Đề tài Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

khởi động một đáp ứng miễn dịch bởi bất cứ tế bào T nào có thụ thể đặc hiệu cho phức hợp MHC nằm trên bề mặt tế bào tua. Các tế bào T vừa mới được kích hoạt sẽ di chuyển tới vị trí bị nhiễm virút nằm ở phổi, nơi mà các tế bào này sẽ làm trung gian cho các hoạt động chống virút. Đáp ứng tế bào T ở người đạt đến đỉnh vào khoảng ngày 14 sau khi nhiễm và ở người lớn, lượng tế bào T độc đặc trưng cho virút Cúm tương ứng với mức độ sao chép của virút giảm dần qua thời gian. Các tế bào T nhớ CD8 nhớ có thể đóng vai trò làm giảm nhẹ mức độ trầm trọng của bệnh và làm cho sự hồi phục nhanh hơn khi bị nhiễm lại. Điều quan trọng là, những tế bào này có khả năng đáp ứng lại các tín hiệu đầu tiên khi bị nhiễm với lượng virút xâm nhập ở mức rất thấp. Trong khi không thể tăng sinh để đáp ứng với tình trạng nhiễm trùng, các tế bào này có thể sản xuất ra các cytokin để làm kìm hãm không cho virút sao chép và lan rộng trên biểu mô. Giai đoạn 2 của đáp ứng qua trung gian tế bào T nhớ là các tế bào này tập trung nhanh chóng ở đường hô hấp trong một vài ngày đầu tiên của đáp ứng. Giai đoạn 3 là sự mở rộng các tế bào T nhớ dưới tác động của kháng nguyên xảy ra ở các cơ quan lymphô thứ cấp. Sự nhân lên của virút Cúm Virút Cúm cũng giống như các virút khác, nó bắt buộc phải nhân lên trong tế bào cảm thụ. Trong cơ thể sống, virút Cúm gắn vào bề mặt tế bào biểu mô trong phổi và cổ họng, tuy nhiên trong nuôi cấy tế bào virút Cúm gây nhiễm và nhân lên không phải là tế bào biểu mô. Sự lây nhiễm virút Cúm bắt đầu khi HA virút gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic trên tế bào chủ (bước 1). Người ta thấy rằng những virút Cúm phân lập từ người và lợn ưu tiên gắn với vị trí SA-α2,6-Gal, trong khi đó những virút phân lập từ chim và ngựa lại gắn tốt hơn vào vị trí SA-α2,3-Gal (2, 5). Sự gắn đặc hiệu của HA là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình xâm nhập vào vật chủ của virút (16, 18). Để virút có thể xâm nhập được vào tế bào, HAO phải được phân cắt bởi một serine proteinaza như trypsin ở một vị trị đặc hiệu, được mã hóa bởi một axit amin đơn cơ bản (thường là arginin), tạo thành hai tiểu đơn vị HA1 (khối lượng phân tử 36 kDa) và HA2 (khối lượng phân tử 27 kDa) gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị bởi cầu disulfide. Sự phân cắt HA là điều kiện cần thiết cho sự lây nhiễm của virút nhằm để lộ ra đầu amin kỵ nước của HA2 làm trung gian cho sự hòa màng của vỏ ngoài virút và màng nội bào (37). Virút đi vào tế bào bằng cơ chế nhập bào. Trong thể nội bào có tính axit, một phần protein HA hòa tan màng virút với màng không bào, giải phóng các phân tử vARN, các protein phụ và enzym phiên mã ARN phụ thuộc ARN vào tế bào chất (bước 2). Những protein này và vARN tạo thành một phức hợp được vận chuyển vào nhân tế bào, nơi enzym phiên mã ARN phụ thuộc ARN bắt đầu phiên mã sợi vARN dương bổ sung (bước 3a và 3b). vARN hoặc được vận chuyển vào trong tế bào chất và dịch mã (bước 4), hoặc vẫn ở lại trong nhân. Các protein virút mới được tổng hợp hoặc được đưa ra bề mặt tế bào thông qua bộ máy Golgi (trong trường hợp của HA và NA, bước 5b) hoặc vận chuyển trở lại vào trong nhân để gắn với vARN và tạo thành những hạt genome của virút mới. Các protein khác của virút thực hiện nhiều công việc trong tế bào chủ, bao gồm phân hủy mARN của tế bào và sử dụng các nucleotit được giải phóng để tổng hợp vARN và ức chế dịch mã mARN của tế bào chủ. vARN âm tạo nên genome của virút tương lai, cùng với enzym phiên mã ARN phụ thuộc ARN và các protein khác của virút được lắp ráp vào trong một virion. Các phân tử HA và NA tập hợp lại thành một chỗ lồi ra trong màng tế bào. vARN và các protein virút chủ yếu rời nhân và đi vào trong phần nhô lên này của màng (bước 6). Virút trưởng thành nảy chồi ra khỏi tế bào trong một khối cầu của màng photpholipit, có các phân tử HA và NA trên lớp áo màng này (bước 7). Sau khi giải phóng virút Cúm mới, tế bào chủ sẽ chết đi. Hình 4. Chu trình nhân lên của virút Cúm. Nguồn: en.wikipedia.org Sự phát triển của virút trên tế bào Virút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các virút cúm có thể được nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát. Việc nuôi cấy virút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản xuất vắc xin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên phát hay thận chó thường dùng để phân lập virút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Sự phát triển của virút trên nuôi cấy tế bào gây ra sự hủy hoại tế bào và tạo ra các đám hoại tử trong một số dòng tế bào như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà. Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung để hoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của virút. Sinh bệnh học Các nghiên cứu đã đưa ra những bằng chứng chứng minh rằng sinh bệnh học của virút Cúm là tính trạng đa gen. Điều này có nghĩa là sản phẩm của tất cả các gen của virút đều tham gia vào quá trình nhận dạng tế bào vật chủ và gây độc tính trong quá trình xâm nhập phá vỡ tế bào. Trong đó gen HA đóng vai trò trung tâm về tính độc của virút gồm 2 phân týp H5, H7, có độc tính mạnh nên gây tỷ lệ chết cao. Protein HA của các virút này khác các HA của các phân nhóm khác là có một trình tự nhiều axit amin ở đầu carboxyl của HA1. Điều này cho phép các enzyme proteaza của tế bào nhận biết trình tự đó để cắt HA thành HA1 và HA2, là giai đoạn cần thiết cho virút xâm nhập tế bào và phát triển lan ra. Đây cũng là cơ sở giải thích tính gây độc của virút Cúm ở người. Dịch tễ học Sự lây truyền và sự thay đổi theo mùa Bệnh Cúm chủ yếu được lây truyền từ người sang người qua những hạt nhỏ (đường kính > 5 àm) từ mũi và họng khi người bị nhiễm khi ho và hắt hơi. Các sol khí này không lơ lửng trong không khí và cần phải có tiếp xúc gần để có thể lan truyền được (từ 1-2 mét). Sự lây truyền cũng có thể xảy ra qua tiếp xúc ngoài da trực tiếp hoặc tiếp xúc gián tiếp với dịch tiết hô hấp (tay chạm vào các bề mặt bị nhiễm sau đó sờ lên mắt, mũi hoặc miệng). Người nhiễm Cúm có thể phát tán virút từ 2 ngày trước đến 5 ngày sau khi có triệu chứng. Trẻ em có thể lây lan virút đến 10 ngày hoặc lâu hơn. Bệnh Cúm lây lan mạnh nhất vào mùa đông và bởi phía Bắc và Nam bán cầu có mùa đông ở những thời điểm khác nhau trong năm nên trong thực tế có hai mùa Cúm khác nhau mỗi năm. Điều này giải thích tại sao WHO đưa ra những khuyến cáo đối với sản xuất hai loại vắc xin khác nhau mỗi năm, một cho phía Bắc, và một cho phía Nam bán cầu. Có nhiều lý do để giải thích tại sao bệnh Cúm thường bùng phát vào mùa đông như độ ẩm và nhiệt độ tương đối thấp giúp virút Cúm có thể sống lâu hơn, mọi người thường xuyên ở trong nhà dẫn đến sự tiếp xúc gần gũi hơn tạo điều kiện virút lây lan. Một giả thiết khác là do lượng vitamin D trong cơ thể xuống thấp trong mùa lạnh cũng làm cho con người dễ mắc Cúm hơn. Tuy nhiên, những thay đổi theo mùa trong cường độ lây nhiễm virút Cúm cũng xảy ra ở những vùng nhiệt đới, sự lây lan cao nhất chủ yếu diễn ra trong suốt mùa mưa. Dịch và đại dịch Mỗi năm, các vụ dịch Cúm gây ra 3-5 triệu ca bệnh và từ 300.000-500.000 tử vong trên toàn cầu. Nguy cơ mắc bệnh nặng và tử vong cao nhất trong số các bệnh nhân lớn hơn 65 tuổi, trẻ nhỏ dưới 2 tuổi, và những người có nguy cơ mắc thêm các biến chứng từ Cúm. Những virút Cúm mới luôn luôn được sinh ra do đột biến hay tái sắp xếp vật liệu di truyền. Những đột biến có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong các kháng nguyên HA và NA trên bề mặt virút. Đó là đột biến kháng nguyên chậm, tạo ra nhiều chủng Cúm qua thời gian cho tới khi một trong những biến thể đạt tới sự thích ứng cao hơn và lây lan nhanh chóng trong cộng đồng, gây ra bệnh dịch. Ngược lại, khi các virút Cúm được sinh ra có những kháng nguyên mới hoàn toàn, chẳng hạn sự tái sắp xếp vật liệu di truyền giữa các chủng Cúm gia cầm và các chủng Cúm người; đó là đột biến kháng nguyên nhanh. Nếu một chủng virút Cúm người có các kháng nguyên mới hoàn toàn xuất hiện, tất cả mọi người sẽ bị cảm nhiễm và virút Cúm mới sẽ lan tràn không thể kiểm soát, gây ra đại dịch. Ngược lại với vụ dịch, đại dịch là những biến cố ít gặp, xảy ra cứ mỗi 10 hoặc 50 năm. Những đại dịch đã được ghi nhận từ thế kỷ thứ 16, và trong vòng 400 năm trở lại đây, đã có 3 đại dịch Cúm xảy ra (bảng1). Thiệt hại về người của các đại dịch này thay đổi từ mức tàn phá sang vừa hoặc nhẹ. Bảng 1. Đột biến kháng nguyên nhanh và các đại dịch (11, 25) Năm Tên chủng virút Mức độ Số người chết 1889 H3N2 Vừa phải 1 triệu 1918 H1N1 ("Spanish") Nghiêm trọng 40 - 100 triệu 1957 H2N2 ("Asian") Vừa phải 1 - 1,5 triệu 1968 H3N2("Hong kong") Nhẹ 0,75 - 1 triệu ? Các đại dịch Cúm luân chuyển trên toàn cầu theo nhiều đợt kế tiếp nhau, và không có cách nào để ngăn ngừa sự lan rộng của một virút gây đại dịch Cúm mới. Một đặc điểm của Cúm trong đại dịch là số tử vong chuyển sang nhóm tuổi trẻ hơn. Một nửa số tử vong có liên quan đến Cúm trong đại dịch 1968 và phần lớn những ca tử vong liên quan đến Cúm trong các đại dịch 1957 và 1918, đều xảy ra ở người < 65 tuổi. Kinh nghiệm trong quá khứ chỉ ra rằng không có quy tắc chung cho các đại dịch và cũng không có cơ sở tin cậy nào để dự đoán thời gian và nơi đại dịch có thể xuất hiện. Trong suốt thế kỷ 20, các đại dịch xảy ra ở những khoảng thời gian tương đối dài và không thể dự đoán trước được, từ 9 đến 39 năm trong suốt các đại dịch 1918 (H1N1), 1957 (H2H2), 1968 (H3N2) và 1977 với quy mô nhỏ hơn. Trong năm 1957, virút H2N2 đã thay thế hoàn toàn virút H1N1 trước đó, và trong năm 1968, H3N2 thay thế H2N2. Sự tái xuất hiện của H1N1 năm 1977 không gây ra một đại dịch thật sự, bởi nhiều người sinh trước năm 1957 đã được miễn nhiễm một phần. Hơn thế nữa, virút H1N1 không thay thế H3N2. Từ năm 1968, cả hai phân týp H1N1 và H3N2 lưu hành đồng thời với virút Cúm B gây ra những vụ dịch bùng phát trên người trong giai đoạn tiền đại dịch. Dự phòng và kiểm soát Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất đối với dịch Cúm là tiêm phòng vắc xin. Vắc xin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên người trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng nguyên vắc xin phù hợp với chủng virút Cúm đang lưu hành. Tuy nhiên, hiệu quả phòng bệnh của vắc xin không cao đối với trẻ em và người già. Với những giới hạn của vắc xin hiện có, đã có nhiều nghiên cứu phát triển những tá chất tốt hơn để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vắc xin Cúm cũng như phát triển vắc xin sống giảm độc lực. Một trong những bước tiến hứa hẹn là phát triển vắc xin sống giảm độc lực bằng thích ứng nhiệt độ lạnh. Tuy nhiên, mặc dù vắc xin này có hiệu quả ở trẻ em và người trẻ tuổi thì lại quá giảm độc lực để kích thích sinh kháng thể bảo vệ ở người già (8). Sự phát triển của kỹ thuật di truyền ngược sử dụng hệ thống chuyển nhiễm ribonucleoprotein (RNP) cho phép thay thế các gen của virút Cúm và tạo thành phân tử ARN tái tổ hợp in vitro. Một số tá chất khác nhau cũng đã được sử dụng để tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch của vắc xin Cúm. Vắc xin Cúm bất hoạt bằng formaldehyt hoặc vắc xin chứa glycoprotein bề mặt tinh khiết được sản xuất trên trứng gà có phôi phải thay đổi chủng sản xuất hàng năm để đáp ứng với tính đa dạng của virút. Chủng virút là một trong những thành phần quan trọng nhất của sản xuất vắc xin Cúm. Chủng virút phải không có các yếu tố ngoại lai, có chứa thành phần HA và NA phù hợp với chủng gây dịch trong năm và phải có khả năng nhân lên tốt. Dựa trên thông tin từ mạng lưới giám sát Cúm toàn cầu, hàng năm vào tháng Hai, Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) đã xem xét 2 lần trong một năm tình hình dịch tễ về Cúm trên toàn thế giới, khuyến cáo sử dụng các chủng virút Cúm mới. Theo khuyến cáo của WHO thì thường xuyên cần thiết phải phát triển các chủng virút vắc xin chuẩn có các tính chất kháng nguyên của loài chủng mà WHO khuyến cáo, và có khả năng nhân lên tốt để việc sản xuất vắc xin có hiệu quả. Hiện tại, đối với Cúm mùa, vắc xin được cấp phép trên toàn thế giới phải chứa 2 phân týp Cúm A đang lưu hành là H3N2, H1N1 và một chủng Cúm B (42). Hiện nay trên thế giới cũng đã rất nhiều nước như Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Trung Quốc, Hungaria với các hướng công nghệ đang được các nhà sản xuất lựa chọn hiện nay bao gồm: 1/ Từ trứng gà có phôi SPF (Specific Pathogen Free); 2/ Trên các dòng tế bào động vật (MDCK); 3/ Sống giảm độc lực và 4/ Trên tế bào Vero (dùng chủng độc lực hoang dại). Thích ứng của chủng Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau Tế bào Vero Một trong những dòng tế bào đã được nghiên cứu khá kĩ là dòng tế bào Vero, thích hợp cho việc sản xuất các vắc xin virút ở người, như các vắc xin phòng bệnh bại liệt và bệnh dại (21). Trước đây, chỉ có dòng tế bào tiên phát và tế bào lưỡng bội được sử dụng sản xuất các loại vắc xin cho người là được cấp phép. Dòng tế bào thường trực không được sử dụng bởi những lo ngại liên quan đến khả năng làm xuất hiện các khối u và sự lây nhiễm virút của những dòng tế bào này. Tế bào Vero, dòng tế bào thận khỉ xanh châu Phi thường trực, đã được kiểm nghiệm trong khía cạnh này và người ta cũng đã xây dựng một ngân hàng tế bào Vero được chấp thuận bởi WHO (21). Điều này chứng minh không có tác nhân của virút và không có khả năng gây khối u ở những đời cấy truyền trên dòng tế bào này (4, 13, 35). Tế bào Vero mẫn cảm với một phổ virút rộng nhưng ở những lần thử nghiệm đầu tiên, virút Cúm không phát triển thành công trên tế bào này (17, 22). Tuy nhiên, những nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng thêm trypsin nhiều lân vào môi trường nuôi cấy của tế bào Vero đã nhiễm virút Cúm phục hồi kiểu nhân lên nhiều lần của virút Cúm A và B (7, 15). Nghiên cứu của Govorkova và cộng sự cho thấy dòng tế bào Vero là một hệ thống vật chủ thích hợp để phân lập và nuôi cấy các virút Cúm A (7). Hiệu quả phân lập những chủng đang lưu hành hiện nay A/H3N2 là tương tự ở tế bào Vero và MDCK. Trong 72 chủng thích ứng trên trứng, 90,3% được phát hiện có hiệu giá HA trên tế bào Vero sau lần cấy truyền đầu tiên và 51,4% sau lần thứ hai. Những trình tự axit amin của vùng HA1 của các virút Cúm A được phân lập và cấy truyền trên tế bào Vero giống hệt như các virút sinh trưởng trên tế bào MDCK. ở nồng độ gây nhiễm thấp, người ta thu được sản lượng virút cao bằng cách thêm nhiều lần trypsin vào môi trường. Sau 20 lần cấy truyền chủng A/H1N1, người ta thu được lượng protein của virút cao như trên tế bào MDCK. Những nghiên cứu ban đầu với một số lượng chủng giới hạn đã cho thấy tế bào Vero hỗ trợ tốt cho sự phân lập và nhân lên của các chủng virút Cúm A . Nhóm tác giả này cũng đã chỉ ra Vero là một tế bào chủ thích hợp để phân lập và nuôi cấy các chủng virút Cúm B và xác định những đặc điểm sinh học và di truyền học của cả virút Cúm A và B trên tế bào Vero. Đồng thời mô tả đặc điểm các thụ thể trên tế bào Vero so với những thụ thể này trên tế bào MDCK. Phân tích trình tự đã khẳng định HA của virút Cúm B trên tế bào Vero giống hệt với HA trên tế bào MDCK, nhưng khác với virút sinh trưởng trên trứng ở các vị trí axit amin 196 đến 198. Tế bào MDCK Tế bào thận chó Madin Darby được phân lập lần đầu tiên vào năm 1958 và đã được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vắc xin thú y. Chúng có thể sản sinh ra khối lượng lớn virút Cúm (33). Cũng như tế bào Vero, MDCK là dòng tế bào bám dính và có thể nuôi cấy trong môi trường không có serum. MDCK là dòng tế bào được WHO khuyến cáo sử dụng để phân lập virút Cúm A từ mẫu bệnh phẩm của các trường nghi ngờ mắc Cúm. Reina và cộng sự báo cáo một bản nghiên cứu so sánh của các dòng tế bào MDCK, Vero và MRC-5 trong sự phân lập virút Cúm A. Trong 746 mẫu nghiên cứu mẫu có 60 virút Cúm A được phân lập. Dòng tế bào MDCK thể hiện sự nhạy cảm với virút Cúm là 100%, dòng tế bào Vero là 71,4% và dòng tế bào MRC-5 là 57,1% (26). Qua thống kê, tế bào MDCK đã tỏ rõ sự khác nhau đáng kể đối với Vero và MRC-5. Phân tích định lượng chỉ ra dòng tế bào MDCK nhạy cảm hơn hẳn những dòng tế bào khác. Có vẻ như dòng tế bào MDCK vẫn là một trong những dòng tế bào tốt nhất được khuyến cáo để phân lập virút Cúm A từ các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp. Một nghiên cứu khác về trình tự axit amin và những đặc điểm sinh học của HA của ba biến thể của chủng virút Cúm X-31 (H3N2) khi nuôi cấy trên tế bào MDCK. Trong hai biến thể, có 2 vị trí axit amin thay đổi ở HA1 là các axit amin ở vị trí thứ 8 và 144 lần lượt tương ứng với mất vị trí glycosin hóa và những thay đổi đặc biệt trong tính kháng nguyên. Như các virút thích ứng trên trứng khác của phân týp H3, virút Cúm X-31 cũng nhân lên kém trên tế bào. Khi không có trypsin, các đám hoại tử hầu như không thể nhìn thấy và rất khó có thể đếm được. Khi có trypsin, các đám hoại tử thấy được rõ ràng có đường kính từ 1 đến 2 mm. Trong điều kiện này, số lượng đám hoại tử đã tăng lên ít nhất 100 lần (27). Tế bào PMKc Việc sử dụng tế bào thận khỉ tiên phát để trong sản xuất vắc xin phòng virút Cúm là một công nghệ mới với cả thế giới, Việt Nam cũng không phải ngoại lệ. Hiện nay, thế giới chủ yếu đang sử dụng công nghệ vắc xin truyền thống là sản xuất trên trứng gà có phôi. Tuy nhiên các nhà khoa học của Công ty Vắc xin và Sinh phẩm só 1 đã sản xuất vắc xin Cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát. Quá trình thích ứng chủng rgH5N1 có hiệu quả trên tế bào PMKc và nghiên cứu phát triển vắc xin Cúm A/H5N1 trên dòng tế bào này đã có những thành công nhất định (1). Kết quả này cũng đồng thời cũng hứa hẹn khả năng thích ứng tốt những chủng virút Cúm mùa trên dòng tế bào này. Chương 2 VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU VậT LIệU CHUNG Phiến 24 giếng (Nunc - Đan Mạch) Chai 25cm2 và 75cm2 (Nunc - Đan Mạch) Tủ ấm 37oC (Memmert - Đức) Tủ ấm CO2 (Sanyo - Nhật) Hốt vô trùng (Biosyt - Pháp) Kính hiển vi lộn ngược (Olympus - Nhật) Tế bào Tế bào thận khỉ tiên phát một lớp (Do Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế cung cấp. Tế bào này được chuẩn bị từ nguồn khỉ sạch đã được kiểm tra không có các tác nhân ngoại lai như: SV40, SFV, SIV, virút B, M. tuberculosis) Tế bào MDCK (Do Ngân hàng tế bào Châu âu cung cấp) Tế bào Vero (Do Ngân hàng tế bào Châu âu cung cấp) Chủng virút Chủng virút Cúm A H1N1 A/New Caledonia 20/99 (Do Viện Quốc gia sinh phẩm chuẩn, UK cung cấp) Chủng virút Cúm A H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 (Do Viện Quốc gia sinh phẩm chuẩn, UK cung cấp) Chủng virút Cúm B B/Malaysia/ 2506/2004 (Do Viện Quốc gia sinh phẩm chuẩn, UK cung cấp) Môi trường và hóa chất MEM (Gibco) FBS (Gibco) PBS (-) (Gibco) Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco) Trypsin-TPCK (Sigma) Hank’s (Gibco) Phương pháp chuẩn bị tế bào Lấy tế bào từ nitơ lỏng Chuẩn bị chai nuôi tế bào 75 cm2 hoặc 25 cm2 (tuỳ mục đích sử dụng) đã có sẵn môi trường nuôi (ví dụ: MEM 10% FBS) ở 37oC hoặc ở nhiệt độ phòng. Tiến hành lấy ống tế bào khỏi nitơ lỏng, làm đông tan. Vô trùng ống tế bào trước khi mở nắp ống. Hút dịch tế bào từ ống (còn lạnh) chuyển sang chai nuôi đã có sẵn môi trường. Láng nhẹ để tế bào phân bố đều trong dịch môi trường. Nuôi tế bào trong 37oC trong 6-8h hoặc qua đêm để tế bào bám vào bề mặt chai. Thay môi trường cho tế bào bằng môi trường nuôi sau 24h (tuỳ thuộc dòng tế bào và mục đích thí nghiệm, ví dụ: MEM 5% FBS cho tế bào MDCK ). Tách tế bào Nuôi tế bào kín một lớp. Hút bỏ môi trường trong chai nuôi tế bào. Rửa tế bào bằng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vào chai, láng đều. Để chai tế bào ở 370C khoảng 20-30 phút đến khi tế bào bong khỏi thành chai. Cho MEM 5% FBS vào chai, hút lên hút xuống vài lần. Phân chia ra các chai mới tùy thuộc tỷ lệ tách. Thêm vào mỗi chai cho đủ lượng môi trường MEM 10% FBS. ủ ở 370C cho đến khi tế bào kín một lớp. Phương pháp gây nhiễm virút Cúm Pha loãng virút bằng Hank’s đến nồng độ cần gây nhiễm (ví dụ 0,01PFU/tế bào). Hút bỏ môi trường trong chai nuôi tế bào. Rửa tế bào bằng Hank’s. Gây nhiễm hỗn dịch virút đã pha loãng vào chai nuôi tế bào, chai còn lại làm chứng (-) cho Hank’s. Láng nhẹ cho hỗn dịch dàn đều trên bề mặt tế bào. Hấp phụ virút ở nhiệt độ phòng trong 1h, cứ 20 phút láng 1 lần. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy virút: pha TPCK-trypsin trong môi trường MEM. Nuôi virút ở 37oC trong 72-96h. Theo dõi mức độ hủy hoại của virút hàng ngày. Phương pháp gặt virút Sau 72-96h gây nhiễm, thu lấy hỗn dịch virút trong ống eppendorf vô trùng. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC để loại bỏ xác tế bào, thu nước nổi. Bảo quản virút ở -80oC PHảN ứNG NGƯNG KếT HồNG CầU Chuẩn bị hồng cầu Lấy 1ml máu gà vào ống falcon chứa dung dịch bảo quản Alsever. Ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút ở 250C. Hút nước nổi, thêm 5ml PBS (-) vào ống. Tiếp tục ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút ở 250C, lặp đi lặp lại 4 lần. Pha dung dịch 0,5% hồng cầu gà trong PBS (-). Tiến hành Hiệu giá virút sau khi gặt sẽ được đánh giá bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA). Lấy phiến thử, viết tên mẫu theo thứ tự: (-), (+) và các mẫu thử. Cho vào mỗi giếng 50àl PBS (-). Hút 50àl mẫu vào các giếng đầu tiên, giếng (-) cho 50àl PBS (-). Pha loãng mẫu bằng cách hút 50àl mẫu từ giếng đầu tiên chuyển sang giếng tiếp theo, đến giếng cuối cùng cũng hút bỏ 50àl và bỏ đầu côn. Mỗi giếng hút lên hút xuống 5 lần. Thêm vào mỗi giếng 50àl dung dịch 0,5% hồng cầu gà. Vỗ nhẹ vào phiến và đậy nắp. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đọc kết quả. Kết quả Hiệu giá HA là nồng độ pha loãng thấp nhất của mẫu còn có khả năng ngưng kết hồng cầu. Các giếng có khả năng ngưng kết HA là các giếng khi nghiêng, hồng cầu chảy xuống có hình giọt lệ. Căn cứ vào chứng (-) và (+) để đánh giá thử nghiệm. QUY TRìNH CHUẩN Độ HIệU GIá Virút Cúm Vật liệu Tế bào MDCK. Môi trường Hank’s: pH 6,8 - 7,2 Dung dịch Trypsin 0,25% Trypsin (Gibco - Mỹ) 2,5g EDTA (BDH - Anh) 1g PBS dạng bột (Sigma - Mỹ) 1 gói Nước cất 2 lần vừa đủ 1000 ml Môi trường nuôi cấy MEM (Gibco) Môi trường MEM 2X MEM dạng bột (Gibco - Mỹ) 1 gói Sodium bicarbonate (Gibco - Mỹ) 20 ml Aminoacid (Gibco - Mỹ) 10 ml L - Glutamin 200 mM/ml (Gibco - Mỹ) 5 ml Gentamicin 10 mg/ml 2 ml Fungizone 250 àg/ml (Gibco - Mỹ) 0,5 ml Nước cất 2 lần vừa đủ 500 ml Môi trường phủ thạch MEM 2X 10 ml MgCl2.6H20 4.1M/1 (Wako - Nhật) 0,2 ml Agarose 1,2% (Seakem - Mỹ) 10 ml FBS (Sigma - Mỹ) 0,4 ml Thuốc nhuộm Crystal violet Crystal violet (Merck - Đức) 0,325 g Isopropyl alcohol (Amresco - Mỹ) 12,5 ml Formaldehyde (BDH - Anh) 75 ml Nước cất 2 lần vừa đủ 1000 ml Phương pháp tiến hành Chuẩn bị tế bào MDCK Môi trường EMEM 2X Chuẩn bị tế bào MDCK ra phiến 24 giếng: Hút hết môi trường trong chai . Rửa tế bào bằng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vào chai, láng đều. Để chai tế bào ở 37oC khoảng 20-30 phút đến khi tế bào bong khỏi thành chai. Cho 5ml MEM 10% FBS vào chai hút lên hút xuống nhiều lần. Cho thêm 30ml MEM 10% FBS vào chai, trộn đều. Cho vào 3 phiến, mỗi phiến 12ml, 0,5ml/giếng. Cho vào tủ CO2, 37oC. Chuẩn bị môi trường phủ thạch: cho 1 phiến EMEM 2X 10ml DW 3,8ml 1% DEAE-dextran 0,2ml Trypsin 1,2ml Agarose 2% 6ml 2.9.2.2. Tiến hành Mẫu thử được pha loãng bậc 10 ở 8 nồng độ gây nhiễm từ 10-1 đến 10-8 bằng Hank’s. Lấy phiến ra khỏi tủ ấm, viết tên và độ pha loãng trên nắp giếng. Hút bỏ môi trường theo cạnh giếng. Rửa các giếng tế bào bằng cách cho 0,5ml Hank’s vào tất cả các giếng, láng đều Hank’s trên bề mặt tế bào. Lắc qua lắc lại nhẹ nhàng để loại bỏ tế bào chết. Hút hết Hank’s ở trong giếng tế bào. Cho 200àl Hank’s vào giếng tế bào chứng và 100àl Hank’s vào các giếng gây nhiễm. Hút 100àl dung dịch ở các độ pha loãng vào các giếng gây nhiễm theo sơ đồ phiến thử Sơ đồ phiến thử: 1 2 3 4 5 6 A Tế bào chứng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 B Tế bào chứng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 C Tế bào chứng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 D Tế bào chứng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Đậy kín phiến tế bào đã gây nhiễm, để hấp phụ 2 giờ trong tủ ấm 5% CO2, nhiệt độ 37oC. Loại bỏ nước nổi trong các giếng. Cho vào mỗi giếng 0,6ml dung dịch phủ thạch. Để vào tủ ấm CO2/37oC trong 3 ngày. Nhuộm thạch bằng thuốc nhuộm Crystal violet, 400àl/giếng. ủ ở tủ ấm 37oC. Sau 3-4h rửa lớp thạch phủ, đọc kết quả. Cách tính kết quả Các đám hoại tử là những đốm trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường nằm ở mặt đáy của các giếng khi soi trên đèn. Đếm các đám hoại tử ở mỗi giếng rồi ghi lại. Hiệu giá virút Cúm = số đám hoại tử (PFU)/ ml Công thức tính hiệu giá của virút Cúm: Số đỏm hoại tử trung bỡnh PFU/ml = Độ pha loóng thấp nhất cũn gõy hoại tử ì số ml cấy Chương 3 KếT QUả Và BàN LUậN đánh giá khả năng thích ứng của virút Cúm a/h1n1, a/h3n2 và b trên các dòng tế bào khác nhau Sự nhân lên của virút Cúm trên tế bào Vero Tế bào Vero được gây nhiễm với ba chủng virút Cúm mùa A/H1N1, A/H3N2 và Cúm B. Quan sát sự nhân lên của virút trong khi nuôi cấy bằng dưới kính hiển vi để kiểm tra mức độ hủy hoại (CPE) và đánh giá nhanh hiệu giá kháng nguyên virút thông qua phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) tại những thời điểm: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau khi gây nhiễm. Hình 5. ảnh chụp tế bào Vero ở lần cấy truyền thứ 10 sau 24 giờ gây nhiễm với ba chủng Cúm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) và B (D). (A) là ảnh chụp tế bào chứng (tế bào không nhiễm virút Cúm). Bảng 2