol 99% rồi pha loãng với nước tới độ cồn khoảng 20% để tạo tủa. Để yên một thời gian. Lọc qua giấy lọc tách lấ