Đề tài Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD

ường, lúa mạch... [17, 27, 29]. Trong một số ít trường hợp RAPD được dùng trong xác định QTL của nhiều đặc điểm nông học như: các đặc điểm về năng suất ở lúa mạch và lúa, trong xác định gen điều khiển các đặc điểm đơn gen ở cà, rau diếp [14, 17]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra RAPD là một phương pháp hữu hiệu để xác định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứu phát sinh loài (hệ thống phát sinh) và lập bản đồ di truyền. 1.2. Tình hình nghiên cứu về Song mật Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) thuộc họ cau (Arecaceae), nằm trong nhóm gỗ trung bình. Với giá trị sử dụng cao và được người dân sử dụng từ rất lâu nên đã có nhiều nghiên cứu về Song mật. 1.2.1. Phân bố, đặc điểm hình thái Song mật Song mật là loài cây ưa sáng và Nm, luôn vươn lên tầng cao nhất của tán rừng. Mọc trên đất feralit vàng, trên núi đá và các loại đất phong hóa trên phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vôi. Cây thường mọc ven thung lũng núi, chân và sườn núi đá, ven và dọc các khe Nm. Nơi có độ dốc 30 – 50o cũng thấy Song mật. Song mật mọc xen lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 100 – 1,500m, tập trung nhiều ở độ cao 400 – 900m. Trên thế giới, Song mật chủ yếu tập trung nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc Song mật chủ yếu phân bố ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900m thành từng cụm lớn. Ở Việt Nam đây là loài cây cận đặc hữu thường gặp ở ở các tỉnh từ Đồng Nai (Nam Cát Tiên) trở ra nhưng tập trung nhất ở các tỉnh: Quảng Nam, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hoá, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai,Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lai Châu [2]. Cây Song mật có thân ngầm là phần phình lên của gốc thân khí sinh, có dạng giống như củ hành ta và được bao bọc bởi nhiều bẹ lá dày, màu trắng hay vàng nhạt. Các bẹ lá ngoài cùng chết dần và có màu nâu, phía giữa thân 12 ngầm là đỉnh sinh trưởng, mềm màu trắng. Ở cây non, thân được bao bọc bởi bẹ lá hình ống, màu xanh lá cây, trên mặt có nhiều gai dẹt màu vàng. Khi già, bẹ ở gốc thân chuyển thành màu vàng, màu nâu rồi rụng đi, để lộ thân khí sinh màu xanh rêu. Cây một năm tuổi đường kính thân ngầm đạt 1cm, cây trưởng thành đường kính thân ngầm tới 4 – 6cm hay hơn. Thân khí sinh mọc thành bụi nhưng thường rất thưa. Ở cây trên ba tuổi giữa các gốc rễ lớn xuất hiện chồi mầm đầu tiên, chồi cong và hướng lên phía trên sát với thân cây mẹ; quanh gốc thân ngầm mọc ra các rễ dài, cứng; đôi khi ta gặp bụi Song mật chỉ có một thân khí sinh. Thân cây trưởng thành rất dài, có thể đến 40m, trong rừng già có thể đạt 100m. Thân non màu trắng ngà, sau chuyển sang màu xanh; lóng dài 8 – 25cm, đốt hơi nổi, đường kính trung bình đạt 2,3 – 2,8cm; cây to đạt 4 – 5cm. Nếu tính cả bẹ lá bao bọc, đường kính thân phần ngọn đạt 8 – 10cm [2]. Lá Song mật là dạng lá đơn, xẻ gân lông chim, gần giống lá Dừa, gồm: bẹ lá, cuống lá, phiến là và thìa lìa nằm giữa bẹ và cuống lá. Bẹ lá rất dài, bao bọc kín thân khí sinh.Trên bẹ lá có nhiều gai dẹt, dài 8 – 10cm, gai mọc lật ngược về phía gốc; Thường khi cây cao 2 – 3m, từ lá thứ 6 – 7 trở lên xuất hiện roi (flagelle) trên đỉnh cuống lá; roi dài 1,5m hay hơn [2]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa hình bông mo, dài hơn 1m, mọc ở gần nách các lá phía ngọn; mỗi thân thường mang 5 – 10 bông mo. Mỗi bông mo mang nhiều bông nhỏ dài 2 – 2,5cm với 14 – 17 hoa. Hoa đực xếp sát nhau thành 2 dãy, lá đài 3, cánh hoa 3, nhị 6. Hoa cái tập trung 14 – 32 hoa trong một bông nhỏ. Thường chỉ 17 – 20 hoa cái phát triển thành quả. Chồi hoa xuất hiện vào tháng 9 – 10, hoa nở vào tháng 4 – 5 năm sau. Quả chín tháng 10 – 11 dương lịch. Thời gian chín của quả kéo dài khoảng một tháng [2]. Quả hình trứng, dài 15 – 22mm, rộng 9 – 14mm, cuống mập màu xanh vàng, dài 6mm, đỉnh có mũi hình nón dài 4mm; vỏ quả mang 18 hàng vảy dọc, mỗi hàng 8 vảy dẹp, có rãnh kích thước 3 × 3,5mm mép màu nâu. Khi 13 non quả màu xanh lá cây, khi già màu vàng nhạt. Cùi quả màu trắng nhạt, mọng nước, dài 1mm, dễ dóc khỏi hạt, cùi có vị chua [2]. Hạt hình trái xoan hay bầu dục, khi non màu trắng ngà, khi già màu nâu đen. Vỏ ngoài hạt rất cứng, nhăn nheo, màu trắng đục, phía bụng là rốn hạt, phía đầu to có lỗ với nắp đậy, qua đó phôi sẽ xuất hiện khi nảy mầm. Hạt chứa nội nhũ, sừng rất cứng, phôi nằm lệch về một phía. 1.2.2. Giá trị và hiện trạng khai thác Song mật trên cả nước. Thân Song mật dài, rất dẻo, chịu uốn và bền, nên được dùng làm bàn ghế, hàng mây tre đan và cuốn bè. Hiện nay, Song mật là loại nguyên liệu quan trọng trong nhiều cơ sở sản xuất mây tre đan ở các tỉnh phía Bắc. Trên thị trường giá Song mật đắt hơn giá các loài song mây khác từ 2 – 3 lần. Hiện nguồn Song mật dùng cho chế biến, sử dụng vẫn chủ yếu dựa vào việc khai thác từ rừng tự nhiên. Theo đánh giá của các chuyên gia lâm nghiệp, từ những năm 1985 Song mật đã bị khai thác mạnh để làm hàng xuất khNu khiến cho nhiều khu phân bố thu hẹp dần số cá thể và có nguy cơ bị mất nguồn giống. Nguồn tài nguyên Song mật đang cạn kiệt, vì vậy trên cả nước cần xây dựng những rừng giống và khoanh vùng một số khu vực còn nhiều cá thể để khai thác hợp lý, đảm bảo sản lượng ổn định, lâu dài. Song mật rất thích hợp phát triển trong các rừng của Việt Nam nên phải có kế hoạch bảo vệ, khai thác, đNy mạnh công tác gieo trồng và sử dụng bền vững. Trước tiên cần có kế hoạch tích cực bảo vệ cây Song mật trong các khu bảo tồn để làm nguồn giống; đặc biệt cần bảo vệ các cây Song mật đã được trồng ở Trạm nghiên cứu Lâm nghiệp Bình Thanh, tỉnh Hoà Bình và vườn quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ để lấy giống nghiên cứu và phát triển trong giai đoạn đầu. Sớm đưa Song mật vào gây trồng trong các rừng đặc dụng và rừng đầu nguồn. 1.2.3. Những nghiên cứu về Song mật trên Thế giới và Việt Nam Đối với các đối tượng nghiên cứu khác như: mây nếp, xoan, bông, dâu tằm. . . và các loài cây trồng nông nghiệp: đậu tương, đậu xanh, . . . Với kỹ 14 thuật sinh học phân tử, các cơ sở nghiên cứu đã đánh giá được tính đa dạng di truyền ở nhiều đối tượng trên quy mô cả nước cũng như trên thế giới, phục vụ công tác tuyển chọn giống cây nông lâm nghiệp để có nguồn giống chất lượng (kháng sâu, bệnh hại; chịu hạn . . .) và năng suất cao đưa vào sản xuất. Nhận thức rõ vai trò quan trọng của loài cây có giá trị kinh tế cao này, tại nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các nước trong khu vực Đông Nam Á đã tiến hành nghiên cứu: phân loại, kỹ thuật gây trồng, phân tích lợi ích kinh tế của việc gây trồng Song mật (Yin Guangtian, et al., 1998). Các nghiên cứu về nguồn tài nguyên di truyền, xác định những loài có giá trị thương mại đã được tiến hành ở: Bangladesh, Trung Quốc, ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Philippines và Thái Lan (Ramanatha Rao, et al., 1999) nhằm mục đích xác định số lượng, khu vực phân bố, vùng gây trồng phù hợp. Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu ở Thái Lan về phân tích đa dạng di truyền bằng các phương pháp phân tích phân tử (isozyme, RAPD, RFLP, AFLP ... (L.T. Hong, et al., 2002). Với nguy cơ đang mất đi một nguồn gen quý cũng như mất dần nguồn liệu trong sản xuất nên trong những năm qua Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cùng các tỉnh đã và đang xây dựng nhiều dự án trồng, bảo vệ Song mật trong tự nhiên; nhiều dự án trồng vùng nguyên liệu sản xuất và vùng bảo tồn nguồn gen tự nhiên ở nhiều tỉnh. Nguồn giống trong công tác trồng vùng nguyên liệu và bảo tồn nguồn gen trong tự nhiên ở nước ta hiện nay chủ yếu dựa vào hình thái và rất xô bồ, chưa được quan tâm đúng mức. Nhận thấy những tồn tại đó đề tài: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” đã đặt công tác đánh giá chất lượng nguồn giống nuôi trồng là giai đoạn đầu tiên để kết quả, chất lượng đề tài cũng như nguồn giống đạt được là cao nhất. Đối với công tác nhân giống ở Việt Nam, đặc biệt với đối tượng là Song mật thì đây là vấn đề đang được khuyến khích và triển khai trên mọi đối tượng là cây trồng sản xuất cũng như trong bảo tồn nguồn gen thực vật trên cả nước. 15 H ìn h 1. 1. C ác bộ ph ận : th ân , bẹ , đ ốt , ga i, ho a , qu ả củ a So n g m ật (n gu ồn In te rn et ). H ìn h 1. 2. N gọ n v à ro i ( fla ge lle ) c ủa So n g m ật tr o n g tự n hi ên (n gu ồn In te rn et ). 16 Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ˗ Xác định mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Song mật thu thập tại 4 tỉnh phía Bắc. ˗ Cơ sở phân tử cho công tác chọn tạo, nhân giống và bảo tồn các giống Song mật quý, có giá trị cao trong sản xuất kinh tế. 2.2. Nội dung nghiên cứu ˗ Tách chiết ADN tổng số của các dòng Song mật ở 4 xuất xứ khác nhau. ˗ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu ADN tổng số thu được với 20 đoạn mồi ngẫu nhiên. ˗ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của Song mật với các xuất xứ bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02h (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu * Vật liệu thực vật: Mẫu nghiên cứu là lá Song mật sạch bệnh, thu thập từ 4 tỉnh phía Bắc: Hòa Bình, Bắc Giang, Tuyên Quang, Hà Giang. Gồm 15 mẫu Song mật, theo đánh giá của cán bộ điều tra thì đây là 15 cá thể trội trong số 4 xuất xứ được thu thập (bảng 2.1) do Trung tâm Giống và Công nghệ Sinh học Trường Đại học Lâm nghiệp cung cấp. 17 Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu Song mật sử dụng nghiên cứu Ký hiệu Giống Song mật Ký hiệu Giống Song mật S1 Hoà Bình 1 S9 Tuyên Quang 2 S2 Hoà Bình 2 S10 Tuyên Quang 3 S3 Hoà Bình 2’ S11 Hà Giang 1 S4 Hoà Bình 3 S12 Hà Giang 2 S5 Hoà Bình 4 S13 Hà Giang 3 S6 Hoà Bình 5 S14 Bắc Giang 1 S7 Hoà Bình 6 S15 Bắc Giang 2 S8 Tuyên Quang 1 * Hóa chất: ˗ Trình tự mồi RAPD được tham khảo trên ngân hàng Gen thế giới (NCBI) và đặt mua từ hãng OPERON (Mỹ) gồm các mồi có trình tự trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Tên và trình tự 20 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu TT Tên mồi Trình tự nucleotide TT Tên mồi Trình tự nucleotide 1 PC01 5’-GGACTGGAGT 11 PC11 5’-AACCGACGGG 2 PC02 5’-TGCTCTGCCC 12 PC12 5’-GGGGGTCGTT 3 PC03 5’-GGTGACGCAG 13 PC13 5’-TACCACCCCG 4 PC04 5’-TGGGGGACTC 14 PC14 5’-GGCGGACTGT 5 PC05 5’-GTAGACCCGT 15 PC15 5’-CCAGACCCTG 6 PC06 5’-TTCCCCCGCT 16 PC16 5’-CAATCGCCGT 7 PC07 5’-GGACCCTTAC 17 PC17 5’-TCGGCGATAG 8 PC08 5’-TGGACCGGTG 18 PC18 5’-GTCCACACGG 9 PC09 5’-AAGCCTCGTC 19 PC19 5’-CAGCACCCAC 10 PC10 5’-ACTTCGCCAC 20 PC20 5’-GGGAAGGACA 18 ˗ Hóa chất tách chiết ADN tổng số được mua từ hãng Sigma: + Đệm ( dung dịch) Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100ml gồm: 1g CTAB; 40ml H2O; 10ml Hydroxymethyl aminomethane Hydrochloride (Tris – HCl) 1M, pH 8.0; 28ml Clorua natri (NaCl) 5M; 4ml Ethylene diamine tetra acetate (EDTA) 0.5M, pH 8.0; 1g Polyvilyn polydon (PVP). + Đệm TE 10ml gồm: 10mM Tris - HCl pH 8.0; 1mM EDTA 8.0. + Isopropanol. + Hỗn hợp Phenol/ Chlorofom/ isoamylalcohol (25:24:1). + Agarose. + Ethidium Bromide (EtBr). + Loading buffer 6X (Bromophenol blue 10%; Glycerin 100%; H2O). + Đệm TAE (Tris acetate EDTA) 1X (Tris – acetate; EDTA pH 8.3; H2O). + Cồn 96o. - Hóa chất dùng cho phản ứng PCR được mua từ hãng Invitrogen gồm: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, đệm PCR. * Máy móc thiết bị: - Các thiết bị sử dụng để tách chiết ADN và chạy phản ứng PCR gồm: + Nồi khử trùng: auto clever, HVE – 50 hãng Hirayama, Japan. + Cân phân tích: TE 612 của hãng Satorius, Mỹ. + Pipetman: 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl hãng Biotit. + Tủ lạnh -20oC, 4oC của hãng Sanyo, Toshiba – Japan. + Máy ổn nhiệt: BW – 05G của Lab. Companion, Korea. + Máy PCR: 9800 Fast Thermal Cycler hãng Applied Biosystems, USA + Máy chạy điện di: Fill line, Power station 300 hãng CLP. + Máy soi, chụp gel: Dolphin – doc hãng Wealtec. 19 + Máy đo quang phổ: 8452 Hewllet – Packart hãng Hp, USA + Máy hút chân không: Centrifuge for vancuum Modulspin – Bistron. + Máy ly tâm lạnh: Mikro 22R Hettich zentrifugen. 2.3.2. Phương pháp phân tích RAPD 2.3.2.1. Phương pháp tách ADN hệ gen Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp tách chiết ADN của Shagai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết ADN hệ gen của các dòng Song mật. Quy trình bao gồm các bước: Bước 1: Nghiền 0,2g lá Song mật trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ. Bột đã nghiền cho vào ống ly tâm 1,5ml. Thêm 1ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút. Bước 2: Ủ các ống ở điều kiện 65oC trong 60 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả. Bước 3: Chuyển các ống từ tủ ấm ra, để nguội ở nhiệt độ phòng 15 phút. Sau đó ly tâm trong 10 phút với tốc độ 12.000 vòng/ phút. Bước 4: Chuyển phần dịch phía trên sang ống ly tâm mới. Thêm 500µl dung dịch phenol/ Chloroform/ isoamy alcohol (25:24:1). Trộn đều dung dịch bằng máy Vortex. Bước 5: Ly tâm 5 phút tốc độ 12.000 vòng/phút ở 4oC Bước 6: Chuyển lớp trên cùng vào ống ly tâm mới (1,5ml). Thêm 500µl Chloroform/ isoamy alcohol (24:1), xoay ống nhẹ nhàng 10 phút. Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ là 4oC. Bước 8: Dùng Pipetman hút lớp trên cùng (500µl) sang ống ly tâm mới (1,5ml) thêm 1ml isopropanol lạnh, xoay ống nhẹ vài phút và ủ ở nhiệt độ 20oC trong 60 phút. Bước 9: Ly tâm 15 phút tốc độ 3.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC để thu tủa. Bước 10: Rửa ADN kết tủa bằng 500µl cồn 70%, lắc nhẹ nhàng. Ly tâm 5 phút tốc độ 12.000 vòng/phút. 20 Bước 11: Sau đó đổ cồn ra, úp ống ly tâm trên giấy thấm khô. Bước 12: Bổ sung 50µl TE vào ống ly tâm có chứa ADN, bảo quản -20oC. 2.3.2.2. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế. Nguyên lý: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm của các base purine và pyrimidine, sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu và cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: 50(µg/ml) cho một dung dịch ADN sợi đôi. Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau: CADN (µg/ml) = OD260 nm × 50 × Độ pha loãng Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở bước sóng 280nm (OD280nm). 280nm là bước sóng mà ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic. Một dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Bước tiến hành: ˗ Lấy 1ml dung môi hòa tan ADN (TE pH 8.0 hoặc nước deion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng. ˗ Cho 20µl dung dịch ADN cần định lượng vào 980µl dung môi hòa tan ADN (pha loãng 50 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bước sóng 260nm và 280nm. ˗ Từ kết quả thu được ta tính nồng độ ADN và độ tinh sạch của ADN theo công thức trên. Phương pháp định lượng ADN được đo trên máy quang phổ 8452 Hewllet – Packart và dựa vào nồng độ để pha loãng ADN ra nồng độ 25(ng/ml) bằng nước cất 3 lần để chuNn bị chạy PCR với các mồi RAPD. 21 2.2.2.3. Phương pháp điện di sản ph-m PCR trên gel Agarose Nguyên lý: Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các ADN. Ðó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Các đoạn ADN sẽ di chuyển trong điện trường trên bản gel, với tốc độ tương quan nghịch với kích thước của chúng. Trong cùng một thời gian nhất định (tùy thí nghiệm) các đoạn kích thước nhỏ sẽ di chuyển xa hơn các đoạn lớn, từ đó mà ADN được tách thành các vạch trên bản gel. Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn ADN cần phân tách. Ðoạn ADN có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại. Bảng 2.3 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự ADN có kích thước xác định. Bảng 2.3. Tương quan nồng độ gel agarose và kích thước ADN phân tách Hàm lượng agarose trong gel (%w/v) Kích thước các đoạn ADN cần phân tách (kb) 0,3 5 – 60 0,6 1 – 20 0,7 0,8 – 10 0,9 0,5 – 7 1,2 0,4 – 6 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2 (Nguồn: Sambrook J. và cộng sự, 1989) 22 Trong điện di trên gel agarose, các đoạn ADN được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ Ethidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của ADN phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV. Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng tia UV, các đoạn ADN hiện thành vạch sáng màu trên bản gel. Để ước lượng kích thước các trình tự ADN trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM). Đó là một tập hợp trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN – marker). Buớc tiến hành: Bước 1: ChuNn bị gel agarose 1% (gel phân tách ADN của phản ứng PCR – RAPD có nồng độ là 1,2%). Cân 0,37 g agarose hoà tan trong 37ml dung dịch đệm 1X TAE. Đun dung dịch này trong lò vi sóng trong khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn (nếu trong quá trình đun bị mất nước thì phải bổ sung thêm nước để đạt thể tích 37ml). Để dung dịch agarose nguội dần, nhiệt độ đạt 50 – 60oC , đổ vào khay điện di đã cài sẵn lược, sau đó chờ 20 – 30 phút cho gel agarose đông cứng. Gỡ khay gel và đặt vào bể điện di, đổ dung dịch đệm 1X TAE ngập gel độ 0,5cm, tháo lược ra khỏi bản gel. Bước 2: Tra mẫu ADN Trộn mẫu ADN cần điện di với dung dịch đệm màu - Loading buffer theo tỷ lệ: 1 thể tích dịch đệm + 2 thể tích mẫu ADN. Tra mẫu vào các giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu) và thêm thang ADN chuNn (marker) để giúp xác định độ dài của các băng ADN. Bước 3: Chạy điện di Với hiệu điện thế từ 60 – 80V, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Quan sát sự di chuyển bằng vạch màu Bromophenol blue để ngừng quá trình điện di. 23 Bước 4: Nhuộm mẫu Khi chạy điện di xong, bản gel agarose được lấy ra và ngâm vào dung dịch EtBr ở nồng độ 30(µl/l). Để 20 – 30 phút, sau đó rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước 15 – 20 phút. Sau đó đưa bản gel vào máy soi gel bằng tia UV. Bước 5: Quan sát và chụp ảnh Soi gel agarose trên máy UV, dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 – 260nm. Chụp các ảnh bằng máy chuyên dụng Polaroid (Gel - Doc). 2.2.2.4. Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD Kỹ thuật chạy PCR của ADN hệ gen với các mồi RAPD được thực hiện trên máy PCR 9800 Fast Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ). Thành phần phản ứng PCR – RAPD được nêu rõ trong bảng 2.4. Mỗi phản ứng được thực hiện trong thể tích 25µl (tính cho 16 phản ứng). Bảng 2.4. Thành phần các chất phản ứng PCR - RAPD TT Hóa chất 1 phản ứng (µl) 16 phản ứng (µl) Ghi chú 1 H2O 15 240 2 Buffer 10X PCR 2,5 40 3 Mg2+ (50mM) 2,5 40 4 dNTP (2,5mM) 1 16 5 Primer 1,5 24 6 ADN - template 2 Mỗi phản ứng 1 ADN - template 7 Taq – Polymerase 0,5 8 Trộn đều các hỗn hợp trên rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình RAPD – CT đã cài đặt sẵn với 45 chu kỳ gồm các bước: 24 1. 94 oC trong 3 phút; 5. 45 chu kỳ (2+3+4); 2. 92 oC trong 1 phút; 6. 72 oC trong 10 phút; 3. 35 oC trong 1 phút; 7. 4oC trong 30 phút. 4. 72 oC trong 1 phút; Hình 2.1. Chế độ nhiệt và thời gian chạy phản ứng PCR. 2.2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu RAPD Sản phNm PCR với các mồi RAPD sau khi chạy điện di trên gel agarose 1,2% sẽ được nhuộm và chụp ảnh để phân tích số liệu. Công việc đầu tiên là xác định băng đơn hình và đa hình dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của băng đó giữa các dòng (mẫu) nghiên cứu. Nếu một băng ADN (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở dòng i nhưng không xuất hiện ở dòng j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các dòng khác thì băng ADN này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng ADN này xuất hiện ở tất cả các dòng nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình. Tiếp theo các băng này được mã hoá bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu băng đa hình xuất hiện ở dòng nào thì tại đó ký hiệu là 1 và ngược lại được ký hiệu là 0. Số liệu thu được, được nhập trực tiếp vào phần mềm Excel. Sau đó được xử lý bằng chương trình NTSYSpc version 2.02h để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức: 94oC 92oC 72oC 35oC 4oC 0 3 phút 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút 30 phút to tg 25 Jij = a/(n – d) Trong đó: a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j; d: Số băng ADN có ở dòng i hoặc dòng j; n: Tổng số băng thu được; Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j; Sau đó số liệu lần lượt được xử lý qua các bước trong NTSYS – SIMQUAL, SAHN. và cuối cùng là Tree để vẽ biểu đồ phân tích mối tương quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu. 26 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Mẫu lá Song mật sau khi lấy từ 4 tỉnh phía Bắc được bảo quản lạnh trong tủ -20oC. Khi tách chiết ADN, mẫu bảo quản được lấy ra và nghiền bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng. Tiếp đó tiến hành các bước trong quy trình tách chiết ADN của Saghai Maroof và cộng sự (1984). Tuy nhiên, Song mật là loài cây có chứa hàm lượng hydratcacbon cao ảnh hưởng đến kết quả tách chiết ADN tổng số. Vì vậy, cần phải tiến hành cải tiến một số bước trong quy trình tách chiết ADN tổng số được trình bày ở phần phương pháp. Kết quả tách chiết ADN được thể hiện trên hình 3.1. Hình 3.1. ADN tổng số 15 mẫu Song mật điện di trên gel agarose 1%. Trên ảnh điện di, băng ADN tổng số ở 15 mẫu Song mật thu được đều gọn, tập trung, không dính giếng cũng như không xuất hiện vệt sáng phía sau kéo dài. Điều đó cho thấy ADN ở các mẫu Song mật sau khi tách chiết có độ nguyên vẹn cao, không lẫn protein, ARN (Axit ribonucleic). Tiếp theo ADN tách chiết được xác định nồng độ và độ tinh sạch trên máy quang phổ hấp phụ ở 2 bước sóng: OD260nm và OD280nm; tỷ lệ OD260nm/OD280nm có giá trị 1,8 – 2,0 được xem là sạch. Các mẫu có tỷ số nhỏ hơn 1,8 và lớn hơn 2,0 cho biết ADN tách chiết bị nhiễm tạp hoặc với protein hoặc với phenol. Bảng 3.1 cho thấy kết quả đo tỷ số hấp phụ OD260nm/OD280nm ở các mẫu ADN Song mật tách chiết nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 và từ kết quả đo OD260nm ta tính được nồng độ ADN trong các mẫu. 27 Bảng 3.1. Độ hấp thụ bước sóng 260nm, 280nm và nồng độ ADN tổng số Độ hấp phụ Mẫu đo OD260 OD280 OD260/OD280 Nồng độ ADN µg/ml S1 0,0110 0,0059 1,88 27,5 S2 0,0120 0,0049 1,84 30,0 S3 0,0090 0,0044 1,92 22,5 S4 0,0092 0,0051 1,88 23,0 S5 0,0106 0,0053 1,94 26,5 S6 0,0103 0,0052 2,02 25,8 S7 0,0110 0,0046 1,79 27,5 S8 0,0102 0,0046 1,86 25,5 S9 0,0098 0,0047 1,94 24,5 S10 0,0084 0,0044 1,91 21,0 S11 0,0087 0,0046 1,90 21,8 S12 0,0091 0,0046 1,97 22,8 S13 0,0093 0,0050 1,88 23,3 S14 0,0106 0,0055 1,92 26,5 S15 0,0098 0,0054 1,81 24,5 Từ kết quả điện di và số liệu đo quang phổ hấp thụ của ADN cho thấy ADN tổng số tách chiết được có độ tinh sạch và nguyên vẹn cao, hoàn toàn đáp ứng cho phản ứng PCR – RAPD tiếp theo. Từ nồng độ ADN tính theo công thức ta sẽ pha loãng ADN để sử dụng cho phản ứng PCR – RAPD với nồng độ sau pha loãng là 25(ng/ml). 28 3.2. Kết quả nhân PCR – RAPD ADN tổng số của các mẫu Song mật thu được sau khi tách chiết dùng làm khuôn cho các phản ứng PCR với 20 đoạn mồi RAPD có tên và trình tự tại bảng 2.2. Phản ứng PCR – RAPD được tiến hành gồm các thành phần: ADN khuôn, mồi đơn, Taq polymerase, 4 loại deoxynucleotit triphotphat (dNTPs) và dung dịch đệm, muối MgCl2. Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR được tiến hành trên khuôn là các ADN của các mẫu Song mật thu được ở trên với 20 mồi RAPD để tiến hành phân tích sự biến đổi di truyền của các dòng Song mật. Sau khi hoàn thành phản ứng PCR sản phNm được điện di trên gel agarose 1,2% để phân tích đa hình ADN của các mẫu nghiên cứu. Các phân đoạn RAPD thu được được phân tích dựa trên sự có mặt hay không có mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu. Nếu có thì ký hiệu 1 còn không thì có ký hiệu là 0. Những phân đoạn mà có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu khác gọi là phân đoạn đa hình. Dựa vào mức độ đa hình của các phân đoạn này chúng ta có thể đánh giá mức độ khác nhau và giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Kết quả của phản ứng PCR – RAPD quan sát được sau khi nhuộm bản gel bằng EtBr và soi dưới tia UV. Bằng phần mềm quan sát và chụp ảnh kết quả để thuận tiên hơn trong việc phân tích số liệu. Với 15 mẫu phân tích và 20 đoạn mồi RAPD ta có 300 phản ứng, trong đó có 3 đoạn mồi không xuất hiện phân đoạn ADN nào khi soi bản gel (PC04; PC07; PC15). Các phân đoạn ADN được nhân lên là những băng vạch sáng màu xuất hiện trên bản gel hình 3.2. 29 Hình 3.2. Sản ph-m PCR – RAPD với mồi PC 09