Đề tài Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1

m nhập vào các tế bào lành khác. Ở niêm mạc đường hô hấp trên, virus cúm bị các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể như dịch mũi họng, dịch phế nang và IgA tiết … chống lại. Khi virus cúm vượt qua được hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm vào máu, cuối cùng xâm nhập vào các cơ quan tổ chức. Triệu chứng lâm sàng Thời gian ủ bệnh là từ vài giờ đến 21 ngày, các triệu chứng bắt đầu xuất hiện một ngày sau khi virus phá vỡ tế bào chui ra. Bệnh nhân cúm A có hiện tượng sốt liên tục trên 380C, đau đầu, đau cơ, ho, đau họng, bệnh nhân khó thở (nhịp thở lúc chỉ còn 30-40 lần/phút), độ bão hoà oxi giảm, tụt huyết áp, bạch cầu giảm. Chụp X quang thấy phổi tổn thương nhanh hơn theo từng ngày, dẫn đến sốc rồi gây tử vong. Những trường hợp nhiễm cúm nặng được đặc trưng bởi sốt cao, đột ngột và tử vong nhanh với tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất là ở trẻ em, nhưng tỷ lệ nhiễm cúm nặng và tỷ lệ tử vong cao nhất là ở người già trên 65 tuổi. I.3.2. Nguồn lây truyền bệnh cúm A/H5N1 Bằng chứng sinh thái học và nguồn gốc phả hệ virus cúm A cho thấy thuỷ cầm chính là nguồn tàng trữ virus cúm A, từ đó truyền sang các vật chủ khác như ngựa, lợn, gà, có thể lây sang cả cá voi và chim biển, người. Sau đó virut gây bệnh và gây dịch ở các loài này và dịch bệnh ở người. Gà bị nhiễm virus cúm sẽ thải virus cúm qua đường mỏ hoặc đường phân. Đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễm nguồn nước và nguồn thức ăn, tạo điều kiện cho sự lan truyền virus trong quần thể người và động vật. Mối quan hệ lây nhiễm của virus cúm A I.4. Những hiểu biết cơ bản về virus cúm A/H5N1 I.4.1. Đặc điểm chung của virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae Họ Orthomyxoviridae được chia làm 4 nhóm: Nhóm viruscúm typ A Nhóm virus cúm typ B Nhóm viruscúm typ C Nhóm Thogotovirus Hạt virion có dạng hình cầu, đôi khi ở dạng sợi, đường kính khoảng 80-120nm, trọng lượng phân tử của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton. Hệ gen là sợi ARN đơn âm, được ký hiệu là ss(-) ARN, kích thước hệ gen thường 10.000-15.000 nucleotide và có cấu trúc phân thành 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các protein chức năng của virus. Lõi virus mang vật liệu di truyền và 3 polymerase, PB1, PB2, PB3 đều được gắn với nucleoprotein dạng xoắn helica, phức hệ này tạo thành nucleocapsid. Bao quanh nucleocapsid là lớp protein nền (matrix protein), ký hiệu là M1, tiếp đó là màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ. Lớp vỏ virus có bản chất là lipoprotein, bao gồm những gai mấu có bản chất là protein trần hoặc đã được glycosyl hoá gắn chặt vào lớp kép lipid nhờ các tương tác kỵ nước, kích thước của những gai mấu có độ dài 10-14nm, đường kính 4-6nm. Có khoảng 500 gai mấu chia làm 2 loại: gai HA (hemagglutinin), gai NA (neuraminidase). Matrix protein RNA segment Nucleocapsid Ion chanel NA Inllustration of virus HA Lipid envelope a b a- Hình thái của virut cúm typ A; b- Cấu trúc hạt virion của cúm typ A I.4.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng Virus cúm typ A có hệ gen là ss(-) ARN mang 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các protein cấu trúc hoặc không cấu trúc của virus. Phân đoạn 1, 2, 3: mã hoá cho các protein PB1, PB2, PB3. Những protein này có chức năng là các ARN polymerase phụ thuộc vào ARN cần cho quá trình tổng hợp mARN và ARN hệ gen của virus. Phân đoạn 4: mã hoá cho protein HA. HA là các gai mấu có bản chất là glycoprotein, nằm rải rác trên bề mặt của virus cúm gây ngưng kết hồng cầu và tham gia vào một số chức năng sau: HA khởi đầu quá trình xâm nhiễm bằng cách gắn vào thụ thể sialic axit trên bề mặt tế bào vật chủ, sau khi chui vào tế bào sự dung hợp diễn ra để giải phóng ARN vào tế bào chất. Phân đoạn 5: mã hoá cho nucleoprotein (NP). Phân đoạn 6: mã hoá cho protein enzym neuraminidase (NA). NA là các gai mấu trên bề mặt của virus, có bản chất là glycoprotein, vừa đóng vai trò là kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym. Enzym neuraminidaza phân cắt liên kết giữa thụ thể sialic axit và HA nhờ vậy đẩy nhanh quá trình lan truyền của virus trong hệ thống đường hô hấp. Phân đoạn 7: mã hóa cho chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên hai protein, protein nền (matrix protein)- ký hiệu là M1 và protein M2 đóng vai trò là kênh ion,nằm trên bề mặt của virus. Protein M1 là loại protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong virion, với chức năng chính là làm ổn định hình thái của virion. Protein nền này cũng mang kháng nguyên đặc hiệu typ, qua đó được sử dụng để xác định virus cúm typ A, B, C. Phân đoạn 8: là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy, Webster, 1996; Sekellick et al., 2000). Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) này được tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97 (Webster, 1998), trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc lực (Zhu et al., 2008). NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.103 Da (trên thực tế là 25.103 Da), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.103 Da (trên thực tế là 12x103 Da), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới (Sekellick et al., 2000; Zhu et al., 2008). Như vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới. I.4.3. Sự biến đổi tính kháng nguyên HA,NA và sự hình thành các phân typ mới Nguyên nhân gây các vụ dịch lớn hay đại dịch thường do những nguyên nhân chính sau : Nguyên nhân thứ nhất là do sự biến đổi kháng nguyên trên bề mặt của virus cúm, có hai hình thức biến đổi kháng nguyên. Biến đổi nhỏ (antigenic drift): là những thay đổi từ từ trong protein hemagglutin và neuraminidase khi virus mang những đột biến nhỏ và tiến hoá qua thời gian để trốn thoát khỏi kháng thể đặc hiệu của cơ thể vật chủ. Sự tích luỹ từ hai đến ba đột biến sẽ dẫn đến tạo thành một phân typ mới có thể gây đại dịch lớn. Biến đổi lớn (antigenic shift): là những biến đổi lớn và đột ngột trong cấu trúc của protein hemagglutin và neuraminidase dẫn đến sự tạo thành một phân typ virus mới. HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt có mức độ biến đổi rẩt cao : có 15 biến thể gen HA (từ H1đến H15) và 9 biến thể gen NA (từ N1 đến N9). Sự tổ hợp lại của những biến thể gen thường kéo theo một phân typ cúm mới có khả năng gây nên đại dịch (ví dụ H2N2 năm 1957 và H3N2 năm 1968). Ngoài ra một nguyên nhân chính nữa đó là do hệ gen của virus cúm typ A phân đoạn tạo điều kiện cho sự trao đổi gen và sự tái tổ hợp trở lại, khi có hai phân typ cúm khác nhau xâm nhiễm vào một cơ thể vật chủ. Hơn nữa là do virus cúm thích ứng tồn tại trên rất nhiều loại vật chủ: người và các loài động vật như gà, vịt, lợn, ngựa, chim…, nên các loài này luôn là nguồn tàng trữ virus. Đồng thời tính thích ứng lan truyền nội, ngoại loài tạo cơ hội cho sự hình thành các tái tổ hợp gen mới, ví dụ: năm 1968, phân typ cúm H3N2 ở người là kết quả của sự tái tổ hợp gen H2N2 ở người và H3 của virus trong tự nhiên; H7N7 của hải cẩu có thể do sự tái tổ hợp gen của 2 hay 3 loại virus cúm ở chim; H1N1 và H3N2 phân lập năm 1978 và năm 1989 gây bệnh ở người có cấu trúc protein bề mặt được lấy từ nguồn gen tái tổ hợp từ H1N1 hoặc H1N2 và 4-6 gen có nguồn gốc từ H3N2. Các chủng virus cúm phân lập được, được qui định danh pháp theo trình tự như sau: typ huyết thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA và NA. ví dụ: A/chicken/Vietnam/HD1/2004(H5N1) là chủng virut cúm typ A phân lập trên gà tại Việt Nam, ký hiệu chủng là HD1, năm phân lập là năm 2004, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. I.4.4. Chu trình sinh sống của virus cúm typ A Virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cơ chế ẩm bào nhờ tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên HA và thụ thể là axit sialic trên màng tế bào vật chủ. Khi pH môi trường trong khoang ẩm bào thấp, sẽ diễn ra sự dung hợp giữa lớp vỏ lipoprotein của virus và lớp kép lipit của thể endosome, giải phóng RNP (ARN và các protein PB1, PB2, PB3 được bao bọc bởi nucleoprotein) vào tế bào chất của tế bào vật chủ, sau đó được chuyển vào trong nhân. Tại đây chúng sử dụng bộ máy của hệ thống vật chủ và enzym ARN polymerase phụ thuộc vào ARN do virus mang theo để tổng hợp nên mARN thông tin, mARN sau khi trải qua cải biến cắt bỏ intron, được adenyl hoá ở đầu 3’ sẽ được chuyển ra tế bào chất để tiến hành dịch mã tạo các protein cấu trúc hoặc không cấu trúc, hầu hết các protein được tổng hợp ở lại trong nguyên sinh chất, số khác lại được chuyển vào trong nhân để tiếp tục quá trình tổng hợp nguyên liệu di truyền và tham gia vào quá trình bao gói vật liệu di truyền. ARN đơn âm được chuyển thành ARN đơn dương theo cơ chế bổ sung, và sợi dương này lại làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN đơn âm mới nhờ ARN polymerase phụ thuộc vào ARN vừa được tổng hợp. Các sợi ARN hệ gen được tạo thành là một sợi hoàn chỉnh về độ dài, không được mũ hoá ở đầu 5’ và không được adenyl hoá ở đầu 3’. Sau đó chúng được bao bọc lại để hình thành nên ribonucleocapsit sau đó được chuyển đến màng tế bào, nơi đã được gắn sẵn các gai HA, NA, M2 nhờ hệ thống Golgi chuyển ra và hạt virion mới được hình thành được giải phóng theo lối nảy chồi. Sự nhân lên của virut cúm typ A I.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm typ A và phòng chống bệnh I.5.1. Phương pháp chẩn đoán Phân lập virus cúm typ A từ dịch tiết của đường hô hấp (dịch mũi, họng) sau đó tiến hành chẩn đoán nhanh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, hoặc tiến hành nuôi cấy trong phôi gà. Chẩn đoán theo phương pháp huyết thanh học: dùng kháng thể kháng HA trong huyết thanh làm phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu. Chẩn đoán bằng các phương pháp sinh học phân tử: kỹ thuật RT-PCR kết hợp với ELISA để so sánh và tăng khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh. Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để chẩn đoán nhanh và chính xác virus cúm typ A và phân typ H5N1. I.5.2. Phương pháp phòng và chống bệnh Một số loại hoá dược liệu được dùng trong điều trị các trường hợp nhiễm cúm bao gồm chất ức chê enzym neuraminidase, Amatadine và Rimantadine, cơ chế hoạt động của những loại nay như sau: Chất ức chế enzym neuraminidase: ngăn cản sự giải phóng của virus khỏi tế bào bị nhiễm, có hiệu quả đối với cả cúm typ A và cúm typ B. Amatadine: ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào vật chủ bằng cách ức chế quá trình cởi bỏ vỏ của virus cúm typ A, thuốc được dùng cho cả phòng bệnh và điều trị đối với những trường hợp nhiễm cấp tính. Rimantadine: ức chế quá trình sao chép của các phân typ H1N1, H2N2, H3N2. Ngoài ra để phòng bệnh một cách hiệu quả, người ta đã triển khai các vắc xin chống cúm. Đã có hai loại vắc xin cúm là vắc xin sống giảm độc lực và vắc xin bất hoạt. Tuy nhiên vắc xin này chỉ có thể tạo ra sức đề kháng đối với một số chủng cúm nhất định, do virus cúm luôn biến đổi đặc tính kháng nguyên nên vắc xin sản xuất từ các chủng cũ không có khả năng phòng vệ đối với các chủng đã biến đổi. Chủng H5N1 được coi là loại biến chủng có độc lực cao nhất đối với người và động vật, nên gây chết phôi gà rất nhanh. Chính vì vậy không thể sử dụng nguồn phôi gà để nuôi cấy virus H5N1 nhằm tạo văc xin bất hoạt. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và mạng lưới các phòng thí nghiệm của WHO đang thực hiện tạo vắc xin H5N1 bằng phương pháp nhân tạo có tái tổ hợp gen của virus cúm H5N1 đương nhiễm, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch nhưng không gây bệnh. Tuy nhiên H5N1 có khả năng biến đổi nội gen nhanh nên vấn đề vắc xin không thực sự dễ dàng. Vì vậy để phòng chống nhiễm bệnh cần thực hiện những biện pháp tổng hợp như giám sát dịch tễ học, chẩn đoán nhanh, chính xác các phân typ nhằm mục đích cách ly, tiêu diệt mầm bệnh hiệu quả. I.5.3. Kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật Real- time PCR được cải tiến dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, là một phương pháp mới đang được một số phòng thí nghiệm trên thế giới khai thác có hiệu quả trong nhiều ứng dụng trong đó có việc phát hiện và định lượng DNA và RNA với độ chính xác và tính đặc hiệu rất cao, có thể phát hiện được sự có mặt của chỉ một bản sao của sợi khuôn ban đầu. I.5.3.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) Nguyên tắc: Lai đặc hiệu của ADN theo nguyên tắc bổ sung: A liên kết với T bằng hai liên kết hydro, G liên kết với C bằng ba liên kết hydro. Tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase. Điều kiện: Khuếch đại ADN đích cần phải biết trình tự nucleotit ở hai đầu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Các bước cơ bản của phản ứng PCR, gồm 3 bước chính: Bước 1- bước biến tính: Tách ADN sợi đôi thành ADN sợi đơn ở nhiệt độ 94-95 0C trong khoảng thời gian từ 30”- 1’. Bước 2- bước gắn mồi: nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào nhiệt độ T0m của mồi, trong khoảng thời gian từ 30-60”. Bước 3- kéo dài chuỗi: nhiệt độ thích hợp cho enzym Tag ADN polymerase hoạt động là 72 0C, trong khoảng thời gian 30” đến vài phút, tuỳ thuộc vào kích thước đoạn ADN cần khuếch đại. Một số bước phụ trong phản ứng PCR: Hot start: ADN ban đầu phải được biến tính hoàn ở 94-95 0C trong khoảng 2-5 phút. Mục đích của bước này là làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng, do mồi có thể bám vào ngay ở nhiệt độ thường và kéo dài chuỗi. Kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi: vân tốc tổng hợp chuỗi của Tag polymeraza là 60 nu/s, nhưng trong thực tế nếu nhân một đoạn có kích thước 1kb thì cần 1 phút. Làm lạnh ở 4 0C bảo vệ cấu trúc của AND. Nguyên tắc thiết kế mồi: Dựa trên trình tự nucleotit đã biết của đối tượng nghiên cứu hoặc đối tượng liên quan, mồi phải nằm trong vùng ít biến đổi của hệ gen. Dựa trên kích thước hệ gen: chiều dài mồi nên đủ lớn để sao cho 4n lớn gấp đôi hệ gen. Trình tự nên có 50-60% G + C, Tm của hai mồi phải gần như nhau, tránh lặp lại những trình tự giàu G-C (dễ tạo cấu trúc kẹp tóc bền). Mồi xuôi và mồi ngược phải tránh hiện tượng ghép cặp bổ sung tạo dạng dimer Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược không được quá lớn, thích hợp nhất là dưới 1000 nucleotide. Dùng các phần mềm để thiết kế mồi. 1.5.3.2. Những hạn chế của kỹ thuật PCR truyền thống và những cải tiến của kỹ thuật Real-time PCR. Để hiểu rõ hơn những hạn chế của kỹ thuật PCR truyền thống và những ưu điểm của kỹ thuật Real-time PCR, ta cần xem một phản ứng PCR diễn ra qua các giai đoạn nào. Một phản ứng khuếch đại cơ bản trải qua 3 giai đoạn, giống như đồ thị sinh trưởng. Giai đoạn 1 (exponential): nhân lên theo cấp số mũ, số bản sao được tăng gấp đôi chính xác qua mỗi chu kỳ. Giai đoạn 2 (Linear): nguyên liệu trong phản ứng khuếch đại giảm dần, giai đoạn này có sự khác biệt rất lớn giữa các mẫu khác nhau (số lượng bản sao ban đầu, kích thước đoạn cần khuếch đại…). Giai đoạn 3 (end-point): không có sự khuếch đại diễn ra, sản phẩm PCR bắt đầu có sự phân huỷ (đối với kỹ thuật PCR truyền thống, sản phẩm ở giai đoạn này được đem điện di trên gel agaroza 1%). Kỹ thuật PCR Kỹ thuật Real-time PCR -Sau khi phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm phải đem điện di trên gel agarose để biết kết quả. -Phản ứng được giám sát từ khi bắt đầu phản ứng cho đến khi kết thúc, thông qua một hệ thống camera theo dõi sự phát huỳnh quang ở từng mẫu. - Số bản sao ở chu kỳ cuối của các mẫu có thể là khác nhau, song gel agarose có độ phân giải kém nên có thể không phát hiện ra sự khác nhau này. Agarose gel chỉ phân biệt được khi số lượng bản sao hơn kém nhau 10 lần. - Real-time PCR rất nhanh nhạy, khuếch đại đoạn ADN có kích thước dưới 400bp và có thể phân biệt khi có sự chênh lệch về số bản sao khoảng 2 lần. - Một số vấn đề gặp phải khi phát hiện sản phẩm tại pha cuối của phản ứng PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose: độ chính xác thấp, độ nhạy kém, độ phân giải thấp, không được tự động hoá, phân biệt các băng nhân bản chỉ dựa vào kích thước, kết quả không được hiển thị bằng dạng số, nhuộm bằng ethidium bromide hiệu quả thấp, và đặc biệt là trường hợp có sự phân huỷ sản phẩm PCR ở giai đoạn cuối. - Real-time PCR đã khắc phục được những nhược điểm này của kỹ thuật PCR truyền thống: số liệu được thu ở giai đoạn nhân lên theo cấp số mũ, tín hiệu phát huỳnh quang thu được tỉ lệ với số bản sao được nhân lên, không có sự phân huỷ sản phẩm PCR ở giai đoạn cuối… I.5.3.3. Hiểu biết cơ bản về kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật Real- time PCR được cải tiến dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này cho phép giám sát phản ứng trùng hợp chuỗi ngay khi nó bắt đầu diễn ra và số liệu thu được trong suốt quá trình diễn ra phản ứng PCR, không phải sau khi phản ứng PCR đã kết thúc. Kỹ thuật này đã đưa lại một cuộc cách mạng trong định lượng ADN và ARN. Trong kỹ thuật này, phản ứng được đặc trưng là phát hiện ngay khi có sự khuếch đại ADN đích đầu tiên, chứ không cần sự tích luỹ số lượng bản sao ADN sau một số chu kỳ nhất định. Số lượng bản sao ban đầu càng lớn, thì tín hiệu huỳnh quang thay đổi càng nhanh. Ngược lại, trong phản ứng PCR chỉ có thể đánh giá lượng bản sao tích luỹ sau khi phản ứng kết thúc. Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng hai loại chất hoá học để phát hiện sản phẩm PCR đó là: TaqMan® và SYBR® Green I dye. Sự khác biệt lớn nhất giữa hai loại hoá chất này là: SYBR® Green I dye phát hiện ADN mạch đôi, bao gồm cả sản phẩm đặc hiệu và không đặc hiệu. TaqMan® chỉ phát hiện sản phẩm đặc hiệu được nhân lên trong phản ứng PCR. Nguyên tắc hoạt động của TaqMan®: sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu, được diễn biến theo các bước sau: Một mẫu dò oligonucleotit được thiết kế với đầu 5’ mang một chất phát tín hiệu huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ mang một chất kìm hãm sự phát tín hiệu huỳnh quang này (quencher) . Khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn thì có sự truyền năng lượng từ reporter sang quencher làm giảm khả năng phát sáng của reporter khi ở trong một khoảng cách nhất định. Sự truyền năng lượng từ reporter sang quencher được gọi là FRET (fluorescence resonant energy transfer) và được giải thích như sau:… Nếu trình tự nucleotit đích có mặt, mẫu dò sẽ bám vào theo nguyên tắc bổ sung và mẫu dò sẽ bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ nucleaza của Tag DNA polymeraza khi mồi được kéo dài. Sự phân cắt này sẽ tách reporter khỏi quencher làm tăng tín hiệu phát huỳnh quang và loại bỏ mẫu dò khỏi trình tự đích, cho phép mồi tiếp tục kéo dài mà không ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chuỗi. Hơn nữa reporter bị phân cắt khỏi mẫu dò ở mỗi chu kỳ có nghĩa là tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự nhân lên của trình tự đích. Hình vẽ minh hoạ nguyên tắc hoạt động của TaqMan® Nguyên tắc hoạt động của SYBR® Green I dye: khi liên kết với các ADN sợi đôi chất này sẽ phát tín hiệu huỳnh quang, diễn biến theo các bước sau: Khi SYBR® Green I dye được bổ sung vào một mẫu, lập tức nó sẽ gắn với ADN sợi đôi. Phản ứng kéo dài chuỗi nhờ AmpliTag Gold® sẽ tạo ra số bản sao nhiều gấp đôi sau mỗi chu kỳ. SYBR® Green I dye sẽ gắn với các bản sao ADN mạch đôi này. Tín hiệu huỳnh quang tăng lên tỷ lệ với số lượng bản sao được tạo thành. Hình vẽ minh hoạ nguyên tắc hoạt động của SYBR® Green I dye Những ưu điểm và hạn chế của hai phân tử chất hoá học này: TaqMan® SYBR® Green I dye Ưu điểm -Tín hiệu huỳnh quang được phát ra chỉ khi có sự gắn của mẫu dò vào trình tự đích. -Mẫu dò có thể được đánh dấu bằng các loại reporter khác nhau cho phép phát hiện đồng thời hai trình tự đích khác nhau trong cùng một mẫu. -Quá trình phân hủy sản phẩm ở giai đoạn cân bằng được loại bỏ. -Được sử dụng để phát hiện bất cứ một trình tự đích ADN mạch đôi nào. -Không cần thiết kế mẫu dò vì vậy giảm chi phí và giảm bước chuẩn bị hoá chất. Hạn chế -Hạn chế lớn nhất của phân tử chất hoá học này là: phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau để phát hiện các trình tự đích khác nhau. -Hạn chế cơ bản nhất của phân tử chất hóa học này là: vừa gắn vào sản phẩm đặc hiệu, lại vừa gắn vào sản phẩm không đặc hiệu. Vì vậy không được sử dụng trong trường hợp phát hiện đột biến. I.5.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật Real-time PCR nhanh nhạy hơn kỹ thuật PCR truyền thống và hơn nữa với khả năng thu số liệu ở giai đoạn nhân lên theo cấp số mũ nên nó mở rộng hơn những ứng dụng ví dụ như: Định lượng virus. Đánh giá sự biểu hiện của gen. Đánh giá hiệu quả thuốc trong điều trị bệnh. Phát hiện đột biến. Chẩn đoán bệnh. Bệnh cúm là một bệnh đường hô hấp có nguy cơ lây nhiễm rất cao, dễ dàng trở thành dịch bệnh và bệnh này diễn ra hàng năm gây bệnh và tử vong đáng kể. Người già và trẻ em là đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao, thường gây chết hoặc biến chứng nghiêm trọng. Vì vậy, tầm quan trọng của việc chẩn đoán nhanh bệnh này không chỉ là đưa ra liệu pháp điều trị phù hợp, mà còn nhằm mục đích xác định nhanh sự bắt đầu khởi phát của một vụ dịch cúm. Gần đây, chất ức chế enzym neuraminidase là loại thuốc chống virut có hiệu quả cao với cả virus cúm A và cúm B khi mới xuất hiện triệu chứng. Với sự phát triển trong phương pháp điều trị mới này, việc chẩn đoán nhanh cúm càng có trở nên cấp thiết. Các phương pháp chẩn đoán thông thường vẫn được sử dụng: phân lập virus thông qua nuôi cấy, phát hiện kháng nguyên, và các phân tích huyết thanh học. Tuy nhiên mỗi phương pháp này đều có những hạn chế, ví dụ: Phân lập virus là phương pháp chẩn đoán rất nhạy, song thời gian tiến hành từ 1 đến 2 tuần, trong khi thời gian ủ bệnh là rất ngắn và bệnh tiến triển rất nhanh, nên khi thu được kết quả từ nuôi cấy sẽ là quá muộn để đưa ra những biện pháp can thiệp hiệu quả. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cho kết quả nhanh nhưng độ chính xác không cao. Kỹ thuật Real-time PCR được cải tiến từ kỹ thuật PCR truyền thống nhằm giải quyết những hạn chế của các kỹ thuật trên, đó là chẩn đoán nhanh nhạy và độ chính xác cao. II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu II.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là chủng virut cúm gia cầm H5N1 đã được bất hoạt trong dung dịch trizol do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu II.2.1. Tách chiết ARN tổng số Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzym RNaza có mặt khắp mọi nơi, ngay cả trên ngón tay của người thao tác. Phân tử RNaza có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân làm mất hoạt tính của chúng. Vì vậy việc tách chiết ARN đòi hỏi phải thận trọng để tránh mọi sự tạp nhiễm RNaza từ môi trường. Thao tác phải trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hoá chất đều được xử lý DEPC trước khi đem khử trùng bằng áp lực hơi nước. Có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tách chiết ARN của virut cúm H5N1, v trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp hoá học của Chomezynski và Sachi, Anal. Biochem. (1987), 156-159. Các bước tiến hành: Bổ sung 200 ml dung dịch chloroform vào huyền dịch virut đã được bất hoạt trong trizol (400 ml dịch virut trong 400 ml trizol), đảo đều trong 15 giây. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó đem ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C. Chuyển pha trên vào một ống Eppendorf mới. Bổ sung 0,5 ml isopropanol. Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C để thu tủa ARN. Rửa tủa lại bằng ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 5 phút ở 40C. Làm khô ARN trong Box, hoà lại trong 20 ml nước siêu sạch, đã được xử lý bằng DEPC để loại RNaza. II.2.2. Kiểm tra ARN tổng số bằng quang phổ kế Để có thể xác định tương đối nồng độ của ARN tổng số tách từ huyền dịch cúm H5N1, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pirimidin. Nồng độ ARN sợi đơn (mg/ml) sẽ được tính theo công thức CARN = A260 x 40 x d, trong đó d là độ pha loãng mẫu cần đo. Cách tiến hành như sau: Dung dịch ARN thu được, được đem pha loãng 20 lần trong nước siêu sạch (5 ml dung dịch ARN trong 95 ml nước). Chuyển dung dịch ARN đã được pha loãng sang cóng thạch anh nhỏ của máy quang phổ Shimadzu và đo sự hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác nếu ARN thu được là sạch. Nếu dung dịch còn chứa protein thì protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm, do đó làm sai lệch nồng độ thật của ARN trong mẫu. Muốn biết việc xác định nồng độ ARN có chính xác hay không, cần đo thêm giá trị A280 (protein hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 280 nm). Nếu tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1.8-2 thì mẫu tách chiết ARN được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ sạch để ti