Đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tiêu

ật phân giải Photphat khó tan ở Việt Nam . I.3.1.1 Các loại phân lân vi sinh . Hiện nay trên thị trường phân lân vi sinh thường được chia làm hai nhóm sau: + Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng Quy trình sản xuất phân vi sinh trên nền chất mang thanh trùng được thể hiện thông qua sơ đồ 2. Các loại phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng có mật độ vi sinh vật hữu hiệu lớn từ 108- 10 9tế bào / gam, vi sinh vật tạp ít. Sử dụng phân bón vi sinh vật này để nhiễm vi sinh vật vào hạt, tưới vào gốc cây non. Hiệu quả của phân dựa trên năng suất và phẩm chất của nông sản [14]. Sơ đồ 2: Quy trình sản xuất phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng [14] Vi sinh vật phân giải lân Nhân sinh khối Xử lý tiềm sinh Đóng gói bảo quản, sử dụng Phối trộn Thanh trùng Than bùn, chất mang +Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng Phân lân vi sinh được sản xuất trên nền chất mang không thanh trùng có mật độ vi sinh vật hữu ích thấp chỉ khoảng 106-108 tế bào /gam và vi sinh vật tạp khá cao. Hiệu quả của phân bón dạng này thường dựa trên các chất dinh dưỡng có trong chất mang. Chất mang ở đây thường là các chất hữu cơ: than bùn, phế thải nông nghiệp, rác thải thành phố... và các chất vô cơ khó tiêu: Apatit, Photphorit, bột đá vôi... Các loại chất mang hữu cơ thường được ủ háo khí hay yếm khí tuỳ loại nguyên liệu hữu cơ.Nhược điểm của loại phân này là chất lượng không ổn định và khó bảo quản. I.3.1.2 Hiệu quả sử dụng các loại phân lân vi sinh vật. Hiệu quả của các loại phân lân vi sinh thường được đánh giá thông qua các chỉ tiêu sau: - Tăng cường cung cấp thêm lân dễ tiêu cho cây trồng - Tăng cường sức hoạt động của các loại vi sinh vật khác trong đất - Cung cấp các chất điều hoà sinh trưởng - Cung cấp các chất kháng sinh phòng chống sâu bệnh hại cây trồng Cho đến nay, tuy rằng phân vi sinh vật phân giải lân khó tiêu được sản xuất, bán trên thị trường nhưng số lượng không nhiều vì lý do sau: Hiệu quả của chúng chưa được ổn định, giá thành đắt, khó khăn về bảo quản và vận chuyển [14]. I.3.2 Yêu cầu về chất lượng, thời gian bảo quản phân lân vi sinh . Theo TCVN của Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn -Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam quy định tiêu chuẩn phân bón vi sinh vật phân giải Photphat như sau: - Thời gian bảo hành của phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan ít nhất là 6 tháng. - Mật độ vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan phải phù hợp với bảng 2. Bảng 2: Mật độ vi sinh vật sống có trong phân bón vi sinh vật Tên chỉ tiêu Mật độ vi sinh vật CFU/g hoặc ml mẫu Chất mang đã được thanh trùng Chất mang không thanh trùng Khi xuất xưởng Cuối hạn bảo hành Khi xuất xưởng Cuối hạn bảo hành 1. Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan không nhỏ hơn 1,0 x 109 1,0 x 108 1,0 x 107 1,0 x 106 2. Vi sinh vật tạp, không nhỏ hơn 1,0 x 106 1,0 x 108 - - Trong đó: CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc. Cho đến nay, có nhiều nhà sản xuất phân lân hữu cơ vi sinh như: Phân hữu cơ Thiên Nông, phân lân sinh hoá hữu cơ Komix của công ty hoá sinh nông nghiệp và thương mại Thiên Sinh, phân sinh hoá hữu cơ Biomix của công ty phân bón hoá chất Kiên Giang, Biofer của Hội Phân Bón Việt Nam ...đều sản xuất phân lân vi sinh nhưng số lượng không nhiều, hiệu quả chưa thật ổn định, giá thành đắt, khó khăn về bảo quản và vận chuyển hơn nữa không phải bón cho vùng đất nào cũng phù hợp và cho hiệu quả cao [14]. Mặt khác thành phần, số lượng , hoạt tính của các vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan trong các mẫu đất ở các vùng địa lý khác nhau cũng rất khác nhau [17]. Bởi vậy, việc tìm kiếm và bổ xung các vi sinh vật phân giải lân khó tan từ các vùng đất có khí hậu và điều kiện địa lý đặc thù, để đưa vào ứng dụng trong thực tế mà có hiệu quả là điều rất cần thiết, đòi hỏi các nhà nghiên cứu quan tâm và đầu tư. Chương II : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. II.1 Vật liệu và thiết bị: II.1.1 Vật liệu. II.1.1.1 Chủng vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất trồng ngô, lúa, đậu tương và đất vườn trên địa bàn Hà Nội. II.1.1.2 Giống cây trồng thí nghiệm đối với chủng vi sinh vật phân giải lân khó tiêu. Sử dụng giống đậu tương DT84 do bộ môn giống cây trồng Trường Đại học Nông Nghiệp cung cấp. II.1.2 Thiết bị thí nghiệm. Thiết bị được sử dụng của phòng các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật -Viện CNSH. Nồi khử trùng ướt (Trung Quốc) Nồi khử trùng khô (Trung Quốc) Máy đo pH Mettler Toledo -320 (Nhật) Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật) Máy lắc do Viện Khoa học Việt Nam chế tạo 220 vòng /phút Tủ ấm (Trung Quốc) Cân phân tích ADNHR- 200 (Nhật) Máy đo độ đục Novaspec II (Pharmacia- Thuỵ Điển) Và các dụng cụ khác phục vụ cho thí nghiệm: Micro pipet,ống nghiệm, bình tam giác, hộp Petri ... do Trung Quốc và Đức sản xuất. II.1.3 Hoá chất. Các hoá chất sử dụng đều tinh sạch ở mức độ phân tích, đạt tiêu chuẩn chất lượng trong nghiên cứu (P.A). Bao gồm : Ca3(PO4)2 ; các loại đường glucose, sacarose; cao nấm men, thạch , Pepton và các nguyên tố vi lượng: FeS04, MnS04.... do phòng “ các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật cung cấp”. II.2 Môi trường nuôi vi sinh vật phân giải Photphat. II.2.1 Môi trường Pikovskaya [27,6] (dùng phân lập giữ giống và nghiên cứu khả năng phân giải photphat của các chủng vi sinh vật). Thành phần: g/l. Glucoza................................ 10 Ca3(PO4)2.............................. 5 MgSO4................................. 0,1 KCl....................................... 0,2 FeSO4H2O ........................... vệt NaCl .................................... 0,2 MnSO4 ................................. vệt Yeast extract (cao nấm men) ..............0,5 Agar (thạch) ........................20 Nước máy.............................1000 ml. Khử trùng ở 0,8 atm / 30 phút. II. 2.2 Môi trường Pikovskay lỏng: dùng để nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phân giải lân khó tiêu. Thành phần: g/l. Glucoza................................10 Ca3(PO4)2..............................5 MgSO4..................................0,1 KCl.......................................0,2 FeSO4H2O............................vệt NaCl ....................................0,2 MnSO4.................................vệt Yeast extract (cao nấm men)..............0,5 Nước máy............................1000 ml Khử trùng ở 0,8 atm / 30 phút. II.2.3 Môi trường nước chiết đất. Cân 1.5kg đất (đất Cổ Nhuế ) +1000 ml nước máy, hoà đều rồi đem đun sôi trong 30- 40 phút . Để lắng rồi gạn ra và ly tâm bỏ cặn . Phân phối vào các bình tam giác và đem khử trùng ở 1 atm / 45 phút. II.3 Phương pháp nghiên cứu. II. 3.1 Phương pháp lấy mẫu. Dùng thìa vô trùng lấy đất ở vùng bề mặt ( độ sâu từ 2-5 cm ) cho vào bình tam giác, túi nilon sạch. Mỗi khu đất thường lấy từ 8-10 vị trí khác nhau,mỗi vị trí lấy từ 10-15g đất, buộc kín hoặc đậy nút và ghi lý lịch, ngày lấy mẫu. II.3.2 Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa [6]. Các mẫu đất lấy ở mỗi địa điểm khác nhau được trộn đều. Cân mỗi mẫu đất 10g cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng lắc thật đều. Sau đó pha loãng liên tục bằng nước vô trùng sao cho đạt đến độ pha loãng từ 101-107. Dùng Pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch từ ống nghiệm có độ pha loãng nhất định nhỏ lên bề mặt môi trường thạch đĩa. Thông thường ta lấy dịch ở độ pha loãng 102, 103, 105, và 107,. Dùng que trang thuỷ tinh dàn đều dịch vừa nhỏ lên bề mặt thạch sao cho bề mặt thạch thật khô. Các thao tác làm trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ Box để tránh nhiễm vi sinh vật. Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 25-30oC từ 3- 5 ngày vi sinh vật phát triển thành các khuẩn lạc có vòng phân giải Ca3(PO4)2 . Mỗi khuẩn lạc khác nhau về mặt hình thái được coi là một chủng vi sinh vật. Cấy truyền vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng, giữ ở tủ ấm 3- 5 ngày. Khi các chủng vi sinh vật đã phát triển dày kín mặt thạch ở trong ống nghiệm thì cất giống vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. II. 3.3 Phương pháp giữ giống [6 ]. Các chủng vi khuẩn có thể giữ ở 4- 5oC trong tủ lạnh khoảng 2- 3 tháng. Cấy truyền định kỳ trên các môi trường tương ứng, hai tháng một lần. II. 3.4 Phương pháp đếm số lượng tế bào Số lượng tế bào sống trong các cơ chất phân lập trên môi trường dinh dưỡng đặc, được biểu thị bằng đơn vị CFU (colony foming Unit) 1 CFU là 1 khuẩn lạc phát triển từ một tế bào (hay bào tử) lúc đầu , của một loại vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng trong đĩa thạch mà mắt thường ta quan sát được. Cách đếm: Tiến hành pha loãng như phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy một thời gian thích hợp (3- 5 ngày) ở 30oC trong tủ ấm, lấy ra đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong một đĩa Petri, từ đó tính ra số lượng tế bào trong 1g ( hay 1ml ) cơ chất theo công thức: N = a.b.c Trong đó : N: Tổng số CFU trong 1g (1ml) cơ chất đem phân tích a: Số CFU trung bình đếm được trên một đĩa Petri (số tế bào trên 0,1ml dịch mẫu phân tích ở độ pha loãng b) b: độ pha loãng c: Số lượngvi sinh vật trong 1ml dịch ở độ pha loãng b. Số khuẩn lạc trên đĩa Petri được coi là tốt để tính CFU nếu khi lấy 0,1ml dịch pha loãng mẫu trên môi trường có khoảng 5- 100 khuẩn lạc. Nếu số lượng này nhỏ hơn 5 thì kết quả loại bỏ. II. 3.5 Phương pháp xác định khả năng phân giải Ca3(PO4)2[12]. Cấy chấm điểm vi sinh vật đã phân lập được trên môi trường thạch đĩa Pikovskaya. Theo dõi khả năng hình thành vòng phân giải của các chủng vi sinh vật trong thời gian 3- 7 ngày. Vi sinh vật có hoạt tính phân giải sẽ tạo thành vòng tròn trong suốt xung quanh khuẩn lạc còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn. Hoạt tính phân giải được đánh giá bằng hiệu số D - d (mm) trong đó D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính của khuẩn lạc vi sinh vật. II. 3.6 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram và nhuộm đơn giản. II. 3.6.1 Phương pháp nhuộm đơn giản. - Mục đích: Quan sát đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn. Làm tiêu bản. Lấy phiến kính sạch, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ một giọt nước vô trùng lên phiến kính. Khử trùng que cấy. Dùng que cấy lấy ít vi khuẩn trong ống thạch nghiêng, đưa vào giọt nước trên phiến kính, giàn đều một lớp mỏng có diện tích 1- 2 cm2. Cố định vết bôi: Hơ nhẹ phía dưới vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành nhuộm: Nhuộm vết bôi bằng cách nhỏ vài giọt thuốc Safrarin giữ trong 1- 2 phút. Rửa nước. Làm khô tiêu bản. Đem quan sát bằng vật kính dầu. II. 3.6.2 Phương pháp nhuộm Gram. Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm đặc biệt do nhà khoa học Đan Mạch Chriatian Gram tìm ra năm 1884. Mục đích của phương pháp này là xác định được chủng là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-), để có thể phân biệt sự khác nhau giữa các loại vi khuẩn giống nhau về hình thái và kích thước. Phương pháp nhuộm Gram được tiến hành như sau: Làm vết bôi (giống như nhuộm đơn) Nhuộm bằng tím gential lên vết bôi giữ trong 1- 2 phút Nhỏ dung dịch lugol bằng cồn 95o trong 30-40 giây Rửa bằng nước máy, để khô Nhỏ fucsin lên vết bôi, giữ từ 1-2 phút Rửa nước, làm khô Quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu. Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt mầu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt mầu theo màu của thuốc nhuộm bổ sung (mầu đỏ hồng của fucsin) II.3.7 Phương pháp nhuộm bào tử của Miler. Mục đích: xác định được tế bào của chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử hay không. Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm bào tử của Miler. Làm vết bôi, cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ dung dịch axit HCl 1% (hoặc phenol 5%) trong 1-2 phút Rửa nước làm khô tiêu bản. Nhuộm fucsin ziel trong 1-2 phút. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi thấy bốc hơi. Để nguội, rửa sạch. Dùng cồn 33o hayH2SO4 tẩy mầu cho đến khi hầu như không còn mầu hồng đỏ nữa ( khoảng 1- 2 phút). Rửa nước, nhuộm lại bằng xanh Metylen - loeffler trong 1phút. Rửa nước, làm khô. Khi quan sát tế bào vi khuẩn sẽ nhuộm mầu xanh, còn bào tử bắt mầu hồng đỏ ( mầu của fucsin ziel ). II.3.8 Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn phân giải Photphat. II.3.8.1 ảnh hưởng của pH ban đầu Chủng vi khuẩn phân giải photphat được tuyển chọn, cấy vào bình tam giác chứa 100ml môi trường Pikovskaya đã được điều chỉnh các độ pH khác nhau: 4 ; 5 ; 6 ; 7 ; 8 . Nuôi cấy trên máy lắc ( 220 vòng/ phút ), nhiệt độ 30oc trong 60 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng bằng cách đo độ đục OD ở bước sóng 560 nm trên máy so màu. II.3.8.2 ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau. Sử dụng 1% các nguồn cacbon khác nhau là: sacaroza, rỉ đường và tinh bột để thay thế lần lượt cho glucoza trong 100ml dịch lỏng Pikovskaya . Nuôi trên máy lắc ( 220 vòng/ phút ) trong 60 giờ ở 30oc. Cứ sau 12 giờ lại đo OD một lần để xác định sinh khối. II. 3.8.3 ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau. Chủng vi khuẩn được tuyển chọn nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 100 ml môi trường Pikovskaya với 1% các nguồn nitơ khác nhau là: (NH4)2SO4, NaNO3, pepton, Ure.Nuôi cấy trên máy lắc (220 vòng/phút) trong 60 giờ. Cứ 12 giờ lại tiến hành đo OD một lần trên máy so màu ở bước sóng 560 nm. II. 3.8.4 ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau. Sử dụng môi trường lỏng Pikovskaya có pH = 7 . Sau đó cấy chủng vi khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ khác nhau từ 20- 40oC, mỗi thang cách nhau 5oC . Sau 60 giờ nuôi cấy xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng bằng cách đo đục OD ở bước sóng 560 nm trên máy so màu . II .3.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải lân đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương DT84 Chuẩn bị đất đất thanh trùng . Đất phù sa được đem phơi khô, đập nhỏ, thanh trùng ở 1.2atm trong 1.5 giờ Sử dụng giống đậu tương DT84 ngâm trong H2O2 3 % trong 3phút. Sau đó rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Mục đích là nhằm loại bỏ hết các vi sinh vật tạp nhiễm như: Nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn có trong hạt đậu tương, đảm bảo tính vô trùng, hiệu quả chất lượng cao của hạt đậu tương trước khi gieo.Tiến hành ủ hạt đậu tương như sau : Cho hạt vào hộp Petri đặt lên trên tấm giấy lọc, khi hạt nảy mầm đem đi gieo vào các bình đối chứng không phân , đối chứng có phân ( Bình đối chứng là bình đã loại bỏ hết vi sinh vật ) và đất đã nhiễm vi sinh vật phân giải lân (Bình thí nghiệm) mỗi bình gieo khoảng 30 hạt đậu tương. Theo dõi sự nảy mầm,sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Công thức bón phân cho hạt đậu tương. Phân được bón vào các thời điểm như sau: Bón lót trước khi gieo, bón lần một khi đậu tương được 6-8 ngày, bón lần 2 khi đậu tương được 15-17 ngày, tỷ lệ N: P: K là 180 kgN : 120 kg P205 : 100 kgK/ha . Các vi khuẩn được nhiễm vào hạt đậu tương đạt 10 8 tế bào / gam đất. Chăm sóc và theo dõi thí nghiệm . Để đảm bảo độ ẩm thích hợp cho cây đậu tương , hàng ngày tưới bằng nước vô trùng (với các bình đối trứng) và bằng nước máy đối với bình lây nhiễm vi sinh vật ( bình thí nghiệm). Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương thông qua các chỉ tiêu : Tỷ lệ nảy mầm , chiều cao thân lá của chúng .... Xác định số hạt nảy mầm, số cây sống sót ở các mẫu [9]: + Theo dõi hạt nảy mầm như : Hạt nảy mầm sau bao nhiêu ngày , phần trăm (%) hạt nảy mầm tính như sau : số hạt nảy mầm % Hạt nảy mầm = x 100 Tổng số hạt đem gieo + Theo dõi tình trạng cây non , cây khoẻ hay mắc bệnh, đo chiều cao thân lá của cây non sau các ngày gieo ( chiều cao của cây lấy giá trị trung bình của 3 lần đo ) . Chương III: Kết quả và thảo luận III. 1. Phân lập các chủng có khả năng chuyển hoá photphat: Từ các mẫu đất trồng ngô, đậu tương, trồng lúa và đất vườn ở Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Từ Liêm, Cổ Nhuế ... Chúng tôi tiến hành phân lập nhằm tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hoá các hợp chất photphat khó tan trên môi trường Pikovskaya. Các mẫu đất được pha loãng trong nước vô trùng ở các độ pha loãng 10-2-10-7. Sau đó được cấy gạt trên bề mặt thạch đĩa. Để tủ ấm 25 - 30oC sau 48 giờ quan sát khuẩn lạc. Chọn chủng có vòng phân giải Ca3(PO4)2 cấy truyền vào ống nghiệm . Sau đó tiếp tục tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường chứa Ca3(PO4)2 và xác định hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2trên môi trường lỏng. Kết quả tuyển chọn được thể hiện qua bảng 3 và ảnh 1. Bảng 3: kết quả phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải photphat khó tan. Số tt Ký hiệu Đặc điểm khuẩn lạc Ghi chú (vk, xk, mốc) 1 DT1 Tròn, hơi bóng, bề mặt hơi gồ ghề VK 2 DT2 Chấm tròn, hơi nhẵn, lan theo bề mặt thạch VK 3 DT3 Trắng, lồi, nhẵn, nhầy và lớn VK 4 DT4 Trắng, hơi lồi, bóng VK 5 DT5 Chấm tròn nhỏ và bóng VK 6 TL1 Khuẩn lạc tròn mép bằng phẳng nhầy trắng VK 7 TL2 Khuẩn lạc tròn, khô ở giữa có điểm đồng tâm VK 8 TL3 Khuẩn lạc hơi gồ ghề, trắng sau chuyển sang vàng VK 9 TL4 Khuẩn lạc tròn, nhẵn, mép bằng phẳng VK 10 TL5 Khuẩn lạc tròn, trong suốt, mép bằng phẳng VK 11 CN1 Hơi lồi, trắng trong lan theo bề mặt thạch VK 12 CN2 Trắng, lồi, bóng, hơi nhầy VK 13 CN3 Khuẩn lạc dạng chấm tròn bóng VK 14 DV1 Chấm tròn, lồi bóng, và nhầy VK 15 DV2 Bóng hơi lồi, lan theo bề mặt thạch VK 16 DV3 Nhăn, bề mặt không nhẵn có màu hơi vàng VK 17 DV4 Gồ gề không phẳng và nhỏ VK 18 DV5 Lồi bóng nhẵn và trong VK 19 DV6 Trắng đục không phẳng VK 20 DV7 Hơi nhẵn nhỏ li ti, trắng đục VK 21 DV8 Bóng hơi lồi lan theo thạch VK 22 DV9 Chấm tròn, bóng nhầy, hơi lồi, trắng đục đ nâu VK 23 DV10 Gồ ghề hình răng cưa và nhỏ VK ảnh 1: Kết quả phân lập vi sinh vật phân giải Photphat ở mẫu đất vườn Hà Nội III.2 Lựa chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2 cao Từ 4 mẫu đất trên, đã phân lập được 23 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải Ca3(PO4)2. Chúng tôi tiến hành lựa chọn các chủng có khả năng phân giải Photphat mạnh , nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 300c trong 60 giờ sau đó đo đường kính vòng phân giải lân xung quanh khuẩn lạc. Đã chọn được 4 chủng sau có hoạt lực phân giải Photpho mạnh . Kết quả trình bày trên bảng 4 , trong đó chủng DV9 có hoạt lực mạnh nhất. Bảng 4: các chủng có hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2 cao. TT Ký hiệu Đường kính vòng phân giải (D-d) mm 1 DT3 9 2 DV9 124 14 3 DV5 5,547 4 DV1 849 Chúng tôi đã chọn chủng DV9 chủng có hoạt lực mạnh nhất để nghiên cứu kỹ hơn . Khả năng phân giải Ca3(PO4)2 của chủng DV9 được thể hiện qua ảnh 2. ảnh 2: Khả năng phân giải Ca3(PO4)2của chủng vi khuẩn DV9. III. 3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn DV9. Chủng DV9 là vi khuẩn . Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5. Bảng 5: Đặc điểm hình thái của chủng DV9. Khả năng di động Nhuộm Gram Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc Có khả năng di động Gram ( - ) Tế bào có dạng trực khuẩn, thường xếp thành đôi, có bào tử Khuẩn lạc dạng chấm tròn, bóng nhầy hơi lồi,màu trắng đục sau ngả sang màu nâu Như vậy chủng DV9 là vi khuẩn Gram âm (-) thể hiện qua ảnh 3. ảnh 3: Tế bào vi khuẩn DV9ở độ phóng đại 1800 lần. II. 4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy chủng DV9 . III. 4. 1. ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau lên khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng DV9 Nhiệt độ là một trong những yếu tố môi trường ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển cũng như hoạt động sống của vi sinh vật. Nhiệt độ trong đất ở mỗi khu hệ sinh thái là khác nhau và phụ thuộc vào mùa, chính vì thế mà khi bổ xung vi sinh vật vào đất chúng ta cần quan tâm xem chúng tồn tại tốt nhất ở dải nhiệt độ nào? Chủng DV9 được cấy trong các ống nghiệm chứa môi trường lỏng Pikovskaya vô trùng có pH =7 và để ở các thang nhiệt độ khác nhau từ 20oC - 40oC mỗi thang cách nhau 5oC. Sau 60 giờ nuôi cấy xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng bằng cách đo độ đục OD ở bước sóng 560 nm trên máy so màu Kết quả được thể hiện qua bảng 6 và hình 1 Bảng 6: ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng DV9 Nhiệt độ Sinh khối vi khuẩn 12 Giờ 24 Giờ 36 Giờ 48 Giờ 60 Giờ 20 0.623 0.816 0.912 0.714 0.559 25 0.773 0.916 0.995 0.817 0.613 30 0.856 1.023 1.248 0.963 0.651 35 0.531 0.714 0.883 0.602 0.413 40 0.417 0.612 0.771 0.628 0.402... Qua bảng trên ta thấy chủng vi khuẩn DV9 sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 20-35oC trong đó nhiệt độ tối ưu là 300c ( hình 1 ) III. 4. 2. ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng phát triển của chủng DV9. pH là một nhân tố quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu, nhằm xác định dải pH thích hợp cho chủng vi khuẩn DV9 sinh trưởng và phát triển tốt. Chủng DV9 được nuôi trong các bình tam giác có chứa 100ml môi trường Pikovskaya lỏng. pH môi trường ban đầu được điều chỉnh từ 4 - 8, cách nhau mỗi khoảng là 1. Máy lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong 60giờ. Cứ 12 giờ đo OD một lần. Kết quả thu được trình bày qua bảng 7 và hình 2. Bảng 7: ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng DV9. PH ban đầu Sinh khối vi khuẩn 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 4 0.539 0.612 0.662 0.602 0.581 5 0.875 1.025 1.414 1.129 1.067 6 1.471 1.487 1.501 1.392 1.321 7 1.456 1.767 1.827 1.793 1.687 8 0.795 0.893 0.928 0.931 0.927 Kết quả trình bày trên bảng 7 cho thấy, với môi trường axit hoặc môi trường kiềm thì sự phát triển của chủng DV9 kém hơn môi trường trung tính pH=7. Tuy nhiên, ở môi trường axit nhẹ chủng DV9 lại phát triển mạnh hơn so với môi trường kiềm. Như vậy, khả năng thích ứng của chủng này là tương đối rộng trong khoảng pH từ 5 - 8. Kết quả thí nghiệm của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của hai nhà khoa học Lê Văn Căn và Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu và nhận thấy vi khuẩn phân giải hợp chất photphat khó tan hoạt động trong một phạm vi pH khá rộng. Như vậy, pH thích hợp nhất cho việc sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn phân giải lân DV9 là pH=7. Chúng tôi đã tuyển chọn để tiếp tục cho các thí nghiệm sau. III. 4. 3. ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởngvà phát triển của chủng vi khuẩn DV9 Khả năng sử dụng các nguồn cacbon đa dạng cho phép vi sinh vật tồn tại dễ dàng trong tự nhiên, đó cũng là tiêu chuẩn rất quan trọng dùng tuyển chọn các chủng vi sinh vật để ứng dụng trong sản xuất. Vì vậy, chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn DV9. Chủng này được nuôi cấy trong môi trường Pikovskaya lỏng chứa 1% sacaroza, rỉ đường, tinh bột lần lượt thay thế glucose . Sau 60 giờ xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng DV9 bằng cách đo độ đục OD trên máy so màu . Kết quả được trình bày ở bảng 8 và hình 3. Bảng 8: ảnh hưởng của nguồn các bon lên khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng DV9. Số TT Nguồn cacbon Sinh khối vi khuẩn 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 1 Glucoza 1.414 1.932 2.017 1.928 1.692 2 Sacaroza 1.553 1.617 1.700 1.625 1.545 3 Rỉ đường 1.787 1.825 1.886 1.814 1.743 4 Tinh bột 0.815 1.750 1.771 1.685 1.626 Kết quả trình bày ở bảng 8 cho thấy, rỉ đường là nguồn cacbon số 2 sau glucoza mà chủng DV9 sử dụng tốt. Nhìn chung , chúng dễ đồng hoá nguồn cacbon mà ta đưa vào để nghiên cứu . Nguồn cacbon có giá trị cao nhất chính là glucoza , đây là nguồn cacbon dễ đồng hoá nhất cho tất cả các loại vi sinh vật nói chung và chủng vi khuẩn phân giải hợp chất photphat nói riêng.Tuy nhiên, để dùng trong sản xuất dùng rỉ đường có thể tận dụng một nguồn phụ phẩm trong công nghiệp mía đường và giá thành rẻ hơn . Trong rỉ đường, ngoài đường còn có nhiều Vitamin , các nguyên tố cần thiết khác cho vi khuẩn cũng như cây trồng . III. 4. 4 ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng DV9. Giống như nhiệt độ, pH và nguồn cacbon, nitơ là một nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, việc tìm ra nguồn nitơ thích hợp cho chủng DV9 sinh trưởng và phát triển là điều rất cần thiết, giúp cho quá trình chuyển hoá các hợp chất phospho khó tan thành dạng dễ tan một cách tốt hơn. Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng trên máy lắc (220 vòng/phút) ở 30oC trong 100 ml dịch môi trường Pikovskaya lỏng có bổ sung 1% các nguồn nitơ sau: NaNO3, (NH4)2SO4, pepton và ure. Sau 60 giờ xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng bằng cách đo độ đục OD trên máy so màu . Kết quả thu được trình bày ở bảng 9 và hình 4: Bảng 9: ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng DV9. Số TT Nguồn Nitơ Sinh khối vi khuẩn 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 1 NaNO3 1.497 1.764 1.817 1.919 1.723 2 (NH4)2SO4 1.563 1.713 1.750 1.744 1.403 3 Pepton 1.502 2.046 2.376 2.247 1.890 4 Ure 1.547 1.824 1.875 1.821 1.795 Kết quả cho thấy với các nguồn nitơ khác nhau vi khuẩn DV9 đều có thể sử dụng và phát triển tốt. Tuy nhiên qua bảng 9 ta thấy rằng chủng DV9 sử dụ