Đề tài Nghiên cứu xử lý váng mỡ ở nhà hàng Phương Nguyên Tây Hồ, Hà Nội bằng phương pháp hóa học và sinh học

ẽ ñược este hóa với ancol. Chất glixerin hình thành phải ñược tách ra khỏi dầu ñiezen sinh học sau ñấy. H2C HC H2C OCOR1 OCOR2 OCOR3 + 3ROH xúc tác ROCOR1 ROCOR2 + + ROCOR3 + H2C HC H2C OH OH OH Triglixerit ancol este glixerin Thông qua việc chuyển ñổi este này dầu ñiezen sinh học có ñộ nhớt ít hơn dầu thực vật rất nhiều và có thể ñược dùng làm nhiên liệu thay thế cho dầu ñiezen mà không cần phải cải biến ñộng cơ ñể phù hợp. ðiezen sinh học có nhiều ưu ñiểm ñối với môi trường so với ñiezen thông thường: ví dụ như ñiezen sinh học từ cây cải dầu phát sinh khí thải ít hơn rất nhiều so với nhiên liệu hóa thạch. Bụi trong khí thải ñược giảm một nửa, các hợp chất hyñrocacbon ñược giảm thiểu ñến 40%. ðiezen sinh học gần như không chứa ñựng lưu huỳnh, không ñộc và có thể dễ dàng phân hủy bằng phương pháp sinh học. ðiezen sinh học hiện nay ñược coi là một trong những nhiên liệu thân thiện với môi trường nhất trên thị trường. Dầu nấu ăn thải từ các nhà hàng ở thành phố Hồ Chí Minh ñã ñược sử dụng làm nguyên liệu ñể sản xuất ñiezen sinh học [10]. Hóa chất ñược dùng ở ñây là ancol metylic, xúc tác là KOH. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ xúc tác, nhiệt ñộ, tỉ lệ metanol/ khối lượng chất thải tới hiệu suất hình thành ñiezen sinh học. Kết 25 qủa hiệu suất từ 88 - 90% khi tỉ lệ metanol/khối lượng chất thải 7:1 - 8:1, nhiệt ñộ 300 – 500C, khối lượng xúc tác là 0.75% so với khối lượng chất thải. ðiezen sinh học và hỗn hợp của nó với ñiezen có những tính chất vật lý ñặc trưng cho nhiên liệu ñiezen . Như vậy nếu tách ñược lipit chúng ta có thể sản xuất ñược ñiezen sinh học. 2.2.4.2. Cồn khô Cồn khô ở dạng gel ñó là một trạng thái vật chất của một hệ keo có môi trường phân tán ở thể rắn và chất phân tán ở thể lỏng. Chất phân tán ở ñây là ancol etylic, môi trường phân tán là các chất rắn như C17H35COONa. Trong thành phần của nhiên liệu cồn khô dạng gel này cũng có thể ñược trộn vào một số chất mà vẫn không có ảnh hưởng bất lợi ñến tính chất của sản phẩm. Các chất ñó có thể là: Thuốc nhuộm (như Phenolphtalein, Rose Bengal) dùng ñể chỉ thị hoặc ñể gia tăng giá trị thẩm mỹ cho sản phẩm; những chất dùng ñể tạo màu ngọn lửa như muối Natri và muối Kali của Nitrat và Clorat, cũng như các muối của Li, Bo, Cu…Những thành phần này chỉ ñược sử dụng với một lượng nhỏ, thường thì sử dụng không vượt quá 1% khối lượng và thích hợp nhất là 0.5%. Có rất nhiều phương pháp khác nhau dùng ñể ñiều chế cồn khô như: 2.2.4.2.1. Phương pháp ñiều chế cồn khô có sử dụng Canxi axetat bão hoà. Khi trộn Canxi axetat bão hòa trong dung môi nước với rượu thì sẽ tạo thành cồn khô dưới dạng keo Canxi axetat. Kết quả trên có thể ñược giải thích bằng “phương pháp thay dung môi”: Khi thông số trạng thái thay ñổi làm cho hóa thế cấu tử tồn tại trong môi trường phân tán trở nên lớn hơn ở trạng thái cân bằng, do ñó xu hướng của quá trình sẽ diễn ra theo chiều chuyển về trạng thái cân bằng, tức là pha mới ñược tạo ra [14]. Trong phương pháp này dung môi ñược thay thế, tức là thay ñổi thành phần môi trường. Do vậy, Canxi axetat bão hòa trong môi trường nước, nhưng nó trở thành quá bão hoà trong môi trường rượu - nước (Canxi axetat không tan trong rượu) nên quá trình ngưng tụ sẽ xảy ra. 2.2.4.2.2. Phương pháp ñiều chế cồn khô có sử dụng axit béo và kiềm Trong ancol etylic nóng, axit béo ñược hòa tan tốt hơn và phản ứng nhanh với kiềm tạo thành một tác nhân tạo gel là xà phòng axit béo và nước. 26 C17H35COOH + NaOH ---> C17H35COONa +H2O Natri stearat ñược tạo thành sẽ hòa tan một phần trong nước và hình thành một lớp vỏ cứng. Khi ñó rượu sẽ thấm vào lớp vỏ cứng này và tạo thành cồn khô. Sản phẩm có những tính chất sau + Không bị hoá lỏng trong suốt quá trình cháy. + Vẫn duy trì ñược hình dạng ban ñầu của nó. + Sản phẩm cháy sạch, không có bồ hóng. + Khi cháy không có khói, không mùi và ngọn lửa có thể nhìn thấy ñược. 2.2.4.2.3. Phương pháp ñiều chế cồn khô có sử dụng dẫn xuất xenlulozơ Ở vùng pH của dung dịch nhỏ, chính các nhóm ion ñược ion hoá gây tác dụng qua lại làm cho mạch phân tử có phần bị co lại, nên ñộ nhớt cũng giảm. Khi tăng pH của dung dịch thì mạch phân tử của các chất cao phân tử ñiện li giãn ra do sự ion hoá tăng lên, nên ñộ nhớt của dung dịch cũng tăng lên. Do ñó khi trộn lẫn các thành phần nước, cồn, Hydroxypropyl metyl xenlulozơ ñược thực hiện bằng cách hạ thấp ñộ pH của hỗn hợp. Sau ñó ñộ pH của hỗn hợp ñược tăng lên làm tăng ñộ nhớt và cồn ñược chuyển sang dạng gel. (1): Trước tiên trộn 200 ml cồn với 50 ml nước. (2): Sau ñó 10 g Methocel J75 MS ñược thêm vào, thu ñược dung dịch sệt có chứa nước. (3): ðổ dung dịch sệt này vào vật chứa có chứa sẵn một lượng chất kiềm ñủ ñể tăng pH ñến 8 hoặc trên 8 (lượng Natri hydroxit sử dụng là từ 2 ñến 4 gam). Sự tạo gel sẽ lập tức xảy ra. Nhiên liệu cồn khô ñược ñều chế theo phương pháp này gồm có: + 10 g Methocel J75 MS + 50 g nước +170 g rượu + 2 – 4 g NaOH + Một lượng rất ít nhôm trihydrat ñược thêm vào ñể ngăn chặn sự hydrat hóa Sản phẩm ñược tạo thành có các ñặc ñiểm như: + Hạn chế sinh ra thành phần ñộc hại khi cháy. 27 + An toàn và tiện lợi khi vận chuyển và sử dụng 2.2.4.2.4. Phương pháp ñiều chế cồn khô có sử dụng nguyên liệu vô cơ + Cho 72 g Silic ñioxit và 1.2 g Canxi hydroxit vào 2874 g Etanol và khuấy nhanh khoảng 15 phút. Sau ñó thêm vào 54 g Hydroxypropyl xenlulozơ và trộn ñều. Hỗn hợp này sẽ ñông ñặc dần cho ñến khi giống như một khối gel ñồng nhất (khoảng 1.5 giờ). + Cho 6 g Silic ñioxit, 6 g Titan ñioxit và 0.1 g Canxi hydroxit vào 2898 g Etanol. Sau ñó thêm vào 90 g Hydroxypropyl xenlulozơ và trộn ñều. + 6 g Silic ñioxit, 6 g Nhôm oxit vào 1026 g Etanol. Cho vào 84 g Metylhydroxybutyl và trộn ñều trong khoảng 10 phút Sau ñó thêm vào 374 g nước. Sau 20 phút cho vào thêm 1504 g Etanol sẽ thu ñược khối gel ñồng nhất. 2.2.4.3 Thức ăn gia súc ðịnh nghĩa: Thức ăn là những sản phẩm của thực vật, ñộng vật, khoáng vật và các chất tổng hợp khác, mà ñộng vật có thể ăn, tiêu hóa, hấp thu ñể duy trì sự sống, phát triển và tạo ra sản phẩm. Phân loại: Có nhiều phương pháp phân loại thức ăn khác nhau, căn cứ vào nguồn gốc, ñặc tính dinh dưỡng, tính chất thức ăn [5]. - Phân loại theo nguồn gốc Căn cứ vào nguồn gốc thức ăn ñược chia thành các nhóm sau: + Thức ăn có nguồn gốc từ thực vật: Trong nhóm này gồm các thức ăn xanh, thức ăn rễ, củ, quả, thức ăn hạt các sản phẩm phụ của ngành chế biến nông sản: thức ăn xơ, rơm rạ, dây lang, thân lá lạc, thân cây ngô các loại cám, khô dầu (do các ngành chế biến dầu) bã bia, rượu, sản phẩm phụ. Nhìn chung, loại thức ăn này là nguồn năng lượng chủ yếu cho người và gia súc, ngoài ra nó còn cung cấp vitamin, protein thô, các loại vi khoáng, kháng sinh, hợp chất sinh học. + Thức ăn có nguồn gốc từ ñộng vật: gồm tất cả các loại sản phẩm chế biến từ nguyên liệu ñộng vật như bột cá, bột tôm, bột thịt, bột nhộng tằm, bột sữa và bột máu. Hầu hết thức ăn ñộng vật có protein chất lượng cao, có ñủ các axit amin thiết yếu, các nguyên tố khoáng và một số vitamin A, D, E, K, B12.., tỷ lệ tiêu hóa và 28 hấp thụ các chất dinh dưỡng trong thức ăn ñộng vật cao hay thấp phụ thuộc vào cách chế biến, làm thức ăn bổ sung protein quan trọng trong khẩu phần của gia súc gia cầm. + Thức ăn nguồn khoáng chất: Gồm các loại bột sò, ñá vôi và các muối khoáng khác nhằm bổ sung các chất khoáng ña và vi lượng. - Phân loại theo thành phần các chất dinh dưỡng Phương pháp này chủ yếu dựa vào hàm lượng các chất dinh dưỡng chính trong thức ăn: protein, lipit, gluxit, nước.. + Thức ăn giàu protein: Tất cả những loại thức ăn có hàm lượng protein thô chiếm trên 20% (tính theo vật chất khô) thì ñược gọi là những loại thức ăn giàu protein. + Thức ăn giàu lipit: Gồm các loại thức ăn mà hàm lượng lipit chiếm trên 20%. Mục ñích sử dụng thức ăn này là cung cấp một lượng lipit thích hợp trong khẩu phần ñã ñủ hàm lượng vật chất khô nhưng giá trị năng lượng còn quá thấp. + Thức ăn giàu gluxit: Là loại thức ăn trong ñó có hàm lượng gluxit 50% trở lên, gồm các loại hạt ngũ cốc, ngô, thóc cám, bột khoai, bột sắn. Thức ăn này chiếm tỷ lệ rất lớn trong khẩu phần thức ăn gia súc dạ dầy ñơn, nó là nguồn năng lượng dễ tiêu hóa, hấp thụ và ít gây tai biến trong quá trình sử dụng mà giá thành rẻ. + Thức ăn nhiều nước: Gồm các loại thức ăn có hàm lượng nước từ 70% trở lên. Ví dụ: thức ăn củ quả, bã rượu, bia, rau xanh, bèo... + Thức ăn nhiều xơ: Gồm các loại thức ăn mà hàm lượng xơ thô 18% trở lên. Loại thức ăn này là sản phẩm chế biến ngành trồng trọt, như rơm rạ, dây lang, dây lạc.. những loại thức ăn này ít có ý nghĩa với gia súc dạ dày ñơn nhưng chiếm tỷ trọng lớn trong khẩu phần gia súc nhai lại. + Thức ăn giàu khoáng: gồm các loại muối khoáng, bột xương, muối ăn, bột sò... + Thức ăn giàu vitamin: gồm những loại vitamin hoặc những loại thức ăn giàu vitamin như: bột rau xanh, dầu gan cá... + Thức ăn bổ sung khác: gồm các loại thức ăn có nguồn gốc ñặc biệt như kháng sinh, 29 các hợp chất chứa nitơ, các chất chống oxy hóa, các chất kích thích sinh trưởng. - Phân loại theo ñương lượng tinh bột Theo phương pháp này, người ta phân thức ăn thành 2 loại: thức ăn tinh và thức ăn thô. + Thức ăn thô: bao gồm các loại thức ăn có ñương lượng tinh bột dưới 45% nghĩa là trong 100 kg thức ăn có giá trị không quá 45 ñơn vị tinh bột. + Thức ăn tinh: bao gồm các loại thức ăn có ñương lượng tinh bột trên 45% (trong vật chất khô) như các hạt ngũ cốc, bột củ quả, các hạt khô dầu. Trong thức ăn tinh còn phân ra thức ăn giàu protein, gluxit, lipit... - Phân loại theo tính axit và kiềm Người ta căn cứ vào ñộ pH của sản phẩm chuyển hóa cuối cùng ñể chia thức ăn thành axit hay kiềm. Thường những thức ăn có chứa nhiều P, Cl, S thì sản phẩm cuối cùng của sự chuyển hóa mang tính axit. Ví dụ: P cho H3PO4, S cho H2SO4, Cl cho HCl, còn loại thức ăn nhiều Ca, K, Na, Mg thì sản phẩm chuyển hóa cuối cùng mang tính kiềm. Những loại thức ăn kiềm tính gồm: thức ăn xanh, củ quả, thức ăn ủ xanh... Những loại thức ăn này thích hợp cho gia súc sinh sản, tác dụng tốt ñối với kích thích tiết sữa. Trong khi, những loại thức ăn toan tính như: các loại thức ăn ñộng vật, hạt họ ñậu và một vài loại thức ăn giàu protein lại thích hợp với gia súc ñực, gia súc ñực sinh sản nhất là trong thời gian lấy tinh. - Hiện nay trên thế giới người ta phân thức ăn thành tám nhóm: + Thức ăn thô khô: Tất cả các loại cỏ xanh tự nhiên thu cắt và các loại phế phụ phẩm của cây trồng ñem phơi khô có hàm lượng xơ trên 18% ñều là thức ăn thô khô. Bao gồm: cỏ khô họ ñậu hoặc hòa thảo, rơm rạ, dây lang, dây lạc và thân cây ngô... phơi khô. Ngoài ra còn gồm vỏ các loại hạt thóc, lạc, ñậu, lõi và bao ngô. + Thức ăn xanh: Tất cả các loại cỏ trồng, cỏ tự nhiên, các loại rau xanh cho gia súc sử dụng ở trạng thái tươi, xanh bao gồm: rau muống, bèo hoa dâu, lá bắp cải, su hào, cỏ tự nhiên, cỏ trồng như cỏ voi và cỏ sả, bèo tấm, rau dừa nước, rau dền, rau lấp, thân lá khoai lang... 30 + Thức ăn ủ chua: Tất cả các loại thức ăn chua, các loại cỏ hòa hoặc thân, bã phụ phẩm của ngành trồng trọt như thân, lá lạc, bã dứa, vỏ chuối, thân cây ngô... ñem ủ chua. + Thức ăn giàu năng lượng: Tất cả các loại thức ăn có hàm lượng protein dưới 20% và xơ thô dưới 18%. Bao gồm các loại hạt ngũ cốc như ngô, gạo, sắn, củ khoai lang, cao lương, mạch, mỳ... và phế phụ phẩm của ngành xay xát như cám gạo, cám ngô, cám mỳ, tấm...nhóm nguyên liệu này chiếm tỷ lệ cao nhất trong công thức thức ăn hỗn hợp, thường chiếm 40 - 70% tỷ trọng. Một số loại dầu thô, mỡ thô cũng ñược dùng bổ sung vào công thức thức ăn hỗn hợp nhưng không vượt quá 4- 5%. Ngoài ra còn có các loại củ, quả như sắn, khoai lang, khoai tây, bí ñỏ.... + Thức ăn giàu protein: Tất cả các loại thức ăn có hàm lượng protein trên 20%, xơ thô dưới 18%. Thức ăn giàu protein có nguồn gốc ñộng vật: bột cá, bột thịt, sữa bột, bột thịt xương, bột máu, nước sữa..; thức ăn giàu protein có nguồn gốc thực vật: hạt ñỗ tương, lạc, ñậu xanh, ñậu triều, ñậu nho nhe, khô ñỗ tương, khô lạc, khô dầu hướng dương, khô dầu dừa, khô dầu bông. + Thức ăn bổ sung khoáng: Bột vỏ sò, bột ñá, vỏ hến, dicanxiphotphat, bột xương... + Thức ăn bổ sung vitamin: Các loại vitamin B1, B2, B3, D, A hoặc premix vitamin. + Các loại thức ăn bổ sung khác 31 Chương 2. Thực nghiệm 1. ðối tượng nghiên cứu ðối tượng nghiên cứu của luận văn này là - Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học yếm khí sinh khí metan với chất thải là váng mỡ nhà hàng Phương Nguyên. - Nghiên cứu khả năng tách mỡ bằng nhiệt của chất thải, từ mỡ thu ñược thí nghiệm làm cồn khô, từ phần bã thu ñược sau khi sấy chất thải thử nghiệm làm thức ăn gia súc trên chuột. 2. Các phương pháp phân tích 2.1. Xác ñịnh chỉ số COD • Nguyên tắc Dùng K2Cr2O7 là chất oxi hóa mạnh ñể oxi hóa các hợp chất hữu cơ. Sau ñó, chuẩn ñộ lượng K2Cr2O7 bằng dung dịch muối Mohr với chỉ thị feroin. ðể oxi hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ mạch thẳng, các hydrocacbon thơm khó bị oxi hóa có mặt trong nước thải cần cho Ag2SO4 làm xúc tác, 80 – 90% sẽ ñược oxi hóa. Phản ứng oxi hóa: Chất hữu cơ + Cr2O −27 + H + → 2Cr3+ + H2O + CO2 Phản ứng ñược tiến hành ở 80 – 900 C với xúc tác Ag2SO4 trong thời gian tối thiểu là 2 giờ. Hầu hết các chất hữu cơ bị oxi hóa bởi hỗn hợp sôi của K2Cr2O7 và H2SO4. Nước thải chứa ion Cl − và các hợp chất khác của clo cần sử dụng HgSO4 ñể che ion Cl − làm ảnh hưởng tới phép phân tích. Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch K2Cr2O7 0.25N (cân chính xác 12.259 g K2Cr2O7 hòa tan trong 500 ml nước cất và ñịnh mức tới 1lít) - Dung dịch muối Mohr - Chỉ thị feroin (hòa tan 1.48 g octophenanthrolinmonohydrat với 0.695 g FeSO4.7H2O trong nước cất hai lần. ðịnh mức tới 100 ml). Mỗi lần dùng muối Mohr phải xác ñịnh lại nồng ñộ bằng cách: lấy 5 ml K2Cr2O7 0.25N, thêm 5 ml H2SO4 ñặc, thêm hai giọt chỉ thị feroin, chuẩn bằng dung dịch muối Mohr cho ñến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu ñỏ nâu. 32 Nồng ñộ muối Mohr ñược xác ñịnh theo công thức: N = 5.0.25 V • Tiến hành thí nghiệm và tính toán Lấy 2.5 ml mẫu nước thải vào bình cầu cổ nhám, cho 2.5 ml dung dịch K2Cr2O7 0.25N, sau ñó thêm 5 ml dung dịch Ag2SO4/H2SO4, cho vài viên ñá bọt. Lắp bình cầu vào sinh hàn. ðun sôi trong khoảng 15 phút tính từ lúc sôi. Sau ñó ñể nguội, ñổ dung dịch vào bì nh nón. Chuẩn lượng K2Cr2O7 dư bằng dung dịch muối Mohr 0.25N với 2 – 3 giọt feroin cho ñến khi dung dịch có màu ñỏ nâu. Ghi lại lượng muối Mohr tiêu tốn. Tính toán kết quả: COD = ( ) 80 1008000. 211 ××− m morh V NVNV Trong ñó: - V1: thể tích dung dịch K2Cr2O7 ban ñầu (ml) - VMohr: thể tích dung dịch muối Mohr dùng ñể chuẩn ñộ lượng K2Cr2O7 dư (ml) - Vm: thể tích của mẫu nước thải ñem phân tích (ml) - N1: nồng ñộ ñương lượng của dung dịch K2Cr2O7 (ñlg) - N2: nồng ñộ ñương lượng của dung dịch muối Mohr (ñlg) 2.2. Phương pháp xác ñịnh NH4+ • Nguyên tắc Ion NH +4 trong môi trường kiềm phản ứng với thuốc thử Nessler (K2HgI4), tạo phức màu vàng hay màu nâu sẫm tùy thuộc vào hàm lượng amoni có trong mẫu nước. Sau ñó ño quang ở bước sóng λ = 420 ηm. • Chuẩn bị hóa chất - Xecnhet: Cân 50 g Kali natritactrat KNaC4H12O6 trong 100 ml nước cất; - Nessler: Nessler A: K2HgI4: 36 g KI trong 100 ml nước cất. Hòa tan 13.55 g HgCl2 trong 1 lít nước; Σ Nessler A: 1100 ml; Nessler B: 56 g NaOH hoặc 57.5 g KOH trong 30ml; 33 Dung dịch Nessler: 100 ml A + 30 ml B; Hoặc 2KI + HgI2 → K2HgI4 Pha 3.32 g KI + 4.55 g HgI2 trong 200 ml nước cất ta ñược dung dịch Nessler. • Xác ñịnh ñường chuẩn Cân 0.2965 g NH4Cl (ñã sấy ở 105 0C trong 2 giờ). Hòa tan bằng nước cất hai lần, ñịnh mức ñến vạch 1000 ml. ðược dung dịch A nồng ñộ NH4+ bằng 100 mg/l. Sau ñó, pha loãng dung dịch A 10 lần ñược dung dịch B có nồng ñộ NH4+ bằng 10 mg/l. Chuẩn bị 11 ống nghiệm khô với các thể tích dung dịch NH +4 khác nhau. Sau ñó cho thêm 0.2 ml Xecnhet; 0.3 ml Nessler vào các ống nghiệm. Tiến hành ño quang ở bước sóng 420 ηm, sau ñó xây dựng ñường chuẩn. Bảng 2.1. Sự thay ñổi mật ñộ quang theo nồng ñộ amoni ở các mẫu thí nghiệm Ống nghiệm Thể tích dd B (ml) Thể tích nước cất (ml) Nồng ñộ NH +4 (mg/l) Xecnhet ml Nessler ml ABS (mật ñộ quang) 1 0 5 0 0.2 0.3 0 2 0.2 4.8 0.4 0.2 0.3 0.054 3 0.4 4.6 0.8 0.2 0.3 0.11 4 0.6 4.4 1.2 0.2 0.3 0.171 5 0.8 4.2 1.6 0.2 0.3 0.211 6 1 4 2 0.2 0.3 0.263 7 1.2 3.8 2.4 0.2 0.3 0.314 8 1.4 3.6 2.8 0.2 0.3 0.366 9 1.6 3.4 3.2 0.2 0.3 0.412 10 1.8 3.2 3.6 0.2 0.3 0.471 11 2 3 4 0.2 0.3 0.519 34 ñng chun xác ñnh nng ñ amoni y = 0.1287x + 0.0055 R2 = 0.9993 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 1 2 3 4 5 nồng ñộ amoni (mg/l) A B S Hình 2.1. ðường chuẩn amoni 2.3. Phương pháp xác ñịnh nồng ñộ NO −2 • Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên phản ứng của NO −2 với thuốc thử Griss cho một hợp chất màu hồng. • Chuẩn bị hóa chất Thuốc thử Giss A: cân 0.5 g axit Sunfanilic vào 150 ml dung dịch axit axetic loãng 10%, ñun nhỏ lửa cho tan; Thuốc thử Giss B: cân 0.1 g Naphtylamin cho vào 200 ml nước cất. ðun cách thủy 15 phút, sau ñó chắt lấy nước trong cho vào 150 ml dung dịch axit axetic 10%. • Xác ñịnh ñường chuẩn Hòa tan 0.1497 g NaNO2 tinh khiết (ñã sấy khô ở 105 0C trong 2 giờ) bằng nước cất hai lần. ðịnh mức ñến 1000 ml ñược dung dịch A có nồng ñộ NO −2 100 mg/l. Tiếp theo pha loãng 100 lần ñược dung dịch B có nồng ñộ NO −2 là 1mg/l. Chuẩn bị 11 ống nghiệm khô với các thể tích dung dịch NO −2 khác nhau. Sau ñó cho lần lượt 1 ml Sunfanilic, 1 ml α-Naphtylamin vào các ống nghiệm. Tiến hành ño quang ở bước sóng 520 ηm, sau ñó xây dựng ñường chuẩn. 35 ðường chuẩn xác ñịnh nồng ñộ nitrit y = 0.6354x + 0.0061 R2 = 0.9996 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 nồng ñộ nitrit (mg/l) AB S Bảng 2.2. Sự thay ñổi mật ñộ quang theo nồng ñộ nitrit ở các mẫu thí nghiệm Ống nghiệm Thể tích dd B (ml) Thể tích nước cất (ml) Nồng ñộ NO −2 (mg/l) Axit sunfanilic ml α- Naphtylamin ml ABS (mật ñộ quang) 1 0 5 0 1 1 0 2 0.2 4.8 0.04 1 1 0.027 3 0.4 4.6 0.08 1 1 0.055 4 0.5 4.5 0.1 1 1 0.071 5 0.8 4.2 0.16 1 1 0.112 6 1 4 0.2 1 1 0.137 7 1.5 3.5 0.3 1 1 0.198 8 2 3 0.4 1 1 0.261 9 2.5 2.5 0.5 1 1 0.327 10 3.5 1.5 0.7 1 1 0.455 11 5 0 1 1 1 0.635 Hình 2.2. ðường chuẩn nitrit 2.4. Phương pháp xác ñịnh NO −3 • Nguyên tắc 36 NO −3 tác dụng với thuốc thử phenoldisunfonic tạo axit Nitrophenoldisunfonic. Axit này phản ứng với NO −3 cho phức màu vàng. Cường ñộ màu tỉ lệ với nồng ñộ NO −3 trong dung dịch. ðo quang ở bước sóng λ = 410 ηm. • Hóa chất - Axit phenoldisunfonic; - Dung dịch NH4OH 25 – 28 %. • Xác ñịnh ñường chuẩn Cân 0.1647 g KNO3 99% ñã sấy 2 giờ ở 105 0C pha trong 1 lít nước cất 2 lần ñược dung dịch A có nồng ñộ NO −3 là 100 mg/l. Pha loãng dung dịch A 10 lần ñược dung dịch B có nồng ñộ NO −3 là 10 mg/l. Chuẩn bị 9 cốc khô ñể cô cạn dung dịch B với các thể tích khác nhau. Sau ñó thêm vào từng cốc 0.5 ml Phenoldisunforic. Thêm 5 ml NH3 ñặc, ñịnh mức thành 25 ml. Tiến hành ño quang, sau ñó xây dựng ñường chuẩn. Kết qủa chỉ ra ở bảng và hình sau: Bảng 2.3. Sự thay ñổi mật ñộ quang theo nồng ñộ nitrat ở các mẫu thí nghiệm Ống nghiệm Thể tích dd B (ml) Thể tích nước cất (ml) Nồng ñộ NO −3 (mg/l) Thể tích Phenoldisunforic (ml) Thể tích NH3 ñặc (ml) ABS (mật ñộ quang) 1 0 5 0 0.5 5 0 2 0.2 4.8 0.4 0.5 5 0.008 3 0.5 4.5 1 0.5 5 0.015 4 1 4 2 0.5 5 0.023 5 1.5 3.5 3 0.5 5 0.03 6 2 3 4 0.5 5 0.044 7 3 2 6 0.5 5 0.065 8 4 1 8 0.5 5 0.085 9 5 0 10 0.5 5 0.105 37 ñường chuẩn xác ñịnh nồng ñộ nitrat y = 0.0103x + 0.0023 R2 = 0.9976 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 5 10 15 nồng ñộ nitrat (mg/l) AB S Hình 2.3. ðường chuẩn nitrat 2.5. Phương pháp xác ñịnh PO −34 • Nguyên tắc PO −34 phản ứng với Vanadat – Molipdat tạo ra phức có màu vàng. Cường ñộ màu tùy thuộc vào hàm lượng PO −34 có trong mẫu. Sau ñó ño quang ở bước sóng 470 ηm.. • Hóa chất - Vanadat – Molipdat. • Xác ñịnh ñường chuẩn Cân 1.211 g NH4H2PO4 ñã sấy khô ở 105 0C trong 2 giờ pha trong 1lít nước. ðược dung dịch A có nồng ñộ PO43- là 1000 mg/l. Sau ñó pha loãng dung dịch A 10 lần ñược dung dịch B có nồng ñộ PO −34 là 100 mg/l. Cho dung dịch PO −34 vào các bình ñịnh mức theo tỷ lệ khác nhau, cho thêm 5 ml Vanadat – Molipdat và ñịnh mức bằng nước cất ñến vạch 25 ml. Sau ñó tiến hành ño quang và xây dựng ñường chuẩn, kết qủa chỉ ra ở bảng và hình sau: 38 ñường chuẩn xác ñịnh nồng ñộ photphat y = 0.0042x + 0.0011 R2 = 0.9999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 20 40 60 80 nồng ñộ photphat (mg/l) A B S Bảng 2.4. Sự thay ñổi mật ñộ quang theo nồng ñộ photphat ở các thí nghiệm Ống nghiệm Thể tích dd B (ml) Thể tích nước cất (ml) Nồng ñộ PO −34 (mg/l) Thể tích Vanadat- Molipdat ml Thể tích nước cất ñể ñịnh mức (ml) ABS (mật ñộ quang) 1 0.0 17.5 0 5 2.5 0 2 0.7 16.8 4 5 2.5 0.017 3 1.4 16.1 8 5 2.5 0.035 4 2.1 15.4 12 5 2.5 0.051 5 2.8 14.7 16 5 2.5 0.069 6 3.5 14.0 20 5 2.5 0.084 7 4.2 13.3 24 5 2.5 0.101 8 5.6 11.9 32 5 2.5 0.136 9 7.0 10.5 40 5 2.5 0.168 10 8.4 9.1 48 5 2.5 0.201 11 10.5 7.0 60 5 2.5 0.25 Hình 2.4. ðường chuẩn photphat 39 • Tiến hành thí nghiệm và tính toán Lấy 17.5 ml mẫu cho vào bình ñịnh mức; thêm 5 ml Vanadat – Molipdat, sau ñó ñịnh mức ñến 25 ml. ðo quang ở bước sóng 470 ηm. 2.6. Phương pháp xác ñịnh protein 2.6.1. Hoá chất - Thuốc thử: Biure, Folin – Ciocalteux Dung dịch Fehling A: Hoà tan 40 g CuSO4. 5H2O pha trong 1 lít nước cất (nếu dung dịch ñục thì lọc). Dung dịch Fehling B: Hoà tan 20 g Kali natri tactrat (C4H4O6NaK.4H2O) và 150 g NaOH trong 1lít nước cất. Bảo quản trong bình nâu nút kín. Dung dịch C: Hoà tan 20.49 g Na2 CO3 2% trong 1 lit dung dịch NaOH 0.1N + Thuốc thử Biure (chỉ pha trước khi dùng) = 1 ml A + 1ml B + 98 ml C + Thuốc thử Folin – Ciocalteux: Hòa tan 100 g natri volframat Na2WO4.2H2O), 25 g Natri molipñat (Na2MoO4.2H2O) vào 800 ml nước cất. Thêm vào 50 ml axit photphoric 85% và 100 ml HCl ñặc. Lắp ống sinh hàn ngược và ñun hỗn hợp trong 10h. Sau ñó thêm vào hỗn hợp 150 g LiSO4, 50 ml nước và vài giọt brôm, ñun 15 phút không có ống sinh hàn ñể loại bỏ brôm dư. Sau ñó làm nguội dung dịch, lấy 5 ml và chuẩn ñộ bằng dung dịch NaOH 0.1N. Dựa vào kết qủa chuẩn ñộ, bổ sung nước ñể dung dịch có nồng ñộ cuối cùng là 2N, lọc nếu dung dịch có kết tủa, giữ dung dịch trong lọ màu. Trước khi dùng thuốc thử cần pha loãng gấp ñôi bằng nước [7]. 2.6.2. Xác ñịnh protein theo phương pháp lowry Nguyên tắc: Protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành sản phẩm màu xanh tím. ðây là sản phẩm khử của photphomolipñen – photphovolframat bởi phức chất ñồng – protein và có ñộ hấp phụ cực ñại ở bước sóng 750 ηm. Dùng máy so màu ñể xác ñịnh cường ñộ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein chuẩn ñể tính ra nồng ñộ. Phương pháp lowry sử dụng kết hợp phản ứng biure (tác dụng lên liên kết peptit) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên các gốc tirozin, triptophan, histidin) ñể tạo phức có màu ñặc trưng. Phương pháp có ñộ nhạy tương ñối cao, cho 40 H2N C NH2 O H2N C N C NH2 O O H HN C N C NH OHOH H NH3 2 - NH 3 Ure Biure (xeto) Biure (enol) 2C N C NH H OHOH HN + Cu(OH)2 + NaOH HN C C ONa N N O Cu O C NH CN N ONa 2 24H O + phép xác ñịnh ñược nồng ñộ ñến vài µg protein, do vậy ñược sử dụng rộng rãi ñể xác ñịnh nhiều loại protein. Tuy nhiên nó có nhược ñiểm là màu của phức chất bị ảnh hưởng nếu trong dung dịch có một số chất như EDTA, ñệm Tris, sacarozơ hay một số chất khử như xistein, ditiotreitol… Phản ứng tạo biure Phản ứng tạo phức với Cu2+ Các gốc phản ứng với thuốc thử Folin – Ciocalteux H2N CH C H2C OH O OH H2N CH C CH2 OH O HN H2N CH C CH2 OH O N NH Tyrozin Tryptophan Histindin Lập ñường chuẩn protein với Albumin tinh khiết: Dùng pipet lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn Albumin có nồng ñộ chuẩn lần lượt là 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10, 0.15, 0.20 (mg/ml) vào các ống nghiệm sạch, khô. Thêm 5 ml dung dịch thuốc thử Biure, lắc ñều giữ ở nhiệt ñộ phòng trong 10 phút. Sau ñó thêm chính xác 41 0.5 ml dung dịch Folin – Ciocalteux nồng ñộ 1N, lắc ñều, sau 30 phút ñem so màu trên máy ở bước sóng 750 ηm. Từ kết qủa so màu, lập ñường chuẩn xác ñịnh nồng ñộ protein. Albumin có tỉ lệ các gốc tyrozin, tryptophan, hystidin phổ biến với nhiều protein khác tan dễ dàng trong nước ở pH = 7 nên ñược chọn làm ñường chuẩn. Phương trình ñường chuẩn y = 3.183x + 0.1135 Y là ñộ hấp thụ quang (ABS), x l