Đề tài Nghiên cứu kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối của bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nền y học hiện đại đã phát hiện và điều trị được rất nhiều bệnh, nâng cao chất lượng sức khỏe của con người. Nhưng bên cạnh đó còn nhiều bệnh nan y chưa tìm ra phương pháp chữa trị, trong đó các bệnh di truyền vẫn là một trong những bài toán khó giải đối với nền y học. Một trong những bệnh di truyền đang được quan tâm rất nhiều hiện này là hội chứng Down ( Down syndrome ). Hội chứng Down là hội chứng hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể. Các hậu quả do hội chứng Down gây ra cho con người là rất lớn : sảy thai, sinh con mang dị tật, trẻ sơ sinh chết sớm, trí tuệ chậm phát triển và vô sinh. Những người mang hội chứng Down cũng đã trở thành những gánh nặng rất lớn cho gia đình và xã hội. Hiện nay y học vẫn chưa tìm ra được phương pháp chữa trị hội chứng Down mà mới chỉ có thể hạn chế trẻ mang hội chứng Down bằng phương pháp chẩn đoán trước sinh. Phương pháp để phát hiện hội chứng Down phổ biến nhất ở Việt Nam hiện nay là sử dụng Tripple test và siêu âm thai nhi, sau đó lập karyotype để xác định trisome 21 ( tam nhiễm nhiễm sắc thể 21 ). Nhưng phương pháp này hiện nay thường cho kết quả để phát hiện hội chứng Down với độ chính xác chưa đạt được 100% [2]. Với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật hiện nay, kỹ thuật PCR đang được áp dụng rất rộng rãi trong nền y học hiện đại. Kỹ thuật PCR được Kary Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về DNA nói riêng, về sinh học phân tử nói chung đạt được những thành tựu đáng kinh ngạc. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ trong bộ gene được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng 2 sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA trong in vitro nhờ enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA làm khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10-3 µg). Điều này đặc biệt quan trọng và có ý nghĩa đối với việc phát hiện những mẫu DNA ít như chẩn đoán nhiễm khuẩn trong y học, xác định tội phạm gây án trong kỹ thuật hình sự, khi mà DNA thu được từ các mẫu thường rất ít. Hiện nay chúng ta đã tìm ra được rất nhiều gene nằm trên nhiễm sắc thể 21 có liên quan đến hội chứng Down, trong đó có 1 gene rất quan trọng là gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ). gene SOD -1 nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 21, quy định tổng hợp enzyme SOD -1. Enzym SOD -1 nằm trong bào tương của các tế bào Eukaryota, có chức năng chống oxi hóa bằng cách chuyển O2 - thành H2O2 , sau đó enzym Catalase hoặc Glutathione peroxidase (GPx) sẽ chuyển H2O2 thành O2 và H2O. Người mắc hội chứng Down có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được tổng hợp nhiều hơn bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa của nó cũng tăng theo. Thông thường ở hầu hết các mô thì sự tăng enzyme SOD-1 thường kéo theo các enzyme Catalase và GPx tăng theo tương ứng. Nhưng trong các tế bào thần kinh thì không có sự tăng theo của 2 enzyme trên, chính vì vậy dẫn đến dư thừa lượng H2O2 trong các tế bào thần kinh, dẫn đến thoái hóa và phá hủy tế bào thần kinh. Tạo ra các biểu hiện lâm sàng của hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp (dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s cao ở độ tuổi trung niên [16,17]. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down ” với mục tiêu : 1. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối của bà mẹ mang thai. 2. Tối ưu hóa phản ứng PCR ( nồng độ DNA khuôn, chu trình nhiệt ) với gene SOD1 ở bệnh nhân mang hội chứng Down với bệnh nhân chứng. 3 CHƢƠNG I : TỔNG QUAN 1.Bệnh sử hội chứng Down : 1.1.Lịch sử nghiên cứu hội chứng Down : Hội chứng Down hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn NST ở trẻ sơ sinh sống . Năm 1846 , Seguin lần đầu tiên mô tả những đặc điểm hình thái của bệnh với tên gọi “ Furfuraceuos Indocy ”. Năm 1866 , John Langdon Down đã mô tả một số bệnh nhân chậm trí tuệ với những dấu hiệu về hình thái rất đặc trưng : mặt tròn , khe mắt xếch , nếp quạt , hình ảnh bất thường về nếp gấp ở lòng bàn tay và giảm trương lực cơ , … Năm 1959 , Lejenue và các cộng sự đã phát hiện ở những bệnh nhân mắc hội chứng Down có 47 NST và thừa 1 NST số 21 [2]. 1.2.Nguyên nhân hội chứng Down : Khoảng 92% trường hợp mắc hội chứng Down là thể tam nhiễm 2 NST số 21 thuần : 47,XX,+21 hoặc 47,XY,+21. Thể tam nhiễm 21 này xảy ra do rối loạn sự phân ly cặp NST 21 trong quá trình tạo giao tử, karyotype của bố mẹ trong trường hợp này là bình thường. Khoảng 1% những trường hợp này, người ta có thể quan sát thấy thể khảm với dòng thể tam nhiễm 21 rất ít ở một trong hai bố mẹ hoặc rối loạn cấu trúc của các NST khác ( không liên quan đến NST 21 ) trong bộ NST [2]. Khoảng 2-3% trường hợp là thể khảm với 2 dòng tế bào : một dòng tế bào chứa 46 NST và một dòng tế bào chứa 47 NST, thừa 1 NST số 21 : 46,XX/47,XY,+21 hoặc 46,XY/47,XX,+21 hoặc thể khảm xảy ra do rối loạn phân ly cặp NST 21 trong quá trình phân cắt hợp tử. Kết quả tạo nên dòng tế bào thể tam 4 nhiễm 21 bên cạnh dòng tế bào bình thường, dòng tế bào monosomi 21 bị loại bỏ [2]. Khoảng 4-5% trường hợp là thể chuyển đoạn, trẻ mắc hội chứng Down thể này có 46 NST với 2 NST số 21 và NST số 21 thứ 3 được chuyển đoạn với các NST tâm đầu khác trong bộ NST ( hay gặp là NST số 13,14 hoặc 15 thuộc nhóm D hoặc số 21.22 thuộc nhóm G ). Về triệu chứng lâm sàng không khác so với hội chứng Down do thể tam nhiễm 21 thuần, nhưng là bệnh có tính chất gia đình. Bố hoặc mẹ của những đứa trẻ mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là những người bình thường nhưng mang NST chuyển đoạn cân bằng giữa NST 21 với các NST số 13,14,15 (nhóm D) hoặc NST số 21,22 ( nhóm G) [2]. Bảng 1 : Khả năng tạo giao tử và hợp tử ở ngƣời mang NST chuyển đoạn giữa NST số 14 và NST số 21 [2]. Người mang NST chuyển đoạn Giao tử Thụ tinh (+14,21) Hợp tử Kiểu hình 14,t(14;21),21 - 14,21 - t(14;21) +14;21 14,14,21,21 14t(14;21),21 (1) (2) - t(14;21)21 - 14 +14,21 14 t(14;21), 21 14,14,21 (3) (4) - 14 t(14;21) +14;21 14, 14t(14;21), 21 (5) 5 - 21 14,21,21 (6) - 14, t(14;21) - 0 +14;21 14,14t(14;21),21,21 14,21 (7) (8) (1): Bình thường. (2): Lành mang NST chuyển đoạn. (3): Hội chứng Down do chuyển đoạn. (4): Monosomi NST số 21, chết phôi thai. (5): Thể tam nhiễm NST 14, thường chết phôi thai. (6): Monosomi NST số 14, chết phôi thai. (7): Thể tam nhiễm kép NST 14,21, chết phôi thai. (8): Monosomi kép NST 14,21, chết phôi thai. Cơ chế di truyền hội chứng Down do chuyển đoạn t(21q;22q) cũng tương tự như trường hợp hội chứng Down do chuyển đoạn t(14q;21q) [2]. 6 1.3.Tỷ lệ mắc bệnh : Hội chứng Down gặp khoảng 1/700-1/800 trẻ sơ sinh . Tần số này không có sự khác biệt nhau giữa các chủng tộc và giữa các tầng lớp xã hội trên thế giới. Theo những nghiên cứu gần đây nhất , tỷ lệ trẻ sơ sinh mắc hội chứng Down tỷ lệ với tuổi của người mẹ [2]: Ước tính tỷ lệ bị hội chứng Down (Công trình nghiên cứu của tiểu bang New York)[15] Tuổi người mẹ 20 25 30 33 35 36 38 40 Tỷ lệ ước tính 1/1925 1/1205 1/885 1/590 1/365 1/285 1/175 1/110 7 45 49 1/32 1/12 Ngoài ra, tuổi của người bố cũng ảnh hưởng tới tần số sinh con mắc hội chứng Down [2]. 1.4.Triệu chứng lâm sàng : Hội chứng Down có những biểu hiện điển hình dễ nhận biết : Đầu nhỏ , ngắn , mặt tròn , gốc mũi tẹt , khe mắt xếch , nếp quạt , khẩu cái hẹp , vòm cung cao , lưỡi to và dày hay nứt nẻ , thường thè ra ngoài làm cho miệng không đóng kín ( nửa mở )[2]. Tai nhỏ , có khi biến dạng , vị trí thấp [2]. Cổ ngắn , gáy phẳng rộng [2]. Bàn tay rộng , các ngón ngắn [2]. Chậm phát triển trí tuệ , chỉ số IQ trung bình khoảng 30-50. Giảm trương lực cơ và nhão dây chằng [2]. Nếp vân da bàn tay : nếp ngang duy nhất ở lòng bàn tay, có thể gặp ở một hoặc cả 2 bàn tay. Chạc ba trục ở vị trí cao thường gặp ở vị trí t”. Tần số hoa vân ở mô út tăng[ 2]. 8 Thường gặp là dị tật tim, tần số được xếp theo thứ tự là thông liên thất , thông liên nhĩ , còn ống động mạch. Dị tật tiêu hoá : chủ yếu là hẹp tá tràng , không hậu môn và phình to đại tràng ( Megacolon ) [2]. 1.5.Tiên lƣợng : Người mắc hội chứng Down thường bị chết sớm vì tật của tim hoặc tật của ống tiêu hoá, thường bị nhiễm khuẩn, thường dễ cảm ứng với bệnh bạch cầu. Trước đây khoảng 50% chết trong vòng 5 năm đầu, một số sống sót đến tuổi trưởng thành. Hiện nay do điều kiện xã hội, sự chăm sóc y tế được cải thiện nên bệnh nhân Down sống đến giai đoạn trưởng thành nhiều hơn, nhưng chỉ có một số ít bệnh nhân nữ sinh con. Nam mắc hội chứng Down vô sinh [15,17]. 1.6.Chẩn đoán hội chứng Down : Hội chứng Down cho đến nay vẫn chưa có khả năng chữa được. Vì vậy, chúng ta nên chẩn đoán trước sinh nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ mắc hội chứng Down. 1.6.1.Đối tƣợng cần chẩn đoán trƣớc sinh : + Tuổi của các cặp vợ chồng, nhất là tuổi của vợ ( ≥ 35 tuổi ). + Các cặp vợ chồng có tiền sử sẩy thai liên tiếp và đẻ con dị tật, đặc biệt là đẻ con mắc hội chứng Down. + Vợ hay chồng là những người mang NST chuyển đoạn cân bằng : 45,XX(XY),t(Dq;21q) hoặc 45,XX(XY),t(21q;Gq). + Vợ hoặc chồng có tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến : các chất phóng xạ , các hoá chất , …[2]. 9 1.6.2.Các phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh : + Xét nghiệm sàng lọc ( Triple test ) trong huyết thanh mẹ :  AFP: Alpha feto protein  HCG: Human chorionic gonadotropin  uE3: Unconjugated estriol (Estriol không liên hợp) Nếu người mẹ mang thai mắc hội chứng Down thì αFP và uE3 giảm, βHCG tăng. + Siêu âm thai : ở các tuần thứ 11 , 21 và 31 của thai nhi. Siêu âm thai có thể chẩn đoán hội chứng Down dựa vào các dấu hiệu như: khoảng sáng sau gáy ≥ 3mm ở 3 tháng đầu, ngắn xương cánh tay, xương đùi kèm theo dị tật tim, đa ối,… + Sinh thiết tua rau để phân tích NST.Sinh thiết tua rau hiện nay ít sử dụng vì phương pháp này gây tỷ lệ sảy thai khá cao ( 2-3%) [2]. + Nuôi cấy tế bào ối để phân tích NST. Hiện nay ở nước ta, đây là phương pháp chẩn đoán sau cùng để xác định chính xác thai nhi có mắc hội chứng Down hay không. Tế bào ối sau khi được nuôi cấy sẽ được xác định karyotype bằng phương pháp nhuộm băng G để chẩn đoán trisome 21. Trong những năm gần đây, kỹ thuật PCR đã có những thành tựu rất lớn trong nền y học giúp con người có thể chẩn đoán được nhiều căn bệnh di truyền thông qua việc phân lập và khuếch đại các gene gây bệnh, và đối với việc chẩn đoán hội chứng Down cũng vậy. Chúng ta đã xác định được rất nhiều gene trên NST 21 gây nên hội chứng Down : APP ( Amyloid beta A4 precusor protein ), DYRK ( Dual-specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A), IFNAR ( Interferon, Alpha, Beta, and Omega, Receptor ), DSCR1( Down Syndrome Critical Regional Gene 1),… và 10 trong đó có gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1). Chúng ta tiến hành chọc ối bà mẹ mang thai ( thời gian chọc ối tốt nhất là khoảng khi thai được 16-19 tuần tuổi- phương pháp chọc ối kinh điển ), sau đó tế bào ối sẽ được đem nuôi cấy, tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR để xác định gene đặc hiệu, sau đó đánh giá được kết quả sau khi so sánh với mẫu bình thường để đánh giá kết quả. Trong tương lai, kỹ thuật PCR được đánh giá sẽ là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down [16]. 2.Tình hình nghiên cứu hội chứng Down : 2.1.Trên thế giới : Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về hội chứng Down . Trước đây , ở các nước tiên tiến vẫn áp dụng chủ yếu để chẩn đoán hội chứng Down bằng phương pháp chỉ điểm huyết thanh. Rất nhiều nghiên cứu đã được đưa ra nhằm ngày càng hoàn thiện phương pháp này. Tại Châu Âu, Anh Quốc được xem là nước đi đầu trong nghiên cứu các xét nghiệm tầm soát hội chứng Down ngay từ khởi thủy cho đến hiện nay. Trước khi Integrated test ra đời, Double test, sau đó là Triple test là xét nghiệm được ưa chuộng tại Châu Âu. Tại Pháp, cho đến hội nghị về chẩn đoán tiền sản 2002, vẫn 11 còn nhiều bàn cãi về việc có nên chuyển chương trình tầm soát dùng Tripple test trong tam cá nguyệt thứ hai sang các test xét nghiệm ở giai đoạn sớm hơn không. Hiện tại, một số nước đã áp dụng Integrated test như Anh, Đức, Ý, Hà Lan, Thụy Sĩ, Bồ Đào Nha … Cho đến 1995, tại Mỹ, Double test, Triple test hay AFP sử dụng đơn độc được sử dụng trên nhiều labo xét nghiệm khác nhau. Tiếp sau đó, Quadruple test được lựa chọn sử dụng do độ phát hiện khá cao. Sau nhiều công bố về hiệu quả của Integrated test, ở Châu Mỹ hiện tại có Mỹ, Canada, Brazil, Venezuela đang sử dụng test này trong tầm soát. Tại Singapore, việc áp dụng Tripple test được bắt đầu những năm 90. Tổng kết việc thực hiện tầm soát hội chứng Down bằng Tripple test 1993-1998 cho thấy mặc dù tỷ lệ mẹ lớn tuổi sinh con có gia tăng nhưng tỷ lệ trẻ Down ra đời không gia tăng, chứng tỏ chương trình tầm soát thực hiện có hiệu quả. Hiện tại, đã có những nghiên cứu đánh giá về tầm soát hội chứng Down sớm trong tam cá nguyệt thứ nhất. Tại Đài Loan, từ 1995, đã có nghiên cứu khảo sát sự thay đổi hCG trong tam cá nguyệt thứ hai. Double test được sử dụng trong nghiên cứu tầm soát hội chứng Down từ 1996. Cho đến 2001, bắt đầu có nhiều khảo sát để sử dụng NT(Nuchael translucency – phương pháp đo độ dày da gáy của thai nhi ở 11 tuần tuổi bằng phương pháp siêu âm ) trong tầm soát [17]. Kết hợp NT và xét nghiệm PAPP-A trong tam cá nguyệt 1 cho phép chẩn đoán sớm hội chứng Down. 12 Bảng 2: Các chƣơng trình tầm soát hội chứng Down[15]. Loại test Bắt đầu áp dụng CĐHT được sử dụng Thời điểm Double test 1988 AFP, hCG/uE3 TCN2 Tripple test 1988 AFP hCG uE3 TCN2 Quadruple test 1996 AFP hCG uE3 InhA TCN2 Combined test 1997 NT + hCG + PAPP- A TCN1 Integrated test 1999 PAPP-A + NT Tripple/Quadru TCN1 + TCN2 TCN: tam cá nguyệt Có tính thêm yếu tố nguy cơ của tuổi mẹ Bảng 3: Giá trị các chƣơng trình tầm soát [15]. Loại test Tỷ lệ phát hiện DR Giá trị OAPR Double test 45-54% 1/85 – 1/70 Tripple test 59-69 1/65 – 1/55 13 Quadruple test 67-76 1/55 / 1/50 Combined test 85 1/45 Integrated test 94 1/9 – 1/13 Phát hiện với khả năng 5% âm tính giả Đã tính thêm nguy cơ từ tuổi mẹ. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu để áp dụng kỹ thuật PCR vào chẩn đoán hội chứng Down, tuy còn mới mẻ nhưng đã có rất nhiều thành công được ghi nhận và trong tương lai sẽ là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán hội chứng Down . 2.2.Tại Việt Nam : Ở Việt Nam hiện nay, siêu âm thai nhi, Triple test và kỹ thuật kariotype vẫn là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán hội chứng Down. Sau khi các bà mẹ mang thai tiến hành siêu âm và được sàng lọc qua Triple test, nếu thấy thai nhi có nguy cơ bị mắc hội chứng Down sẽ được tiến hành chọc ối để xác định kariotype của thai nhi. Nếu thai nhi mắc hội chứng Down thì sẽ có karyotype bất thường ( 3NST 21), đây 14 là bước cuối cùng để xác định chính xác thai nhi có bị mắc hội chứng Down hay không. Nhưng những phương pháp này vẫn còn rất nhiều hạn chế : tỷ lệ phát hiện hội chứng Down còn thấp ( 59-69% ) , chỉ phát hiện được các trường hợp 3NST số 21 , mất nhiều thời gian thực hiện xét nghiệm ,...[2] Hiện nay, kỹ thuật PCR đã trở nên khá phổ biến ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam . Và việc sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán hội chứng Down cũng đã bắt đầu được nghiên cứu ở một số trung tâm nghiên cứu y học hàng đầu ở Việt Nam : Trường Đại học Y Hà Nội , Học viện Quân Y ,… 3.Gene SOD1: Gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ) là gene được phát hiện trên NST 21 của người ở đoạn 21q22.1 và cũng là gene được nghiên cứu là có liên quan đến hội chứng Down [16]. 15 Hình 1: Vị trí của gene SOD1 trên NST 21. 3.1. Cấu tạo gene SOD1 : SOD1 thực chất là 1 enzym kim loại , có nghĩa là trong amino acids của nó có chứa ion kim loại , cụ thể ở đây là 2 ion Zn và Cu . Trong đó ion Zn được giới hạn bởi 3 histidine bã là His61 , His69 , His78 và 1 aspartate bã là Asp81 . Còn ion Cu 16 được giới hạn bởi 4 histidine bã là His44 , His46 , His61 và His118. Hai ion kim loại này được nối với nhau bởi 1 histidine cầu nối là His61 [16]. Hình 2 : Hình ảnh cấu tạo gene SOD1 Ngoài enzyme Cu/ZnSOD còn có các enzyme SOD khác nữa như: MnSOD (thành phần chứa kim loại Mangan, loại này có trong ty thể), FeSOD (thành phần chứa kim loại Sắt, loại này tìm thấy trong một số sinh vật nguyên thủy). 3.2. Sự liên quan của gene SOD1 đến hội chứng Down : 17 Gene SOD1 được tìm thấy trên NST số 21 của người tại vị trí 21q22.1. Hiện nay gene SOD1 đã được phát hiện gây ra 2 bệnh : Xơ cứng cột bên teo cơ ( ALS ) và hội chứng Down ( 3 NST 21 ) [12]. Theo những nghiên cứu khoa học gần đây cho biết , gốc O2 - được sinh ra trong quá trình vận chuyển electron của ty thể và gốc superoxide này gây hại cho tế bào thông qua cơ chế : chúng hút các electron của các phân tử bên cạnh và cuối cùng dẫn đến phá huỷ tế bào . Và enzyme Cu/ZnSOD can thiệp , ngăn chặn quá trình này bằng cách biến đổi gốc O2 - và không còn gây hại cho tế bào : Cu 2+ + O2 - -> Cu + + O2 Cu + + O2 - + 2H + -> Cu 2+ H2O2 => 2O2 - + 2H + -> H2O2 + O2 Sau đó , enzym catalase thoái hoá H2O2 : 2H2O2 -> 2H2O + O2 Hay : H2O2 + 2H + -> 2H2O Và không còn gây hại cho tế bào [16]. 18 Nếu không có các enzym này thì H2O2 và O2 - sẽ tấn công các acid béo không bão hòa cấu tạo lipd màng tế bào gây ra sự biến chất của cấu trúc màng và sẽ phá hủy tế bào. Điều này biểu hiện rất rõ trong bệnh xơ cứng cột bên teo cơ (ALS: Amyotrophic lateral sclerosis) và hội chứng Down. Trong bệnh ALS, do chỉ còn 1 gene SOD -1 (bình thường là 2 gene trên 2 nhiễm sắc thể tương đồng), nên lượng enzyme SOD -1 trong tế bào bị giảm đi so với điều kiện sinh lý bình thường. Nên không chuyển hóa hết được các phân tử O2 - được tạo ra. Điều này gây độc cho tế bào đặc biệt là các tế bào thần kinh vận động (motor neurone) ở sừng trước tủy sống, nhân vận động ở cuống não và các sợi thần kinh tủy sống. Hậu quả là làm yếu cơ, teo cơ, suy hô hấp và tử vong. Trong hội chứng Down thì ngược lại. Người mắc hội chứng Down có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được tổng hợp nhiều hơn bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa của nó cũng tăng theo. Thông thường ở hầu hết các mô thì sự tăng enzyme SOD -1 thường kéo theo các enzyme Catalase và Glutathione peroxidase tăng theo tương ứng, nên không gây hại gì. Nhưng trong các tế bào thần kinh thì không có sự tăng theo của 2 enzyme trên, chính vì vậy dẫn đến dư thừa lượng H2O2 trong các tế bào thần kinh, dẫn đến thoái hóa và phá hủy tế bào thần kinh. Tạo ra các biểu hiện lâm sàng của hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp (dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s cao ở độ tuổi trung niên...[12]. 19 4.Phƣơng pháp và kỹ thuật phân tích nghiên cứu gene SOD-1 từ tế bào ối : Quy trình thực hiện xét nghiệm phát hiện tần suất gene SOD1 trong tế bào ối bao gồm các bước sau : + Lấy mẫu : tiến hành lấy tế bào ối của bà mẹ mang thai nghi ngờ mắc hội chứng Down. + Nuôi cấy mẫu tế bào ối. + Tách chiết DNA từ mẫu tế bào ối đã nuôi cấy. + Thực hiện kỹ thuật PCR với DNA thu được với primer của gene SOD1. + Tiến hành điện di sản phẩm PCR. + Phân tích kết quả. 4.1.Nguyên lý của phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào ối : Ở tế bào Eukaryota, phần ADN chủ yếu nằm trong nhân tế bào, trên các NST, vì vậy trước hết cần bộc lộ ADN ra khỏi màng nhân, ra khỏi tế bào. Sau đây là các bước chủ yếu của quy trình : + Bước 1 : giải phóng ADN ra khỏi màng tế bào bằng cách nghiền, dùng áp suất, siêu âm hoặc dùng phương pháp hoá học hoặc dùng phương pháp sinh học (enzym). Sau đó, hỗn hợp được ly tâm để loại bỏ chủ yếu các mảnh vụn của tế bào. + Bước 2 : tách bỏ phần Pr trong tế bào, trong NST bằng Proteinase K. Ly tâm để loại bỏ phần tủa của Proteinase K bằng phenol hoặc chloroform. + Bước 3 : kết tủa ADN bằng ethanol. ADN tủa được để khô trong nhiệt độ phòng và cho tan trong đệm TE ( Tris , EDTA ) và giữ ở nhiệt độ -40C. Ngoài ra ta có thể tách chiết ADN bằng các kit tách chiết ADN như : Puregene DNA , Gentra , Minneapolis , MN [2]. 20 4.2.Phản ứng PCR : 4.2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR : PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ, thể tích dung dịch phản ứng vào khoảng từ 10l đến 50l chứa các thành phần chủ yếu là: (1) enzym polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền được với nhiệt độ; (2) 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP, và dCTP); (3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng; (4) các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 – 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của 2 đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản; (5) ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp, (4) dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng. Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra [7]. Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: (1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính. (2) Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55oC-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp. 21 (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao [10]. 94 o C Biến tính 55 o C-65 o C Bắt cặp 72 o C Kéo dài Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4 Hình 3 : Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR 22 4.2.2. Các chất tham gia phản ứng PCR :  DNA mẫu : Phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu DNA không được bảo quản tốt. Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) khi sử dụng các DNA polymerase cho hiệu quả cao. Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn [3].  Enzyme : Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Ðây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số enzyme mới có hiệu quả hơn : - DNA – polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn hiện diện trong suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này được viết tắt Taq – polymerase. - Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mg2+ ngược lại, khi khuôn là DNA và có ion Mg2+ enzyme này lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA [3]. 23  Đệm : Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide nữa. Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất [3].  Nồng độ ion Mg2+: Mg2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt thường dùng. - Nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. - Nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn, dẫn đến nhiều sản phẩm không đặc hiệu. - Nồng độ tối ưu của Mg2+ phải được xác định cho từng phản