Đề tài Giâm cành chè In Vitro

. Mép lá có răng cưa đều và kéo dài đến chóp lá. Góc lá lớn, trên tôm có nhiều lông tơ trắng mịn, khả năng phân cành mạnh, năng suất đạt từ 18 – 20 tấn/ha/năm. Chất lượng chè phù hợp với chế biến hương nội tiêu và chè đen. Hiện nay là giống chè cành chủ lực ở Lâm Đồng. 6 Các phương pháp nhân giống chè 6.1 Nhân giống bằng hạt Đây là phương pháp nhân giống chè đầu tiên được áp dụng từ khi ngành chè Việt Nam phát triển. Hiện nay trong phát triển ngành chè khuyến cáo là không nên sử dụng vì chè là cây giao phấn nên vườn chè trồng bằng hạt có sự phân ly rất lớn về hình thái, về đặc tính sinh trưởng, về năng suất, phẩm chất giảm và không ổn, chỉ được áp dụng trong công tác chọn tạo giống mới ở các trung tâm nghiên cứu.  Ưu điểm – Đơn giản, dễ làm giá thành thấp. – Chi phí lao động thấp. – Tuổi thọ của cây chè cao. – Cây có khả năng thích ứng rộng trên nhiều địa hình.  Nhược điểm – Cây chè không giữ được đặc tính của cây mẹ, quần thể cây chè không đồng đều, năng suất chè không cao, chất lượng phẩm chất không ổn định. – Hạt chè dễ mất sức nảy mầm và khó bảo quản được lâu. Thời vụ gieo hạt chủ yếu phụ thuộc vào mùa quả chín thường gieo vào đầu tháng 10 đến hết tháng 11. Số lượng hạt gieo cho một hecta 200 – 250 kg tương đương 400 – 500 kg quả. Do đó hệ số nhân giống thấp. Theo Đỗ Ngọc Quý và ctv. (1978) một hecta chè để giống quả chỉ trồng được bốn hecta. 6.2 Nhân giống bằng phương pháp chiết cành Chiết cành chè được tiến hành trên cây mẹ, hàng năm các cành chiết không thu hái, sau đó tiến hành chiết bằng hai cách: Cách 1: Uốn cành sát đất, lấy đất vùi một phần cành, phần bị lấp đất sẽ mọc ra rễ mới. Cách 2: Đắp đất vào toàn bộ gốc cao đến tận các cành, để cho phần cành bị lấp mọc ra rễ mới. Khi cành chè có bộ rễ phát triển tốt tiến hành chặt đứt phần tiếp giáp với cây mẹ rồi bứng cành đưa đi trồng.  Ưu điểm – Cây con mau cho thu hoạch búp, rút ngắn thời gian kiến thiết cơ bản. – Cành chiết đem trồng có tỷ lệ sống cao.  Nhược điểm – Phương pháp chiết cành có hệ số nhân giống thấp một cây chè mẹ chỉ được 10 – 15 cây con. – Tốn nhiều nhân công nên không được phổ biến rộng rãi trong sản xuất. 6.3 Nhân giống bằng ghép cây con trong giai đoạn vườn ươm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 9 Chè là cây giao phấn vì vậy khi trồng chè bằng hạt làm cây chè dễ bị thoái hóa và lẫn tạp, năng suất không ổn định, nhưng chè trồng bằng hạt có bộ rễ phát triển tốt ăn sâu, chịu hạn tốt. Mặt khác, cây chè trồng bằng cành cho năng suất cao hơn chè trồng bằng hạt từ 33 – 45 % tùy giống (kết quả nghiên cứu của Trường Đại Học Nông Nghiêp I Hà Nội), nhưng bộ rễ của chè cành phát triển nông và chịu hạn kém. Tháng 5 – 1999 Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao kỹ thuật cây Công nghiệp và cây Ăn Quả Lâm Đồng đã tiến hành nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo cây chè ghép. Cây chè ghép được tạo thành bằng cách kết hợp giữa hai cá thể, chè trồng bằng hạt làm gốc ghép và chè cành làm cành ghép. Cành ghép lấy từ cây chè giống nội địa hoặc nhập nội có năng suất và phẩm chất cao, dễ canh tác và chăm sóc.  Ưu điểm: – Sản lượng và chất lượng chè cao hơn cây chè hạt. – Cây con đồng đều. – Cây chè ghép có khả năng chống chịu tốt và tuổi thọ cao, dễ chăm sóc.  Nhược điểm: – Chi phí cao, đòi hỏi kỹ thuật trong thao tác ghép, thời vụ ghép. 6.4 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành Hiện nay, giâm cành chè là một phương pháp nhân giống phổ biến trên thế giới Giâm cành chè được nghiên cứu ở Trung Quốc từ năm 1900, Ấn Độ 1911, Gruzia năm 1928, Srilanka năm 1938. Ở nước ta, miền Bắc bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng năm 1962, miền Nam năm 1952 (Đỗ Ngọc Quỹ và ctv, 1997).  Ưu điểm: – Có hệ số nhân giống rất cao, có thể cung cấp đồng thời một số lượng giống lớn, tránh được khó khăn thiếu giống khi trồng mới. Một hecta chè để giống đem giâm cành có thể trồng được 30 – 70 hecta (Lê Tất Khương và ctv. 1999). Số liệu từ Viện nghiên cứu chè Phú Hộ cho thấy từ một hecta vườn chè giống bốn tuổi có thể cung cấp được khoảng ba triệu hom, đủ cây cho trồng mới 50 hecta nếu trồng hai cây/hố, hoặc 80 hecta nếu trồng một cây/hố. – Tạo được vườn chè đồng đều với những đặc tính tốt của cây mẹ, rất thuận lợi cho đầu tư và thâm canh, cơ giới hóa, cho năng suất cao, nguyên liệu đồng đều giúp chế biến được chè có chất lượng tốt và ổn định. – Rút ngắn được thời gian kiến thiết cơ bản. Thời gian cho thu hái nhanh khoảng hai đến ba năm (Viện nghiên cứu chè, 2000).  Nhược điểm: – Phải qua giai đoạn vườn ươm. – Đòi hỏi phải có kỹ thuật trong các khâu giâm cành, chăm sóc, quản lý vườn ươm tỉ mỉ, tốn nhiều công lao động. – Khối lượng vận chuyển cây con ra trồng ngoài đồng lớn. – Giá thành cây con cao, làm tăng đáng kể chi phí trồng mới, chi phí cao hơn trồng hạt từ sáu đến tám lần (Viện nghiên cứu chè, 2000). – Trong thời gian kiến thiết cơ bản, khả năng chịu hạn của cây con kém. 6.5 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô Hiện nay, nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cây mô là một hướng nghiên cứu rất mới. Theo Willson và Clifford (1992), những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu tế bào và nuôi cấy mô mở ra cơ hội cho không chỉ việc nhân nhanh chóng vật liệu nhân giống, và cả cho việc sử dụng các quy luật di truyền, sinh lý học và sinh hóa học vào việc phát triển các dòng chè đặc trưng. Đối với các nước trồng chè nổi tiếng trên thế giới hiện nay như: Ấn Độ, Trung CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 10 Quốc, Nhật Bản, Kenya, Đài Loan…đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trên chè thu được một số thành tựu bước đầu trong việc chuẩn hóa quy trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy mô chè.  Ưu điểm: – Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. – So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. – Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng. – Phục tráng giống.  Nhược điểm: – Đòi hỏi kỹ thuật cao. – Chi phí cao. 6.6 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành in vitro Đây là phương pháp nhân giống dựa trên sự kế thừa của phương pháp giâm cành truyền thống và nuôi cấy mô. Bằng cách sử dụng một hom chè mang một mầm nách qua khử trùng được giâm trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất kích thích sinh trưởng. Hom chè sẽ được kích thích cho tăng trưởng tạo rễ và tạo chồi trực tiếp từ hom chè, không qua giai đoạn tạo cụm chồi và cấy chuyền. Từ một hom chè ban đầu qua giâm cành tạo thành một cây con phát triển hoàn chỉnh rễ thân lá, rồi tiến hành trồng ra đất.  Ưu điểm – Làm cho cây con thuần nhất và sinh trưởng tốt, cây được làm trẻ lại và ít nhiễm bệnh. – Giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có ý nghĩa trong công tác phục tráng giống và nhân giống chè. – Hệ số nhân giống cao. – Có thể tiến hành nhân giống quanh năm, rút ngắn thời gian nhân giống. – Tuổi chung của cây chè tạo ra từ giâm cành in vitro nhỏ hơn tuổi chung của cây chè được tạo ra từ giâm cành truyền thống.  Nhược điểm – Chi phí tốn kém. – Kỹ thuật giâm cành chè in vitro hiện nay đang ở giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. – Chưa tìm ra chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp cho hom chè được lấy trực tiếp từ đồng ruộng. – Trong chè hàm lượng tanin cao, gây khó khăn lớn trong việc khử trùng mẫu, và sự hóa nâu của môi trường do tanin trong mẫu tiết ra làm hóa nâu môi trường làm hom chè dễ bị chết hoại. 2.7 Cơ sở của giâm cành chè 7.1 Cơ sở hình thành callus và rễ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 11 Khi cắt đoạn thân chè giâm vào trong môi trường dinh dưỡng thích hợp sau một thời gian sẽ xuất hiện những mô lồi màu trắng nhạt hay vàng nhạt đó la callus. Nhờ sự biến đổi của tế bào tượng tầng chu luân và các tế bào nhu mô ở cạnh mô sẹo xảy ra hiện tượng phản phân hóa và tại những chỗ riêng biệt của callus dưới tác động của chất kích thích sẽ tạo ra các tế bào mới là nhóm tế bào phân sinh, chúng phát triển thành các mấu lồi là nguồn gốc của rễ non. Chúng chọc thủng vỏ hóa bần của mô sẹo và chui ra ngoài (trích dẫn bởi Lê Tuyết Hoa, 1990). Callus được coi là nguồn cung cấp dinh dưỡng vì không bào chứa nhiều chất dự trữ cần thiết để tạo rễ. Theo Mitshuhashi (1969), Mai Trần Ngọc Tiếng (1983) và Nguyễn Bá (1987) quá trình hình thành rễ gồm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: giai đoạn chuẩn bị, khởi sự bằng sự hoạt động của một vài tế bào tầng phát sinh libe gỗ hoặc chu luân để tạo một nhóm tế bào sơ khởi. Giai đoạn 2: là giai đoạn kéo dài của tế bào sơ khởi. Mỗi giai đoạn do một nhóm kích tố điều khiển. Các kích tố của giai đoạn hai phối hợp với nhau tạo sự cân bằng thích hợp thì rễ bất định mới tạo đủ số lượng và chiều dài thích hợp cho cây (trích dẫn bởi Lê Tuyết Hoa, 1990). Chất điều hòa sinh trưởng auxin có tác động kích thích ra rễ. Theo Hartmann và Kester’s (2002), sự hình thành rễ bất định chịu ảnh hưởng của chồi và lá có trên cành giâm. Đối với một số loài, nếu ta cắt bỏ lá hoặc chồi thì cành giâm sẽ không ra rễ hoặc ra rễ rất ít mặc dù có xử lý với chất kích thích ra rễ. Vì lá và chồi là nơi sản sinh ra auxin và vận chuyển xuống gốc để kích thích sự hình thành rễ, lá còn cung cấp carbonhydrat cho sự phát triển của rễ. 7.2 Cơ sở hình thành chồi Chồi là mầm mống của cành cây, nó bắt đầu khởi động rất sớm dưới dạng mấu lồi trong nách phôi thai, lá còn nằm trong chồi, về sau mấu chồi phát triển thành chồi nách. Khi còn ở cành bình thường các chồi không phát triển được nằm trong trạng thái ngủ nghỉ. Khi cành chè được cắt thành từng hom làm mất ảnh hưởng của ưu thế ngọn. Các mầm nách thoát khỏi giai đoạn ngủ nghỉ phát triển thành chồi mới. Các hom chè được cắt đem giâm trong môi trường chứa cytokinin ở nồng độ thích hợp ,các mầm nách sẽ phát triển thành chồi. 8 Chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những chất liệu với liều lượng thấp hiệu lực sinh học cao. Các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Các chất điều hoà sinh trưởng được chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng với nhau là điều cần thiết. Hiện nay có năm nhóm chất điều hoà sinh trưởng thường sử dụng: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh trưởng. 8.1 Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Auxin bị phân huỷ bởi ánh sáng, có tính phân cực.  Chức năng của auxin Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thước của các cơ quan, ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào như cenlulose, pectin. Điều chỉnh tính hướng động của cây: quang hướng động và địa hướng động. Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích bằng việc ức chế sinh trưởng của CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 12 chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống dưới. Kích thích sự hình thành rễ. Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù. Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý, trao đổi chất khác. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Torry và ctv.,1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hoá các enzyme tác động nới lỏng vách tế bào và enzyme tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Prat, 1993). Auxin hoạt hoá sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin,…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2002). 8.2 Cytokinin Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh. Đây là chất hoạt hoá sự phân chia tế bào, đồng thời làm tăng quá trình chuyển hoá acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô.  Đặc điểm của cytokinin Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng ngọn và hướng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là ure. Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA và TDZ  Chức năng của cytokinin Vai trò sinh lý đặc trưng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào. Ảnh hưởng lên sự hình thành và phân hoá cơ quan đặc biệt là phân hoá chồi. Kìm hãm quá trình hoá già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân huỷ của diệp lục, protein và acid nucleic. Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn. Ảnh hưởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô gồm mô sẹo sinh trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và ctv., 1985; Taiz và ctv., 1991).  Vai trò của cytokinin trong kích thích sự tạo chồi Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỷ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi có nhiều nước. Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin. Nồng độ cytokinin cao (0,5 – 10,0 mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và ctv., 1991; Humphries, 1960; trích bởi Vũ Văn Vụ, 2003). Tùy vào từng loại cây trồng và mục đích sử dụng để kết hợp hợp lý nồng độ axin và cytokinin. 9 Các nghiên cứu về in vitro trên chè 9.1 Chất khử trùng mẫu CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 13  Theo Debergh và Vanderschaeghe (1988), mẫu chè lấy trực tiếp từ đồng ruộng đã bị nhiễm bẩn bởi nhiều nguồn khác nhau tùy theo từng cơ quan và bộ phận, đó là nguyên nhân chủ yếu gây tổn thất trong nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cấy mô. Thông thường mẫu cấy được lấy từ những cây phát triển được sàng lọc, bảo vệ từ ruộng thí nghiệm. Theo Sandal và ctv. (2001), đã tiến hành rửa sạch hom chè bằng Tween 20 trong 15 phút, sau đó khử trùng bề mặt hom chè bằng thủy ngân clorua 0,04% trong 5 phút rồi rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng. Mondal và ctv. (1998) tiến hành khử trùng bề mặt hạt chè bằng Natri clorua 4% trong 10 phút, sau đó rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng.  Sharma và ctv. (1999) tiến hành khử trùng mẫu hom chè có mang hai đốt bằng Streptomycin sulphate 0,001% trong 10 – 15 phút, sau đó khử trùng bằng thủy ngân clorua 0,04% trong 7 – 8 phút rồi rửa sạch bằng nước cất từ 3 – 4 lần. Ogutaga và Northcote (1970) đã dùng đoạn thân chè dài 5 -15 mm được trồng trong nhà kính khử trùng bề mặt với cồn 70o sau đó khử trùng mẫu bằng dung dịch natri hypoclorit 7%.  Kato (1985, 1989) dùng những đoạn thân chè có từ 3 – 4 lá từ những cây chè được trồng trong nhà kính (giống Yabukira) khử trùng mẫu bằng Canxi hypoclorit 7% trong 20 phút. Arulpragasam và Latiff (1986) đã tách bỏ những lá có cuống lá nằm sát thân một cách cẩn thận tránh gây hại cho mầm nách. Sau đó khử trùng bề mặt bằng dung dịch clo 10 – 15% trong 15 phút lắc mẫu liên tục sau đó rửa sạch bằng nước cất và cấy vào môi trường. Karanuki và Shibata (1993) làm giảm vi khuẩn nội sinh có trong mẫu bằng cách lấy những mẫu cấy ở mô phân sinh ngọn và những lá mầm non với kích thước 0,5 mm. Theo Nakamura (1989) tỉ lệ nhiễm của mẫu phụ thuộc theo mùa. Để làm giảm nấm ta thu thập, lấy mẫu vào đầu mùa khi nhiệt độ không khí tương đối thấp và chọn những cây trưởng thành khỏe mạnh. Haldeman và ctv. (1987) đã chỉ ra một biện pháp quan trọng để làm giảm vi khuẩn và nấm, nhưng không gây độc cho mẫu bằng benomyl (1, 2, 4 g/l) và rifampicin (10, 25, 50 mg/l). Das và Barman (1988) xử lý mẫu bằng Streptomycin sulfate 1% ngăn chặn sự tái nhiễm của mẫu thí nghiệm. Rajacumar và Ayyappan (1992); Rajashekaran và Mohankumar (1992); Jha và Sen (1992); Agarwal và ctv. (1992) đã dùng dung dịch thủy ngân clorua 0,05 – 1,0% khử trùng bề mặt mẫu đối với mẫu thí nghiệm. 9.2 Môi trường và vật liệu vô trùng mẫu Murashige và Skoog (1962) đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường MS của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây trong đó có áp dụng phổ biến trên chè.  Theo Sandal và ctv. (2001) thực hiện vô trùng mẫu hom chè, Camellia sinensis (L) O. Kuntze, 30 năm tuổi tạo nguồn vật liệu sạch cho thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml có bổ sung 100ml môi trường MS với 0,8% agar bổ sung thêm BA (8,88µM), IBA (0,98µM) và 3% đường. Mondal và ctv. (1998), tiến hành vô trùng mẫu hạt chè Camellia sinensis (L) O. Kuntze bằng cách cho hạt nảy mầm trong môi trường 1/2 MS bổ sung sucrose 30g/l và agar 8g/l (Qualigens, Bombay) tạo cây trong ống nghiệm sau 60 ngày làm vật liệu cho vi nhân giống chè. Sharma và ctv. (1999) vô trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var. China hybrid trong môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l và agar 8 g/l (Qualigens, Bombay). Theo Nguyễn Thanh Mai và Nguyễn Sĩ Tuấn (2005), quá trình vô trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var. Oo-Long được tiến hành trong erlen 100ml có bổ sung 20 ml môi trường MS, agar 8g/l, TDZ 1mg/l, sucrose 30g/l. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 14 9.3 Môi trường tạo chồi  Sandal và ctv. (2001) tiến hành cắt khúc những hom chè được tạo thành từ vật liệu vô trùng mẫu, có chiều dài từ 0,5 – 1,0 cm đem cấy vào trong môi trường MS lỏng lắc, lỏng tĩnh và môi trường đặc với TDZ (2,5 µM, 5,0 µM, 10,0 µM) và BA (4,4 µM, 8,8 µM, 17,7 µM). Thể tích môi trường nuôi cấy chứa trong bình tam giác 250ml là 10ml, 20ml, 50ml. Kết quả thu được như sau: Sự nhân chồi chè tốt nhất trên môi trường MS lỏng tĩnh với nồng độ TDZ 2,5 – 5,0 µM, và thể tích môi trường chứa trong bình tam giác 250ml phù hợp nhất cho tái sinh chồi là 20ml. Thời gian cấy chuyền từ 6 – 8 tuần trong phòng thí nghiệm tiết kiệm giá thành và sản xuất có hiệu quả hơn so với phương pháp tạo protocols bằng vi nhân giống chè trong môi trường đặc với 4 tuần một lần cấy chuyền. Trong thí nghiệm TDZ là một cytokinin làm giảm tỉ lệ chết hoại của mẫu cấy tái sinh chồi chè trong môi trường lỏng tốt hơn BA (Mok và ctv. 1982; Huetteman và Preece, 1993).  Mondal và ctv. (1998), từ những cây mọc trong ống nghiệm trong vô trùng mẫu sau 60 ngày gieo cắt thành những hom có chiều dài 1 cm. Tiến hành nuôi cấy trong hai môi trường WPM và môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l và agar 0,8g/l. Nồng độ TDZ (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với nồng độ NAA (5µM, 10 µM, 15 µM) và BAP (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với IBA(5µM, 10 µM, 15 µM). và BAP (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với NAA 5µM. Kết quả thu được với nồng độ 5µM TDZ và 10µM NAA thu được (98%) mẫu cảm ứng tạo chồi, chồi kéo dài ra. Cảm ứng tạo chồi của 5µM NAA với 10µM BAP là (77,9%) và 5µM IBA với 5µM BAP (84,8%). Mặc dù tỉ lệ cảm ứng tạo mô sẹo của BAP cũng tương đối cao nhưng sau 2- 3 lần cấy chuyền mẫu bị hóa nâu và chết hoại. TDZ tỏ ra phù hợp hơn trong việc nhân nhanh và tái tạo chồi trên chè. Môi trường MS đặc thích hợp hơn môi trường WPM đặc. Sandal và ctv. (2000) đã tiến hành nuôi cấy mô chè bằng cách tạo mô sẹo từ các mắt mầm trong điều kiện có ánh sáng trên môi trường MS lỏng tĩnh có thêm chất điều hoà sinh trưởng TDZ và IBA. Trên giống chè Camellia sinensis var. TV-1, T-78, UPASI-9 và KangraJat.  Sood và ctv. (1993) Nuôi cấy chè tạo ra từ protocols trong nuôi cấy mô bằng phương pháp vi nhân giống chè trong môi trường MS + IBA (0,98 µM) + BA( 8,88 µM) trên giống chè Camellia sinensis var. Kangra Jat trên môi trường lỏng tĩnh, môi trường lỏng. Tahardi (1994), đã nhân giống chè trong ống nghiệm trên môi trường WP có GA3 thu được 30% tỉ lệ tạo chồi. Trần Hoài Khải (2002), tiến hành tạo mô sẹo thu được môi trường MS + 100ml nước dừa + 3mg BA + 50mg adenin sulfate và môi trường MS + 100ml nước dừa + 5mg BA + 5 mg NAA tỏ ra thích hợp trong nuôi cấy mô chè. Nguyễn Thanh Mai và Nguyễn Sĩ Tuấn (2005) từ cành chè được hình thành từ quá trình vô trùng mẫu cắt lá thứ ba tính từ đỉnh cây xuống được cắt thành mẫu cấy 5 – 10 mm được dùng làm vật liệu thí nghiệm. Các phản ứng phát sinh hình thái mô được thử nghiệm trên môi trường MS1 có bổ sung 30g/l sucrose và các nồng độ IBA (0,05; 0,1; 0,5 mg/l) và BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l). Các mô sẹo được hình thành sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1 được chuyển sang môi trường MS2 có bổ sung các nồng độ ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) và tổ hợp của BA và IBA để tái sinh chồi. Kết quả thu được: Sau 14 ngày nuôi cấy trên tất cả các nồng độ mô sẹo cảm ứng trên lá thứ 3 tính từ ngọn xuống với kích thước 5 – 1 mm. Các phát thể chồi bất định phát triển từ mô giai đọan nuôi cấy kéo dài trong 8 tuần tốt nhất trên môi trường có bổ sung IBA 0,05 mg/l, BA 2,0 mg/l, ABA 1,0 mg/l. Các thể chồi phát triển từ mô sẹo chỉ khi ABA được thêm vào môi trường nhằm gây ức chế sự tăng sinh của khối mô sẹo và kích thích sự phát thể chồi của khối mô sẹo. 9.4 Môi trường tạo rễ Sandal và ctv. (2001) tiến hành cắt những chồi chè có chiều dài 3 cm được hình thành trong quá trình nuôi cấy mô rồi nhúng vào dung dịch IBA 4,92 µM trong 30 phút, sau đó CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 15 chuyển sang khay chứa tỉ lệ cát: đất: 2: 1 dưới điều kiện trồng trong phòng thí nghiệm. Sau 60 ngày chồi mọc rễ và chuyển sang chậu để trong nhà kính. Nguyễn Thanh Mai, Nguyễn Sĩ Tuấn (2005) từ các chồi tái sinh trong quá trình nuôi cấy được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 3mg/l và 1g/l than hoạt tính và môi trường IBA 5mg/l không có agar. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy các rễ bất định được hình thành. 10.5 Hạn chế sự hoại mẫu Hàm lượng phenol trong chè rất cao, tiết ra môi trường từ vết cắt của mẫu cấy trải qua quá trình oxy hóa trở thành chất độc cho mẫu cấy. Những chất độc này được giảm bằng cách hạ thấp pH môi trường nuôi cấy. Sarwar (1985) thử bỏ một số chất hóa học khác nhau vào trong môi trường như acid ascorbic, catechol, l-cystein, phloroglucinol, phenyl-thiourea, polyvilyl-pyrolidone- 10, natri diethyl dithio-carbonat, natri flouride và thioure với những nồng độ khác nhau của môi trường muối khoáng MS. Ông đã tìm ra nồng độ cao để ngăn chặn sự hóa nâu của mẫu của MS là 1/20.  Pandidurai và ctv. (1996) đã báo cáo thành công việc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường mới định kỳ cũng ngăn chặn tốt quá trình hóa nâu của mẫu. Trần Hoài Khải (2002), tiến hành khử tanin trong chè bằng lòng trắng trứng đã thu được những dấu hiệu khả quan về biện pháp khử tanin, thời gian khử tốt là 120 phút và thu được từ 30 - 40% mô sẹo. Từ những cơ sở lý luận trên làm cở sở cho thí nghiệm thử nghiệm quy trình giâm cành chè in vitro. III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu thí nghiệm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 16 1.1. Đối tượng thí nghiệm Hom chè (VD ở nước ta hom chè TB14 được lấy từ Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao kỹ thuật cây công nghiệp và