Đề tài Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh đối kháng

ác chất dinh dưỡng, các chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng và sự phát triển của mẫu cấy. Chất làm đông cứng môi trường: Là giá thể cho mẫu cấy. Thường dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 800C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ hơn 400C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nước cao, chỉ cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nước và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu được các chất dinh dưỡng từ môi trường. III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào: Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 5 bước sau: Bước 0: Bước chuẩn bị Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau: Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần. Có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus. Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối ưu về điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn. Bước 1: Nuôi cấy khởi động Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ thuộc từng đối tượng nuôi cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy như mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non. Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu sạch vi sinh vật nhưng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phương pháp sát trùng bề mặt bằng chất hoá học, thường là HgCl2 0,1% sát trùng trong 5-10 phút. ít phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit như NaOCl, Ca(OCl)2 5% trong 20-30 phút. Ngoài ra còn dùng H2O2 15%,dung dịch Brom 5-10% nhưng hiệu quả không cao. Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào môi trường thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính. Việc lựa chọn môi trường thích hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng trong môi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh được hình thái. Bước 2: Nhân nhanh mẫu Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này được coi là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không ưu việt của phương pháp nuôi cấy mô tế bào. ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất điều khiển sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein...kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy nhiên, tuỳ từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể đạt được hệ số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường trong bước 2 vào môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở một số loài như chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt được trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng. Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào. Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ thành công hơn nếu trước khi đưa cây con ra đất ta ươm cây trên cát có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đượcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường. Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế bào.Đó là: Sự bất định di truyền + Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra hiện tượng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro. + Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia tăng ảnh hưởng của các chát điều khiển sinh trưởng. Sự nhiễm mẫu cấy + Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trường sau 2-3 tuần nuôi cấy. + Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu Sự tiết độc tố từ mẫu cấy + Sau 1-2 ngày đưa vào môi trường, mẫu cấy tiết ra những chất màu đen, nâu làm hỏng môi trường, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin, polyphenol bị oxy hoá. + Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lượng tanin, polyphenol ; gây vết thương cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm trong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit xitric; bổ sung vào môi trường than hoạt tính để hấp phụ các chất nói trên. Hiện tượng thuỷ tinh hoá mẫu cấy + Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nước, trở nên trong suốt, có hình dạng không bình thường + Khắc phục: Bổ sung vào môi trường chất gây áp suất cao, chất ức chế tổng hợp etilen, tăng cường độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi . IV. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác giống cây trồng: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro được ứng dụng để: Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống. Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao. Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh. Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro được quan tâm hơn cả. Người ta ước tính có khoảng 300 loại cây có thể được nhân giống bằng phương pháp này. Lợi ích của nó là ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể cây con với số lượng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ, đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trưởng tốt và cho năng suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, người ta có thể tạo ra được hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng khắc phục được những điều kiện bất lợi. Phương pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh. ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước đã được thành lập và cho đến nay đã thu được một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi... Tại trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây chất lượng cao, bước đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía Nam đã xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy trình nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm...có giá trị cao. Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh học cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hướng đi mới cho nghiên cứu di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật..., đặc biệt nó đem lại những ứng dụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng. V.Kết quả và thảo luận Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vườn của viện Di truyền nông nghiệp. - Mẫu cây được cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm. - Rửa mẫu bằng nước rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nước sạch 3 lần. - Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng nước sạch 3 lần. - Khử trùng mẫu bằng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sạch bằng nước cất. - Cắt cành thành từng đoạn ngắn, mỗi đoạn có ít nhất một mắt ngủ. - Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy có nồng độ aucin-cytokinin thích hợp, sau 3 tuần các mắt ngủ sẽ phát triển thành chồi. - Thường sau quá trình này câty được nuôi cấy bằng phương pháp cắt lát mỏng để có được hệ số nhân nhanh lớn. -Sau khi đã có được chồi tiến hành xử lý ra rễ bàng cách cắt chồi cấy vào môi trường thích hợp,sau khoảng 2 tuần sẽ có rễ. - Khi cây đã có rễ có thể tiến hành việc thích nghi cây với điều kiện sống tự nhiên trong vườn ươm :có giả thể thường là đất trộn trấu hun có bổ sung các nguồn chất dinh owỡng trong điều kiện chiếu sáng 50%. - Một thời gian sau,nếu tỷ lệ cây sống đạt hơn 85% có thể đem cây con trồng trong điều kiện bình thường. Phần ii: chẩn đoán bệnh I.Khái niệm 1.Tình hình bệnh hại trên giống cây trồng thực vật ở Việt Nam. Để đảm bảo an ninh lương thực đồng thời phát triển nhanh nền kinh tế, trong những năm gần đây Việt Nam đã nhập nhiều giống cây trồng và hoa cây cảnh từ nhiều quốc gia trên thế giới. Điều này luôn kèm theo các nguy cơ xân nhập của vi sinh vật gây hại, đặc biệt là các bệnh hại thực vật thuộc diện KDTV ở Việt Nam. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, bệnh hai thực vật gây nên những thiệt hại vô cùng to lớn và chúng đang làm ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng sản phẩm cũng như năng suất cây trồng. Đặc biệt là bệnh hại do virus gây ra: Virus PVY là virus gây bệnh thối củ khoai tây, làm giảm năng suất củ tới 80%, nó cũng gây thiệt hại đáng kể trên cây cà chua, ớt, thuốc lá. Khi thuốc lá bị nhiễm virus này thì năng suất giảm tới 30%. Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn. Việc áp dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh học phân tử và Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đáp ứng được đòi hỏi cấp bách của KDTV. Một số tác nhân gây bệnh thường thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá. Virus khảm dưa chuột – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hình nhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. Virus này được lan truyền qua Aphis gossyphii. Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Xuất hiện dịch bệnh không có quy luật báo trước. Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV) Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất là dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất cà chua, gây ảnh hưởng đến chất lượng thuốc lá. Virus này được lan truyền bằng con đường cơ học, đồng thời đối với cà chua virus này còn lan truyền qua hạt. Nó thuộc nhóm Tobamovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Virus Y khoai tây – Potato Y Viruses (PVY). Loại virus này gây ra các loại khảm và các dạng hoại tử ở thịt và gân lá khác nhau, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. Vectơ của virus này là các loại muội khác nhau. Nó thuộc nhóm polyvirus có cấu trúc ARN mạch đơn. 2.Sự lan truyền virus trong tự nhiên Virus thực vật không thể tự lây nhiễm vào các mô, tế bào của vật chủ mà chúng chỉ thâm nhập vào khi các tế bào hoặc các mô của vật chủ bị tổn thương. Trong tự nhiên quá trình này được thực hiện thông qua các vi sinh vật khác, những sinh vật mang virus từ cây này truyền cho cây khác gọi là vectơ truyền bệnh. Ngày nay những phương thức truyền bệnh của virus đã được xác định, bao gồm những phương thức sau: 2.1 Lây lan cơ học Các virus thực vật truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ nếu nồng độ virus trong cây bệnh và độ bền vững của virus là cao như các bệnh khảm thuốc lá, khảm cà chua, khảm dưa chuột chúng có thể truyền trực tiếp từ cây này sang cây khác khi lá chạm vào nhau, hoặc gián tiếp qua môi trường đất, nước, quần áo người lao động, chân tay Nhân giống vô tính cũng là phương thức là cho virus xâm nhập vào các vật chủ thông qua các dụng cụ chiết, cắt, ghép 2.2 Lan truyền qua chất dinh dưỡng Virus có khả năng lây nhiễm vào tất cả các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, củ mầm Những cây mới phát triển từ vật nhiễm virus đều duy trì cho virus sống từ mùa này sang mùa khác là nguồn lan truyền bệnh virus ra nhiều vùng trên thế giới. 2.3 Lan truyền qua hạt. Trước đây người ta cho rằng bệnh virus không lây lan qua hạt, đến năm 1910 đã phát hiện virus khảm cà chua, 1919 virus khảm đậu và ngày nay đã có những bằng chứng về sự lây lan của bệnh virus thông qua hạt. 2.4 Lan truyền nhờ các vectơ truyền bệnh Các vectơ truyền bệnh có thể là công trùng, rệp, bét, nấm người ta chia côn trùng truyền bệnh thành 4 nhóm: - Côn trùng sau khi mang virus lấy từ cây lây bệnh chỉ có khả năng truyền bệnh sau đó 1-2h, lâu hơn nữa thì virus không còn khả năng lây nhiễm, được gọi là tồn tại không vĩnh viễn (Non persistent). - Côn trùng sau vài giờ mang virus từ cây bệnh mới có khả năng truyền bệnh sang cây khác. Khả năng này chỉ tồn tại trong vài ngày liên tục, trường hợp này gọi là bán vĩnh viễn (semi-persistent). - Côn trùng chỉ cần 15 phút lây nhiễm virus từ cây bệnh nhưng chỉ có thể truyền bệnh sau đó vài giờ và truyền bệnh liên tục trong một vài tuần, gọi là truyền bệnh vĩnh viễn tuần hoàn (persistent circulative). - Côn trùng sau 15 phút lây virus có thể truyền bệnh liên tục suốt cả chu kỳ sống và cả thế hệ sau đó vẫn còn nguyên khả năng truyền bệnh, gọi là truyền bệnh vĩnh viễn lan truyền (persistent psopagative). 3. Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym ( ELISA – enzym linked immuno _sorbent assay) Phương pháp thử miễn dịch dựa trên phản ứng giữa một kháng nguyên và một kháng thể là những protein có trọng lượng phân tử lớn thu được do tạo miễn dịch ở máu nóng của động vật có vú ( chuột, thỏ, ngựa, dê...) bằng những phân tử gây miễn dịch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mạch bổ xung ,...).Trong trường hợp này kháng thể được gọi là kháng thể đa dòng (polyclonaux) vì chúng được tạo ra từ các dạng hoạt hoá của một quần thể dị chất của những tế bào limpho B trong máu động vật. Chúng là một hỗn hợp của các kháng thể khác nhau phản ứng với nhiều điểm cuối của kháng nguyên hoạc những đỉnh của phân tử gây miễn dịch. Phản ứng kháng thể – kháng nguyên là một công cụ rất hiệu nghiệm để chuẩn đoán bệnh virut, vi khuẩn, nấm, mycoplasma, tuyến trùng và các véc tơ truyền bệnh. Hiện nay kỹ thuật ELISA còn giúp chúng ta xác định được hàm lượng thuốc trừ sâu (pesticide) tồn dư trong đất. Các phân tử đánh dấu cũng là một phức hợp kháng thể –kháng nguyên đã được sử dụng từ lâu để chuẩn đoán bệnh cho phép nhận thấy kết quả bằng mắt thường. Hiện nay việc sử dụng các phân tử phóng xạ để đánh dấu đã bị hạn chế .Bên cạnh đó, người ta thường dùng enzym (Alkaline phosphatasa), peroxidaza, chất floresence và Avidin –Biotin để tăng độ nhạy của phép chuẩn đoán ta cũng có thể sử dụng các chất huỳnh quang, phosphattase alkaline... Phương pháp miễn dịch liên kết enzym được nhiều tác giả hoàn thiện vào năm 1971 (Avrameanvà Cs; Van Weemen và Cs; Engvall và Cs ). Nhóm cuối cùng đã sử dụng thuật ngữ ELISA (Enzym linked immuno –sorbent assay) lần đầu tiên vào năm 1971 để áp dụng vào phương pháp định lượng một vài kháng thể đặc hiệu. Đây là phương pháp được phát triển bởi rất nhiều tác giả và là một phương pháp nhanh nhậy trong chuẩn đoán và định lượng một số kháng nguyên, kháng thể. Nó đã được Voller và đồng nghiệp ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh virut thực vật năm 1976. Clack và Adams ở Anh là hai trong những người đầu tiên dùng phương pháp này để chuẩn đoán 2 bệnh virut là AWM ( Arabis Mosaic Virus) và PPV ( Plum PoxVirut). Phương pháp này rất nhạy, cho phép thăm dò ở mức nhiễm rất thấp. Để thực hiện phương pháp ELISA, ta phải tinh chế kháng thể (IgG) và biết sử dụng kháng thể đánh dấu. Sự đánh dấu kháng thể cho phép nhìn thấy phản ứng kháng nguyên kháng thể và tăng thêm khả năng thăm dò của những phản ứng đặc hiệu. Phân tử đánh dấu có thể là enzym, chất phóng xạ (S35 hoặc I128), kim loại (hoặc chất keo ), hoặc chất huỳnh quang. Phản ứng miễn dịch diễn biến ở pha rắn. Virus được giữ lại bằng cách chọn lọc và cố định bằng một kháng thể đặc hiệu hấp thụ trên bề mặt vật cứng tại các going của một vi chuẩn độ ( plaque de microtitration ) cấu tạo bằng polyvinyl hoặc polystyrene. Những phản ứng khác nhau xảy ra liên tiếp và những phân tử tự do được loại trừ bằng các lần rửa. Phản ứng của virus cũng tập trung và được tăng cường bằng một pha đưa thêm vào một kháng thể đặc hiệu có gắn một enzym đánh dấu, có phản ứng hoàn toàn với virus và được tìm ra bằng nhuộm màu trong diễn biến giảm dần của enzym ỏ chất nền thích hợp. Sự thuỷ phân diễn ra qua một phản ứng màu quan sát được bằng mắt hoặc đo bằng dụng cụ quang học. Trong trường hợp không có virus trong mẫu kiểm tra, enzym gắn với kháng thể không giữ lại được giữ lại và sẽ không có mẫu. Phương pháp ELISA không những đáp ứng được những tiêu chí phức tạp mà còn dễ dàng tự động hoá và dễ dàng tìm kiếm những chất phản ứng trên thị trường . Ư'ng dụng của ELISA trong việc phòng chống và phát hiện bệnh: Nhận biết các tác nhân gây bệnh chủ yếu, đưa ra những dữ liệu về bệnh dịch học, xác định được mức độ nhiễm để quản lý đánh giá các giống kháng bệnh Thu được các nguyên liệu thực vật sạch bệnh bằng quy trình chọn giống sạch bệnh ở những giai đoạn nhân giống khác nhau. Kiểm tra nguyên liệu thực vật nhập nội và ngăn ngừa sự xâm nhập của các bệnh lạ vào lãnh thổ. Theo dõi thường xuyên các loại vi sinh vật, phát hiện và diệt trừ ổ dịch có thể là các kho chứa các vật truyền bệnh (côn trùng, tuyến trùng, nấm) II.Vật liệu và nghiên cứu 1.Vật liệu nghiên cứu. 1.1 Vật liệu thực vật. Các mẫu cà chua thu thập tại vườn thí nghiệm của viện di truyền nông nghiệp. Vật liệu vi sinh Loại bệnh được nghiên cứu là : Potato virus Y, Tobaco etch virus. 1.3 Các dung dịch đệm dung trong DAS-ELISA. Dung dịch Coating pH=9,6 NaCO3 1,59g NaN3 0,20g NaHCO3 2,93g Nước cất 2 lần 1000ml Dung dịch PBS pH7,4 NaCl 8,00g KCl 0,20g KH2PO4 0,20g NaN3 0,20g Na2PO4 42,9g Nước cất 2 lần 1000ml Dung dịch PBS – T: PBS + 0,5ml Tween 20. Dung dịch PBS – T – PVP PBS – T + 2% PVP (polyvinyl pyrolidone) Dung dịch hiện màu (Substrate) pH9,8 Diethanolamine 97,00ml NaN3 0,20g Nước cất 2 lần 900ml 2 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu. 0,5 gam mẫu được lấy ở các vị trí khác nhau (Virus để chẩn đoán bệnh ta lấy mẫu ở lá, một số mẫu lấy ở ngọn ) và được nghiền trong dung dịch chiết. Mẫu được nghiền trong dung dịch dịch chiết với tỷ lệ 1/10 (1mg/ 10ml dung dịch đệm). Sau đó dịch nghiền được lọc qua bông thuỷ tinh để giữ lại những phần thực vật không bị nghiền nát để thu được một dịch đồng nhất. Dịch này được pha loãng với các tỷ lệ khác nhau để: Xác định ngưỡng giới hạn của phép thử (Giới hạn độ hoà loãng kháng nguyên). Tìm ra nồng độ hoà loãng tốt nhất, nó có nồng độ đủ để chẩn đoán lượng tác hân gây bệnh và đông thời phép thử không bị che khuất bởi sắc tố diệp lục của cây. (Để loại trừ diệp lục trong dịch chiết mẫu ở nồng độ hoà loãng thấp ta tiến hành ly tâm ở 7000 rpm trong 5 phút) 2.2 Phương pháp DAS-ELISA, các bước tiến hành *Nguyên lý của phương pháp DAS-ELISA Dùng kháng thể đa dòng bao phủ bề mặt giếng để bắt giữ kháng nguyên thích hợp Cho kháng nguyên vào Kháng thể gắn enzyme được sử dụng để phát hiện Cuối cùng là sự nhân biết các mẫu bằng phản ứng tương tác với chất hiện màu.  Hình 1. Nguyên lý của phương pháp ELISA “Sandwich kẹp kháng thể 2 lần” – Phương pháp trực tiếp. Đặt kháng thể đặc hiệu Kháng thể Kháng nguyênngnguyên nguyên Bề mặt cứng Đặt kháng nguyên Thể cộng hợp (Conjugate) Enzyme Đặt kháng thể có gắn ENZYME gọi là thể cộng hợp (conjugate) Kháng thể Chất nền cho phản ứng nhuộm màu Biểu hiện của phản ứng Các bước tiến hành Đặt kháng thể đặc hiệu đã được hoà loãng trong dung dịch đệm coating vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ trong 2h ở 370C Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS – T. Cho dịch cây nghiên cứu đã được hoà loãng trong dung dịch đệm PNS – T + PVP vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ ở 370C trong 2h hoặc 1 đêm ở 40C. Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS – T. Đặt kháng thể gắn enzyme Phosphataza kiềm đã được hoà loãng trong dung dịch đệm PBS – T + PVP vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ ở 370C trong 2h hoặc 1 đêm ở 40C. Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS – T. Chất nền của enzyme là para Nitro Phenyl Phosphat (pNPP) pha vào dung dịch đệm hiện màu substrate nồng độ 2mg/ml sau đó cho vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ ở 370C trong 30 phút đến 2h. Khi muốn dừng phản ứng thì dùng 50ml dung dịch NaOH 3M để dừng phản ứng. Đọc kết quả bằng máy so màu quang học ở bước sóng 405nm. Chỉ số quang học D.O thể hiện kết quả của phản ứng O.D lớn gấp 2 lần O.D đối chứng sạch bệnh là cây đã bị nhiễm virus (Theo Sanofi-Pasteur). Iii: Kết quả và thảo luận Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Mẫu đối chứng đối với 10 giếng đầu tiên là TEV: kiểm tra mẫu cà chua. Mẫu đối chứng đối với 10 giếng tiếp theo là TSV: kiểm tra mẫu cà chua. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B TP 1 4 7 10 - 3 6 9 C TP 1 4 7 10 - 3 6 9 D + 2 5 8 TP 1 4 7 10 E + 2 5 8 TP 1 4 7 10 F - 3 6 9 + 2 5 8 G - 3 6 9 + 2 5 8 H Bảng tổng hợp kết quả đo O.D Tên virus Mẫu TEV (Tobacco Etch Virus) TSV (Tobacco Spot Virus) 1 1.6985 0.3165 2 1.6440 0.330 3 1.583 0.294 4 1.925 0.3075 5 2.548 0.3035 6 1.1665 0.3005 7 1.378 0.325 8 1.817 0.268 9 * 0.2815 10 1.870 0.440 TP 1.4205 0.206 P * 0.3385 N 1.945 0.318 Từ bảng kết qủa nói trên ta thấy: Với bệnh do virus TEV gây ra trên cây cà chua, mọi mẫu phân tích đề cho kết quả gần tương tự như mẫu đối chứng sạch, thậm chí có mẫu còn cho kết quả nhỏ hơn, điêù này cho phép ta kết luận mẫu cà chua đem phân tích hoàn toàn không bị nhiễm TEV. Với bệnh do virus TSV gây ra, hầu hết các mẫu phân tích đều cho kết quả O.D nhỏ hơn mẫu đối chứng sạch, chỉ có mẫu số 2 là cho kết quả lớn hơn nhưng lại chỉ lớn hơn có 1.037 lần. Mẫu số 10 có chỉ số O.D lớn hơn cả chỉ số mẫu đối chứng dương. Như vậy kết quả mẫu phân tích cho ta thấy cây đêm phân tích bước đầu đẫ nhiễm virus TSV. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của DAS-ELISA: 1. ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản: - Mẫu sau khi tách chiết được chia ra bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau 20, -4, -20 và -840C cho những giá trị OD khác nhau rõ rệt. Từ số liệu thu được cho thấy -840C cho giá trị cao nhất. 2. ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu tới kết quả thí nghiệm: - Mẫu tiến hành thí nghiệm ngay sau khi được tách chiết cho kết quả chính xác nhất. Nghĩa là nêu skhông bắt buộc phải bảo quản mẫu trong -840C cho kết quả chính xác và nhạy nhất. Nếu sử dụng mẫu qua bảo quản kết quả sẽ cho độ nhạy kém hơn và chỉ nên dùng một lần không nên lặp lại. 3. ảnh hưởng của thời gian bảo quản đĩa tới kết quả thí nghiệm sau khi cho kháng thể hút bám bề mặt các giếng: - Khi so sánh giá trị OD đối với đối chứng bệnh và đối chứng sạch của thí nghệim ở tại các thời điểm sau khi cho kháng thể hút bám bề mặt giếng cho thấy thời gian bảo quản đĩa khác nhau không ảnh hưởng tới giá trị OD. 4. ảnh hưởng của bọt khí khi cho dung dịch chất hiện màu vào trong mỗi giếng trước khi đọc kết quả: Giá trị OD thay đổi rất lớn trong cùng một mẫu khi có bọt khí và không có bọt khí trong các giếng, thậm chí trong một số trường hợp đối chứng sạch bệnh cho kết quả dương tính (bị bệnh). Vì vậy hết sức tránh có bọt khí khi đặt kháng nguyên, kháng thể và chất nền để kết quả được chính xác hơn. Phần III : Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và nấm đối kháng. I.Tổng quan Mỗi loại cây đều có một hệ vi sinh vật đặc trưng cho cây đó. Nghiên cứu về hệ vi sinh vật tham gia vào sự sinh trưởng, phát triển cũng như duy trì nòi giống ở thực vật là một trong những nội dung quan trọng giúp cho việc nâng cao sức sống, năng suất cũng như phẩm chất tốt của cây trồng. *Nhóm vi sinh vật gây bệnh sống nhờ vào chất hữu cơ của thực vật đang sống, chúng tiết ra các hợp chất phân huỷ mô và tế bào thực vật làm cây chết (khác với nhóm hoại sinh- sống trên những tế bào thực vật đã chết). Vi sinh vật gây bệnh có khả