Đề tài Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh acteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi

phải được tiến hành giải đông. Tùy vào mục đích và thời gian bảo quản mà người ta chọn nhiệt độ bảo quản khác nhau có thể -180C, -250CPhương pháp này chỉ áp dụng với các nhà máy chế biến với quy mô lớn, sử dụng các kho, tủ cấp đông. Để tăng hiệu quả bảo quản trước khi cấp đông nguyên liệu có thể được lấy hết ruột rửa sạch nội tạng. b. Bảo quản cá nguyên liệu bằng hóa chất Cho đến nay người ta đã nghiên cứu nhiều loại hóa chất dùng trong bảo quản nguyên liệu rất có hiệu quả. Dùng hóa chất bảo quản tốt nhất là kết hợp với nhiệt độ thấp thì giữ được tươi hơn. Yêu cầu của hóa chất dùng để bảo quản là không độc với con người, không có mùi vị lạ, tính chất hóa học phải ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản. Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: muối vô cơ, acid chất hữu cơ. Tùy từng loại hóa chất mà có cách sử dụng khac nhau:  Muối vô cơ Bảo quản nguyên liệu bằng muối vô cơ như: Calcium hypochlorite (Ca(OCl)2), natri nitrit (NaNO2), natri chlorua (NaCl) bằng cách chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch. Nếu chế thành nước đá thì cứ một lớp đá rồi một lớp cá ướp, còn khi pha thành dung dịch ta ngâm cá nguyên liệu trong thời gian 2 - 5 phút sau đó mang bảo quản lạnh.  Loại acid Các loại acid thường dùng để bảo quản nguyên liệu thủy sản là: Acib boric, acid chlohytric, acid acetic, acid lactic Dùng acid để giữ tươi nguyên liệu có 3 cách: thứ nhất là pha acid thành dung dịch có nồng độ thích hợp rồi đem phun hoặc ngâm lên nguyên liệu, cá sau khi được ngâm hoặc phun xong trong thời gian ngắn thì đem bảo quản lạnh hoặc bằng muối ăn. Cách thứ hai là chế thành nước đá có acid để bảo quản. Cách thứ ba là 12 dùng hỗn hợp acid với chất hóa học phòng thối khác để nâng cao hiệu quả bảo quản. Ngoài ra, người ta dùng rơm, cỏ khô, mùn cưa được tẩm acid để bảo quản.  Loại chất hữu cơ Nói chung các chất hữu cơ thường được sử dụng hạn chế trong bảo quản nguyên liệu tùy theo quy định của các nước. Các chất hữu cơ thường dùng như: Acid dehydro acetic (DHA) và muối natri của nó, formaldehyt và sulfathiazolvà chúng được sử dụng dưới dạng chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch. c. Bảo quản bằng cách dùng thuốc chống oxy hóa Trong quá trình bảo quản nguyên liệu cá và các sản phẩm thủy sản khác hay sinh ra sản phẩm ôi khét, ôi thối nguyên nhân là do hiện tượng oxy hóa, đốt cháy mỡ sinh ra. Để ngăn chặn hiện tượng đó người ta tiến hành bảo quản lạnh kết hợp với chất chống oxy hóa. Các chất chống oxy hóa được dùng như: Acid citric, acid tactric, tocopherol (vitamin E), butyl hydroxyanizol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT)Chúng không có khả năng phục hồi lại các chất béo đã hỏng mà có tác dụng chống sự oxy hóa hoặc để chống oxy. Chất chống oxy hóa được sử dụng dưới dạng dung dịch, nước đá (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006). d. Bảo quản bằng phương pháp sinh học kết hợp bảo quản lạnh Sử dụng phương pháp sinh học để làm chậm thời điểm bắt đầu tê cứng hoặc kéo dài quá trình tê cứng của cá để giữ cá được tươi, có nghĩa là làm chậm sự phân giải ATP. Muốn làm giảm sự phân giải ATP trong tổ chức cơ thịt cá thì tìm mọi cách làm cho cá chết ngay, không để cho cá giãy giụa hoạt động. Có nhiều cách làm cho cá ngừng hoạt động như thả cá vào nước 20C, dùng điện trường, các chất gây mê cho cá ngủ trong một thời gian nhất định. Cá sau khi chết phải thả ngay vào nước biển hoặc nước muối pha loãng 1 - 2 giờ để rửa sạch máu, nhiệt độ nước rửa phải thấp hơn nhiệt độ cá sống 2 - 30C, không được thấp quá sẽ làm cơ thịt co rút lại và mau tê cứng. Cá sau khi rửa xong vớt ra bảo quản 100C. Khi vận chuyển cá đi nơi khác dùng nước đá để bảo quản. Cá được xếp trong bao polyethylene và xếp 13 thành từng con vào thùng gỗ, nước đá chỉ phủ phần đầu không ướp nước đá xuống thân để phòng hạ thấp nhiệt độ. Trong quá trình vận chuyển tránh mọi va chạm, giữ cá được yên tĩnh (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006). e. Bảo quản cá nguyên liệu bằng chất kháng sinh Truớc đây chất kháng sinh được phát triển và sử dụng rộng rãi trong bảo quản nguyên liệu. Nhưng thời gian gần đây người ta phát hiện thấy chất kháng sinh có khả năng gây ra các phản ứng có hại cho người sử dụng, vì vậy nó được nghiên cứu và sử dụng thận trọng hơn. Chất kháng sinh là chất hữu cơ do vi sinh vật hoặc động thực vật cao đẳng sinh ra hoặc dùng phương pháp tổng hợp như chloromyxetin. Aureomycin và teramycin là chất kháng sinh được sử dụng để bảo quản hải sản nhiều nhất, ngoài ra người ta nghiên cứu sử dụng các chất như penicillin, nizin, tylozin Chất kháng sinh được sử dụng trong bảo quản bởi vì nó làm cho một vài cơ năng nào đó trong vi sinh vật không hoạt động được và làm rối loạn sự trao đổi chất, do đó làm vi sinh vật bị yếu hoặc bị chết. Tác dụng đó của chất kháng sinh rất mạnh cho nên chỉ dùng liều nhỏ đã có hiệu lực bảo quản. Có 3 phương pháp sử dụng chất kháng sinh: ngâm, phun và chế thành nước đá. Phương pháp ngâm: nguyên liệu đem rửa sạch ngâm vào dung dịch chất kháng sinh từ 5 - 10 phút, sau đó đem bảo quản, nồng độ kháng sinh thường dùng là 5 - 20ppm, bảo quản cá thường dùng chất kháng sinh có nồng độ 10ppm. Phương pháp phun: nguyên liệu rửa sạch sau đó dùng dung dịch khánh sinh có nồng độ hơi cao để phun đều trên nguyên liệu. Phương pháp này thích hợp với các loại cá to. Phương pháp chế thành nước đá: dùng chất kháng sinh hòa thành dung dịch sau đó làm lạnh cho đóng băng rồi đem nghiền nhỏ ra để bảo quản nguyên liệu, khi bảo quản chất kháng sinh sẽ tan ra ngấm vào nguyên liệu. Dùng dung dịch chất kháng sinh để chế thành nước đá sẽ làm chất kháng sinh phân bố không đều trong 14 nước đá, nước đá có thể làm mất hoạt tính chất kháng sinh hoặc gây kết tủa (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006). f. Bảo quản cá nguyên liệu bằng dịch bacteriocin Bacteriocin là những đoạn peptid hoặc protein có hoạt tính kháng khuẩn được sản xuất trừ nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Bacteriocin được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và nó được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để giảm chất bảo quản hóa học đưa vào thực phẩm và nó tốt hơn phương pháp xử lý nhiệt. Bảo quản bằng bacteriocin thì thực phẩm giữ được các tính chất đặc trưng về cảm quan và dinh dưỡng. Đây là phương pháp bảo quản tự nhiên, nó có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về sản phẩm ăn liền tiện lợi, an toàn, tươi, sạch của chế biến thực phẩm và phát triển các sản phẩm mới. Ngoài các sản phẩm thương mại sẵn có như nisin, pediocin PA-1/AcH còn có các loại khác như lacticin 3147, enterocin AS-48 hoặc variacin. Bacteriocin được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu cũng như trong thực phẩm dưới các hình thức cho vào phụ gia, làm chất độn, nuôi cấy vi sinh vật bổ sung vào nguồn nguyên liệu để nó tự sản sinh bacteriocin, cũng có thể tạo các bacteriocin cố định trên bao bì bảo quản (Antonio Gá levez* và cs, 2007). Trong những năm gần đây, ứng dụng của bacteriocin như là một phần của công nghệ xử lý. Việc kết hợp giữa bacteriocin với xử lý nhiệt hay xung điện trường, bảo quản lạnh, điều chỉnh hỗn hợp khítốt hơn khi dùng bacteriocin để bảo quản. Các phương pháp này ứng dụng rộng rãi ngoài nước trong bảo quản thực phẩm nhưng ở Việt Nam còn hạn chế. Ngoài những phương pháp bảo quản trên còn sử dụng phương pháp điều chỉnh hỗn hợp khí, bức xạ điện ly nhưng nó ít được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản. 1.3. Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic trong thực phẩm 1.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có tính chất ưu việt để dùng cho bảo quản thực phẩm như an toàn với người sử dụng, không 15 độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi protease trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người, hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và thường được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền (Gálvez và cs, 2007). Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ và sinh ra bacteriocin kháng khuẩn và kháng nấm (De Vuyst và Leroy F, 2007). Jinlan Zhang và cộng sự (2007), đã phân lập được chủng Lactobacillus pentosus 31-1 từ Xuan Wei Ham sản phẩm lên men truyền thống của Trung Quốc sinh bacteriocin pentocin 31-1 ứng dụng trong bảo quản thịt heo ở 40C. Kết quả nghiên cứu sử dụng pentocin 31-1 ở ba nồng độ 40 AU/ml, 75 AU/ml và 80 AU/ml cho thấy ở nồng độ 80 AU/ml là tốt nhất. Thịt được bảo quản bằng bacteriocin có màu sắc, mùi, trạng thái tốt hơn thịt chỉ được bảo quản lạnh. Cùng năm 2007, Elisabetta Tome và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bảo quản cá hồi hun khói bao gói hút chân không để lạnh. Người ta đã nghiên cứu được các chủng lactic sinh bacteriocin: LAB (lactic acid bacteria) ETO5, ETO6, ET30, ET34. Những chủng này phải được sàng lọc bằng cách thử hoạt tính decarboxylase tyrosine và histidine. Năm 2009, Gao J và cộng sự phân lập được các chủng Lactobacillus subsp. và L. paracasei. Paracin 1.7 là bacteriocin được sản xuất từ vi khuẩn L. paracasei HD 1.7, bền với nhiệt độ và pH acid nhưng nhạy cảm với enzym thủy phân protein. Khi bảo quản ở 40C sau 4 tháng hoạt động ức chế của paracin 1.7 chỉ giảm 4,19 %. Paracin 1.7 có phổ ức chế rộng kháng lại Bacillus, Escherichia, Staphylococcus, Microccus, Pseudomonas, Salmonella, Sacharomyces, Enterobacter. Về mặt công nghệ, bacteriocin đã và đang được sử dụng kết hợp với hàng loạt kỹ thuật khác để tăng cường khả năng bất hoạt vi sinh vật đích. Người ta có 16 thể sử dụng kết hợp bacteriocin với các chất kháng khuẩn khác, xử lý nhiệt độ, áp lực thủy tĩnh cao, xung điện( Gálvez và cs, 2007). Gao và cộng sự (2010) đã nghiên cứu sản xuất bacteriocin từ Lactobacillus sake C2 được phân lập từ cải bắp lên men. Kết quả sakacin C2 phổ kháng khuẩn rộng và hoạt động ổn định ở nhiệt độ cao 1210C , pH ổn định trong khoảng 3 - 8, nhạy cảm với protease nhưng không nhạy cảm với lipase, α - amylase và β - amylase. 1.3.2. Những nghiên cứu trong nước Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên những nghiên cứu về ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm , thủy sản còn nhiều hạn chế. Lactic là chủng vi khuẩn được sử dụng đầu tiên để làm chế phẩm sinh học cho người và động vật giúp kích thích khả năng tiêu hóa. Tuy nhiên trong chế phẩm xử lý nước nuôi trồng thủy sản, vi sinh vật đóng vai trò hoàn toàn khác là cạnh tranh và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh cho động vật nuôi. Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp HY1 và vi khuẩn lactic CC4K được phân lập từ nước nuôi tôm và nước dưa đều có khả năng ức chế tốt các vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus HH1, V. furnisii VT14 – 1, V. Harvey NC5 – 1 và V. vulnificus HH2. Trong đó chủng CC4K chỉ có khả năng kháng một số vi sinh vật nhân sơ là S. aureus, S. luted, B. stutilis không kháng được vi sinh vật nhân chuẩn (Đặng Phương Nga và cs, 2007). Năm 2006, Đặng Phương Nga và cộng sự nghiên cứu khả năng đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm của một số chủng vi sinh vật lựa chọn. Kết quả chọn được ba chủng: Bacillus sp HY1, Pseudomonas aeruginosa HL1 và Lactobacillus buchneri DC4 có khả năng kháng Vibrio. Trong những năm 2004, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội đã khảo sát đa dạng sinh học, khả năng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệ vi khuẩn lactic đường tiêu hóa đường ruột (đề tài khoa học cơ bản 2004 - 2005, mã số 620504). Nhóm tác giả Đại học Quốc Gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng sinh bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum L24, kết quả thấy vi khuẩn này vừa có khả năng sinh acid lactic vừa có khả năng sinh bacteriocin (Nguyễn Thị 17 Hoài Hà và cs, 2002). Bacteriocin đã được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel và điện di trên gel SDS - PAGE có trọng lượng phân tử khoảng 10 - 30kDa. Một số nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản xuất bacteriocin cố khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như E.coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác (Lê Thị Hồng Tuyết và cs, 2004). Nghiên cứu này còn cho thấy bacteriocin bắt dầu được sản xuất ở L.acidophilus từ giờ thứ 12, ở nhiệt độ 30 - 370C với pH 5 - 7 và vi khuẩn có thể sử dụng các loại đường như manitol, maltose và glucose. Nhóm nghiên cứu ở trường Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế. Kết quả cho thấy hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 - 10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, khối lượng và số lượng bacteriocin so với đối chứng. Khi sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/ml để bảo quản thịt tươi sơ chế, tối thiểu cho thấy thời gian bảo quản đến 3 ngày mầ vẫn đảm bảo chất lượng theo TCVN 7046:2002. Trong việc nghiên cứu quy trình muối chua nha đam (Lê Thanh Mai, 2002) tiến hành thí nghiệm dựa trên hai phương pháp: lên men có bổ sung giống Lactobacillus plantarum và lên men không bổ sung giống. Kết quả cho thấy muối chua có bổ sung giống cho thành phẩm có chất lượng tốt hơn và đồng đều hơn. Ngoài ra còn rất nhiều nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định về mặt cảm quan hơn là thực phẩm lên men truyền thống. Tuy nhiên những nghiên cứu trực tiếp về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thủy sản, thực phẩm còn hạn chế. 18 Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vi sinh vật  Vi khuẩn lactic Hình 1. Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 370C Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin phân lập từ nước dưa cải được lấy từ bộ sưu tập chủng vi sinh vật của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang. Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin được nuôi trên môi trường lỏng MRS (bảng 1), trong tủ ấm 37oC. Chúng tôi đã bảo quản giống lactic trên môi trường thạch nghiêng MRS và trong glycerol. Bảo quản vi khuẩn lactic trên môi trường thạch nghiêng MRS, các ống được bảo quản ở nhiệt độ 4 - 6oC. Định kỳ cấy truyền giống, 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần. Bảo quản giống trong glycerol 30% với tỷ lệ thể tích giữa dịch giống / glycerol là 70 µl / 30 µl, các ống được giữ ở - 700C.  Vi khuẩn B