Đề tài Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn từ vỏ củ hành tây

ng cay làm chảy nước mắt và mùi hôi, gây nên những hương vị đặc trưng của hành [23]. γ-glutamyl peptide: cho đến nay tổng cộng 14 γ-glutamyl peptide đã được xác định trong hành và 9 trong số đó có chứa nguyên tử lưu huỳnh (Bảng 1.3). Bảng 1.3. γ-Glutamyl peptides trong A.cepa L. γ-Glutamyl peptides γ-Glutamyl peptides chứa sulphur γ-Glutamyl-valine γ-Glutamyl-methionine γ-Glutamyl-isoleucine γ-Glutamyl-S-methyl-L-cysteine γ-Glutamyl-leucine γ-Glutamyl-S-methyl-L-cysteine sulphoxide γ-Glutamyl-phenylalanine γ-Glutamyl-S-trans-(1-propenyl)-L-cysteine sulphoxide γ-Glutamyl-thyrosine γ-Glutamyl-S-(2-carboxypropyl)-cysteinylglycine Glutathione Glutathione-γ-glutamyl-cysteine-disulphide Glutathione-cysteine-disulphide S-Sulphoglutathione γ-glutamyl peptide xuất hiện chủ yếu ở hạt giống không hoạt động và củ hành khô, đóng góp vào sự nảy mầm của hạt giống và có vai trò như một chất dự trữ. (+)-S-Alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides liên kết với chuỗi axit amin γ-glutamyl không được chuyển hóa bởi alliinase. Sau khi phân cắt bởi peptidases và transpeptidases, alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides tự do tạo chất dễ bay hơi trong chiết xuất củ hành. Khoảng 90% hợp chất lưu huỳnh hữu cơ tan được tồn tại ở dạng γ-glutamyl peptide, các hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong chất lượng hương vị của hành tây và hoạt tính dược lực thành phần chiết xuất từ củ hành [20], [23]. 1.2.2.2. Saponin: Các saponin được tìm thấy trong hành tây là: sitosterol, oleanolic acid vàmột ít amyrin [13]. Các chất này đã được phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 1982. Trong đó sitosterol có cấu trúc thuộc nhóm steroid còn oleanolic acid và amyrin có cấu trúc triterpenoid. Gần đây năm 2004, các nhà khoa học đã làn đầu tiên phân lập được 4 saponin trong hành tây đều có cấu trúc ruscogenin là: [14] (25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabino pyranoside (I) (25R)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside (II) (25R)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (III) (25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (IV) Ngoài ra, hành tây còn có các loại sapogenin khác là diosgenin và cepagenin. Sitosterol Oleanolic acid 1.2.2.3. Flavonoid: Flavonoid chủ yếu trong hành tây là dẫn chất của quercetin: isoquercetin, quercetin diglucoside, quercetin monoglucoside và quercetin tự do. Hành tây còn chứa kaempferol nhưng hàm lượng rất ít. Quercetin monoglucoside và quercetin diglucoside là flavonoid chính chiếm 80% các chất có chứa quercetin. Tỷ lệ quercetin monoglucoside và quercetin diglucoside là 1:2,2 [22]. Kaempferol Isorhamnetin Các nhà khoa học Italia đã dùng phương pháp HPLC để tách và xác định hàm lượng các flavonoid khác nhau trong 12 giống hành với các màu vỏ khác nhau. Nhận thấy ngoài các dẫn chất của quercetin và kaempferol còn có isorhamnetin (3-methylquercetin) và Isorhamnetin monoglycoside. Dấu vết của kaempferol chỉ được tìm thấy ở giống White Hawk [13]. Bảng 1.4. Các thành phần flavonoid trong Hành tây (mg/kg) Cultivar Quercetin Quercetin monoglyc Quercetin diglyc Rutin Isorhamnetin Isorham. monoglyc. Tổng flavonoid Hành vàng Festival 55,9 374,0 43,1 1,8 3,8 47,2 525,8 Tamara 66,5 460,0 37,9 4,7 2,7 45,1 616,9 Daytona 111,7 713,4 41,3 5,7 6,5 54,2 932,8 Dorata Density 95,4 725,2 73,3 13,6 5,9 65,7 979,1 Castillo 65,0 610,9 50,6 9,0 n.d. 50,7 786,2 Santana 92,3 547,3 49,2 6,3 6,5 48,2 749,8 Trung bình 81,1 571,8 49,2 6,9 5,1 51,9 765,8 Hành đỏ Tropea rossa 557,8 125,9 11,4 1,8 50,4 15,6 762,9 Rossa Lilia 57,5 352,1 32,6 2,7 3,7 38,3 486,9 Redwing 76,6 418,6 30,4 1,7 6,3 48,1 581,7 Trung bình 230,6 298,9 24,8 2,1 20,1 34,0 610,5 Hành trắng Gladstone 0,7 0,8 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,5 Southport 0,7 2,0 n.d. n.d. n.d. tr. 2,7 White Hawk 0,6 0,6 tr. n.d. tr. n.d. 1,2 Trung bình 0,7 1,1 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,8 n.d.= not detected (không phát hiện) tr.=trace(<0,5) (phát hiện vết) Theo đó, hành vàng và hành đỏ chứa lượng flavonoid nhiều hơn dáng kể so với giống hành trắng. Đây cũng là cơ sở để chọn hành vàng và hành trắng trong chiết xuất quercetin. 1.2.2.4. Các thành phần khác:[30] Trong 100g hành tây có chứa các chất sau: nước 88g, protid 1,8g, glucid 8,3g, chất xơ 0,1g, tro 0,8g; các chất khoáng vi lượng: Ca 38mg, P 58mg, Fe 0,8 mg; các vitamin: B1 0,03mg, B2 0,04mg, PP 0,02mg, C 10mg, caroten 0,03mg. Ngoài ra còn có các nguyên tố: Na, K, S, Si; acid acetic tinh dầu bay hơi, glucokinin, oxydase và diatase… Trong hành tây có chất kháng sinh rất mạnh là phytoncid, khi nhai hành tây trong miệng từ 1-2 phút miệng trở nên rất sạch. 1.2.3. Tác dụng và công dụng: 1.2.3.1. Hành tây trong y học cổ truyền: Allium cepa L. đã được trồng và sử dụng hơn 6000 năm qua. Con người đã phát hiện tính chất dược lý của hành tây và sử dụng nó trong y cổ truyền điều trị nhiều rối loạn lớn nhỏ khác nhau [6]. Nước ép hành tây tươi thường được dùng trong y học dân gian của nhiều quốc khác nhau để giảm đau và sưng do ong hay ong bắp cày đốt, có các phản ứng dị ứng trên da. Các tài liệu cổ Ai Cập đề cập đến hành tây có tác dụng chống nhiễm giun, tiêu chảy, các bệnh nhiễm trùng và viêm nhiễm khác [10]. Trong thời trung cổ châu Âu, hành tây đã được sử dụng không thành công để tránh bệnh dịch hạch [29]. Tại Bắc Mỹ, thổ dân châu Mỹ sử dụng hành tây để điều trị côn trùng cắn và làm giảm cảm lạnh. Nó cũng được dùng trong y học cổ truyền Trung Quốc. Homeopaths dùng dịch chiết cồn của hành tây để điều trị một loạt các bệnh bao gồm ho, cảm lạnh, tiêu chảy, liệt mặt, sốt, thoát vị, viêm thanh quản, viêm phổi, và chấn thương [29]. Ở Việt Nam, hành tây được dùng chữa ho, trừ đờm, ra mồ hôi, lợi tiểu, chữa chứng bụng nước do gan cứng, đắp mụn nhọt, phòng chữa các chứng huyết áp cao, táo bón, giảm mỡ trong máu, kéo dài thời gian đông máu nên được dùng phòng ngừa bệnh động mạch vành và chứng xơ cứng động mạch, chống thấp khớp, chống bệnh hoại huyết, sát khuẩn và chống nhiễm khuẩn, gây tiết mồ hôi, trị ho, làm dễ tiêu hoá, cân bằng tuyến, chống xơ cứng, chống chứng huyết khối, kích dục, chống đái đường, trị giun, gây ngủ nhẹ, trị bệnh ngoài da và hệ lông. Được dùng ngoài để làm dịu và tan sưng, sát khuẩn, chống đau, xua muỗi [31]. Có nhiều bài thuốc từ hành tây trong y học cổ truyền đã khiến một số nhà khoa học ở những năm 20 của thế kỷ trước nghiên cứu dịch chiết từ hành tây hoặc dầu hành trong việc ức chế sự phát triển của giun đường ruột, nấm và vi khuẩn cả in vivo và in vitro. Các cơ chế tác dụng không được biết đến. Mặc khác, các kỹ thuật sử dụng để chiết xuất và bảo quản rất khác nhau trong các nghiên cứu khác nhau. Vì vậy, liều lượng hoặc nồng độ sử dụng là không thể so sánh [6]. 1.2.3.2. Tác dụng dược lý của hành tây theo y học hiện đại: A.cepa L. không được quan tâm nhiều như tỏi (A. sativum L.) - một loài có quan hệ họ hàng. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu đã được thực hiện chứng tỏ hành tây và dịch chiết của nó có tác dụng trêm tim mạch. Tinh dầu hành ức chế tổng hợp acid arachidonic, ức chế kết tập tiểu cầu in vitro và in vivo. Một phần tác dụng này là do tinh dầu hành ức chế sinh tổng hợp thromboxane. Ngoài ra, tinh dầu hành và hành tươi gia tăng sự phân huỷ fibrin in vivo ở thỏ và người tình nguyện. Hành tây không những có ích cho tim mạch mà còn có lợi trong các bệnh về chuyển hoá như tiểu đường hoặc tăng lipid huyết. Trong bệnh tiểu đường, hành tây giảm bớt sự cần thiết phải sử dụng thuốc hạ đường huyết bằng đường uống. Ở bệnh nhân tăng lipid máu, hành tây ngăn chặn sự gia tăng cholesterol và triglycerides trong huyết tương. Tuy nhiên, cơ chế của các tác động trên vẫn chưa được biết một cách chính xác [27]. Hành tây có chứa thiosulphinate, một hợp chất có hiệu quả trong việc tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn thông thường, bao gồm cả Salmonella typhi, Pseudomonas aeriginosa, và Escherichia coli [29]. Một số nghiên cứu in vitro và động vật cho thấy tinh dầu hành tây có thể ngăn chặn sự phát triển của khối u. Mặc dù những kết quả không áp dụng trên người, nhưng trong một nghiên cứu năm 1989 được thực hiện tại Trung Quốc, những người ăn một lượng lớn các loại rau trong chi Allium giảm đáng kể tỷ lệ bệnh ung thư dạ dày. Hành tây còn có chứa chứa chất chống oxy hóa là những hợp chất bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do giúp chống lại một số bệnh thoái hóa [29]. 1.2.3.3. Công dụng và cách dùng: [30] Hành tây là loại rau được sử dụng phổ biến ở châu Âu trong bữa ăn hàng ngày. Ở nước ta, Hành tây cũng thường được sử dụng để xào với các loại thịt, dùng chế dầu giấm và để ăn sống rất được ưa chuộng. Để làm thuốc, Hành tây được chỉ dẫn dùng trong để trị mệt mỏi, suy nhược cơ thể và thần kinh, chứng ít nước tiểu; bí dịch, thuỷ thũng, thừa urê huyết, tăng chlorur huyết, lên men ruột, đau sinh dục tiết niệu, đau ngực, cúm, mất trương lực tiêu hoá, mất cân bằng tuyến, béo phì, xơ cứng động mạch, đề phòng chứng huyết khối, đề phòng sự già yếu, mệt lả, bất lực, đái đường, viêm hạch, tạng bạch huyết, ký sinh đường ruột. Dùng ngoài để trị áp xe, chín mé, nhọt, ong vò vẽ đốt, cước nứt nẻ, đau nửa đầu, sung huyết não, đau dây thần kinh răng, mụn cóc, vết thương, loét và trừ muỗi. Cách dùng: Thông thường nhất là ăn sống, cũng có thể ngâm trong nước nóng (trị cảm cúm) hoặc đun sôi 10-15 phút (trị ỉa chảy, thấp khớp) hoặc ngâm độ một tuần trong rượu trắng (trị vật ký sinh đường ruột). Người ta còn làm thuốc (ngâm Hành tây trong cồn 90 độ), làm rượu thuốc 20%. Dùng ngoài dưới dạng thuốc đắp trị thấp khớp, đau đầu, sung huyết não, viêm màng não, bí tiểu tiện, rệp đốt, mụn nhọt, áp xe, trị nứt nẻ, vết thương v. v.., thuốc xoa (trị chín mé, tàn nhang), dịch chiết (nhỏ trị ù tai, tẩm bông đặt vào răng sâu) hoặc cắt đôi củ Hành đặt cạnh giường ngủ để xua muỗi. 1.2.3.4. Một số chế phẩm hiện đại từ Hành tây: Kem xoá sẹo Mederma [32] Kem xoá sẹo Mederma của Merzco, Đức được chiết xuất từ Allium cepa, là loại thuốc kích thích tế bào da tái tạo lại hoàn chỉnh, tạo cho da mịn và có sức sống. Cách sử dụng: vết thương sau khi đã lành thoa mỗi ngày 3-4 lần .tùy vào vết sẹo mới cũ và quá trình sản sinh tế bào da nhanh chậm của từng người. Hình 1.5. Chế phẩm Maderma Viên nén Allium Cepa [33] Viên nén Allium Cepa 6C của Weleda, USA trị cảm, ho, mất ngủ. Cách sử dụng: 1-2 viên ngậm dưới lưỡi. Hình 1.6. Chế phẩm Allium capa 6C 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUERCETIN: [28] Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one Quercetin Tên khác: Sophoretin, Meletin, Quercetine, Xanthaurine, Quercetol, Quercitin,Quertine. Flavin meletin Công thức phân tử: C15H10O7 Khối lượng mol: 302,236 g/mol Tỷ trọng: 1,799 g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: 316 °C 1.3.1. Khái quát: Quercetin là một flavonol chủ yếu trong hơn 4.000 flavonoids (chất chống oxy hóa) được tìm thấy trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật chẳng hạn như rượu vang đỏ, hành, trà xanh, táo, quả mọng, và rau Brassica (bắp cải, bông cải xanh, súp lơ, củ cải). Quercetin và Rutin (một flavonol khác) được sử dụng ở nhiều nước trong các bệnh tim mạch (bảo vệ mạch máu) và là thành phần của nhiều chế phẩm đa sinh tố và các thuốc từ thảo dược. Quercetin chủ yếu ở dạng glycosides, có nghĩa là chúng được kết nối với đường khác nhau. Tuy nhiên, khả năng cơ thể hấp thụ các hợp chất này chưa rõ ràng. Quercetin và flavonols khác có nhiều tác dụng sinh học, nhưng các bằng chứng khoa học cho việc sử dụng quercetin trong phòng ngừa hoặc điều trị bệnh là không chắc chắn. Quercetin đã được coi là một liệu pháp cho bệnh tim mạch, cholesterol cao, đục thủy tinh thể bệnh tiểu đường, viêm nhiễm, tổn thương thiếu máu cục bộ, viêm tuyến tiền liệt mạn tính, suy tĩnh mạch mạn tính, viêm loét đường tiêu hóa, viêm gan, dị ứng, hen suyễn, nhiễm virus, và cảm mạo. Các tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu về sự kết hợp của quercetin với việc giảm nguy cơ bệnh tim mạch vành và đột quỵ cao huyết áp, ung thư. Tuy nhiên, thiếu bằng chứng thuyết phục chứng minh các thông tin trên. 1.3.2. Tác dụng trên một số bệnh: Các nghiên cứu đã được thử nghiệm ở người hoặc động vật. Tính an toàn và hiệu quả không phải luôn luôn được chứng minh. Bệnh tim mạch Một số tác dụng của flavonoid đã được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trên động vật cho thấy chúng hiệu quả trong việc giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Các nghiên cứu ở người bằng cách sử dụng các hợp chất polyphenolic từ nho đỏ cho thấy cải thiện chức năng nội mạc ở bệnh nhân có bệnh tim mạch vành. Cao huyết áp Các nghiên cứu báo cáo rằng quercetin có liên quan với giảm nguy cơ bệnh mạch vành và đột quỵ. Quercetin hỗ trợ làm giảm huyết áp ở động vật gặm nhắm và người cao huyết áp. Phòng ung thư tuyến tụy Một số nghiên cứu cho thấy rằng quercetin có thể giúp ngăn ngừa ung thư tuyến tụy ở những người hút thuốc. Tuy nhiên, quercetin đã không có hiệu ứng này ở người không hút thuốc hay hút thuốc lá trước đây. Cần nghiên cứu thêm để xác định xem quercetin có lợi hay không. Viêm tuyến tiền liệt / hội chứng đau vùng chậu mãn tính Có một số bằng chứng cho thấy quercetin có thể hữu ích cho việc điều trị viêm tuyến tiền liệt mãn tính và hội chứng đau mãn tính vùng chậu. Nghiên cứu thêm là cần thiết để xác nhận các kết quả này. 1.3.3. Tính an toàn: Dị ứng Tránh sử dụng ở những người bị dị ứng hoặc quá mẫn cảm với quercetin do ăn hoặc tiếp xúc với da. Có thể gây kích ứng đường hô hấp, mắt, da, đường tiêu hóa. Phản ứng phụ Là một thành phần phổ biến trong thực phẩm, quercetin nói chung là an toàn và dung nạp tốt ở chế độ ăn uống bình thường. Tuy nhiên nó được xem là có liên hệ với đau đầu, rối loạn tiêu hóa, tụ máu, và độc tính trên thận. Tiêm tĩnh mạch có liên quan với cơn đau và nồng độ quercetin có thể được kiểm soát bằng cách giảm tốc độ tiêm. Quercetin tiêm tĩnh mạch cũng dẫn đến đổ mồ hôi, bốc hỏa, khó thở, buồn nôn, ngứa nhẹ của các chi, thờ ơ, và ói mửa. Cần quan tâm hiệu ứng thúc đẩy khối u phát triển có thể có của quercetin. Táo bón nhẹ và tóc mỏng đi đã được báo cáo hai trường hợp trong số 260 bệnh nhân dùng AS195, chứa chiết xuất lá nho đỏ có chứa nhiều quercetin. 1.3.4. Liêu dùng: Người lớn (trên 18 tuổi) Quercetin cần được uống 20 phút trước bữa ăn. Liều 100-500 mg quercetin 2-3 lần / ngày. Các dạng bào chế có thể là: viên nén, viên nang cứng hoặc nang mềm. Có thể tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp với các chế phẩm phù hợp. Trẻ em (dưới 18 tuổi) Không đủ bằng chứng để khuyến cáo liều dùng. CHƯƠNG 2 - PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. CHIẾT XUẤT QUERCETIN BẰNG CARBON DIOXIDE SIÊU TỚI HẠN: [11] Phương pháp này được thực hiện tại đại học bang Michigan của Mỹ năm 2003, sử dụng CO2 làm chất lỏng siêu tới hạn. 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn: - Carbon dioxide công nghiệp (CO2, BOC gases, Murray Hill, NJ) đượcsử dụng như một chất lỏng siêu tới hạn (SF). - Hành đỏ và hành vàng được lấy từ các trang trại Muck (Đại học bang Michigan, East Lansing, MI). Để bảo vệ nguyên liệu trong giai đoạn nghiên cứu hành được lưu trữ tại – 20oC. - Ethyl alcohol mua từ Pharmco (Brookfield, CT). - Phosphoric acid 86,3% cung cấp bởi J.T. Baker (Phillisburg, NJ). - Quercetin chuẩn được cung cấp bởi Sigma (St Louis, MO). 2.1.2. Trang thiết bị: Quá trình chiết xuất được thực hiện ở một bình thép không gỉ 500 mL (10) chịu được áp suất cao (Autoclave Engineers, Erie, PA). Bình chiết được bao bọc, gia nhiệt và cách ly bằng giấy bạc để duy trì nhiệt độ không đổi. Nhiệt độ này được theo dõi và kiểm soát với một cặp nhiệt điện và bộ điều khiển nhiệt độ (Omega Engineering, Stamford, CT). Carbon dioxide từ bình chứa hình trụ (1) được nén bằng máy nén cao áp (2, Haskel Inc, Burbank, CA) và được lưu trữ trong một bình chứa 2 L (3). Máy đo áp suất (4, 7) sử dụng để theo dõi áp suất trong bình chứa carbon dioxide và van bình chiết. Một máy tạo áp suất về phái trước (6, Tescom Corp., Elk River, MN), vị trí giữa bình chứa carbon dioxide và van bình chiết, kiểm soát áp lực chiết xuất. Dòng khí được theo dõi bằng cách sử dụng một đồng hồ đo (13, American Dry Test Meter Model DTM-200A-3, American Meter Co., Philadelphia, PA). Hai van ngắt (5, 10, Autoclave Engineers, Erie, PA) được sử dụng để hỗ trợ trong điều áp và giảm áp hệ thống. Một bơm piston (8, Model 305, Gilson, Middletown, WI) được sử dụng để tuần hoàn khí CO2 thoát ra vào bình chiết xuất. Tại van micrometering (11, Autoclave Engineers, Erie, PA), áp suất được giảm xuống, dịch chiết sau đó được tách khí và thu vào trong một ống thủy tinh (12). Cái khay bao gồm những lọ thủy tinh (3,7 mL) chèn vào trong một ống thủy tinh, bao quanh bởi nước đá khô. Các ống thuỷ tinh được giữ ở nhiệt độ đủ để CO2 bay hơi và thu được quercetin thô. Hình 2.1. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon Dioxide siêu tới hạn. Chú thích: 1. Bình chứa CO2 2. Máy nén cao áp 3. Bình chứa khí nén 4,7 Máy đo áp suất 5,10 Điều khiển áp suất phía trước 8. Piston bơm, 9. Hệ thống cung cấp nhiệt 11. Van micrometering 12. Nơi thu mẫu 13. Đồng hồ đo thể tích khí TC: temperature control (điều khiển nhiệt độ) 2.1.3. Quá trình chiết xuất: Chuẩn bị mẫu: lớp vỏ củ hành được bốc tách bằng tay, loại bỏ những phần hư hỏng và cắt thành mảnh nhỏ khoảng 0,50,5 inch. Quy trình chiết xuất: áp suất và nhiệt độ được cài đặt ở 5700 psi và 40oC. Phải mất từ 25 – 30 phút để đạt được các điều kiện trên. Bình chiết được gia nhiệt 24h trước khi lấy dịch chiết để thống nhất thời gian chiết giữa các mẫu. Hành tây thái nhỏ và ethanol 5% (nồng độ phân tử so với tổng số mol CO2 sử dụng để tạo áp lực cho hệ thống) được thêm vào bình trước khi nó được đóng lại. Máy bơm được cài đặt 5 ml/phút. Khi các điều kiện mong muốn đạt tới, các van micrometering được mở, CO2 tương đương 15 L khí nén (khoảng 4% tổng số CO2 chiếm thể tích bên trong bình chiết) đi qua khay để lấy mẫu (nhanh nhất có thể để duy trì chế độ tĩnh), sau đó các van micrometering được đóng lại, thay các chai thuỷ tinh đựng mẫu mới. Quá trình này kéo dài khoảng thời gian từ 10-18 phút. Sau đó, mẫu tiếp theo được lấy một lần nữa với việc mở van micrometering. Mỗi mẫu chiết 10 lần và chiết với 5 mẫu khác nhau. 2.1.4. Hệ thống HPLC phân tích mẫu: Hệ thống HPLC gồm: - Phần mềm PEAKSIMPLE - Tiền cột: C18 (1 cm x 4 mm, 5 pm) - Bơm QUAT (Model AGP-1, Cotati, CA) - Cột: BetaBasic C18 (250 x 4.6 mm, 5 pm) - Bơm mẫu: Rheodyne manual injector (10 µL injection loop). - Đầu dò: LC quang phổ (Waters, Lambda-Max, Model 481, Milford, MA). Các thông số sắc ký: - Pha động: dung dịch acid phosphoric [0,5% (v/v)] - methanol (2:3 (v/v)) - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Bước sóng phát hiện: 280 nm - Thời gian phân tích: 10-15 phút cho mỗi mẫu 2.1.5. Kết quả và bàn luận: Từ năm lần lập lại, quercetin chiết xuất được trong phạm vi 226-323 µg cho giống hành đỏ, và 101 - 225 µg cho giống hành vàng (Bảng 2.1). Trung bình 0,024 g quercetin/kg vỏ củ hành trích được cho giống màu đỏ và 0,020 g của quercetin / kg vỏ củ hành cho giống vàng, thời gian chiết xuất tổng cộng 150 phút cho giống màu đỏ và 156 phút cho giống màu vàng. Ở khoảng tin cậy 95% không có sự khác biệt có ý nghĩa (P = 0,182) giữa khối lượng quercetin chiết được/ kg hành đỏ và vàng, giống màu vàng có độ lệch chuẩn thấp (0,003) so với màu đỏ (0,005). Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành đỏ. Mẫu số Thời gian chiết (phút) Nồng độ (µg/ml) Tổng lượng quercetin (µg) Tỉ lệ µg Quercetin / Lít CO2 số g quercetin/ kg vỏ hành Khối lượng vỏ hành % Ethanol (nồng độ phần mol) Hành đỏ 1 145 0,037 313 2,09 0,027 11,8 7,09 2 143 0,037 323 2,09 0,027 13,9 7,78 3 152 0,035 291 1,94 0,023 12,8 6,80 4 152 0,029 287 1,91 0,024 10,5 7,78 5 157 0,029 226 1,51 0,019 12,0 7,78 Trung bình 150 0,034 288 1,91 0,024 12,2 7,45 Hành vàng 1 156 0,015 193 1,27 0,022 8,6 7,69 2 151 0,016 201 1,32 0,025 8,1 7,69 3 159 0,020 225 1,46 0,023 9,6 8,17 4 164 0,020 149 0,99 0,018 5,8 7,69 5 150 0,014 101 0,67 0,012 8,2 7,69 Trung bình 156 0,017 174 1,14 0,020 8,1 7,79 Kết quả (Bảng 2.1) cho thấy không có sự tương quan giữa thời gian chiết xuất, khối lượng vỏ hành và nồng độ ethanol (trong phạm vi mà các thông số này khác nhau) trên tổng khối lượng quercetin, vì sự thay đổi này không ảnh hưởng đến sự biến động của khối lượng quercetin. Mặt khác, thể tích ethanol thu được trong mẫu cho thấy có ảnh hưởng đến lượng quercetin chiết xuất. Để đánh giá tương quan giữa lượng quercetin chiết được và thể tích ethanol thu trong ống, một phân tích thống kê được thực hiện. Để thực hiện phân tích này, giá trị trung bình của 5 lần chiết trong mỗi ống được thu thập và xử lý số liệu. Các phân tích hồi quy cho thấy, ở mức độ tin cậy 95%, mối quan hệ tuyến tính giữa tổng lượng quercetin chiết xuất và thể tích ethanol thu được là (R2 = 0,82, P <0,001, cho giống hành đỏ và R2 = 0,877, P <0,001, cho giống hành vàng). Kết quả này cho thấy lượng quercetin thu được tỷ lệ thuận với thể tích ethanol trong mỗi ống. Hình 2.2. Biểu đồ tương quan giữa lượng quercetin chiết xuất và thể tích ethanol. Phân tích hồi quy thể tích ethanol (trung bình của năm mẫu chiết trong mười ống) so với thời gian, và tỷ lệ chiết xuất (trung bình của năm mẫu chiết trong mười ống) so với thời gian được thực hiện để tìm thấy bất kỳ xu hướng có thể. Cả hai phân tích cho thấy xu hướng tương tự: khi tăng thời gian thì thể tích ethanol và tỷ lệ chiết xuất đều giảm. Hình 2.3. Biểu đồ tương quan giữa thể tích ethanol trong mỗi ống và thời gian Hình 2.4. Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ chiết xuất và thời gian Hai giả thuyết được đưa ra từ biểu đồ ở hình 2.3. Thứ nhất: ethanol có ái lực cao với vỏ hành hơn so với dòng khí nên rất khó kéo ethanol ra khi chúng đã thấm sâu vào hành. Thứ hai, không phải tất cả ethanol bị lôi cuống theo đều ở lại trong lọ thành phẩn, một số bị kéo theo dòng khí. Ngoài ra còn có các yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến kết quả, ví dụ sự hiện diện của các hợp chất khác tương tự ở vỏ hành, chẳng hạn như kaempferol và myricetin. Các hợp chất này có thể cạnh tranh với quercetin trong dòng khí và ethanol. Tóm lại: Quercetin tự do đã được chiết xuất từ vỏ củ hành đỏ và vàng, bằng cách sử dụng CO2 siêu tới hạn như một dung môi và ethanol như một chất mang. Các kết quả trình bày không có khác biệt thống kê, ở mức độ tin cậy 95% giữa các giống hành. Khối lượng quercetin tự do và thể tích ethanol thu được trong mỗi ống thu tỷ lệ thuận với nhau. Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp thay thế cho phương pháp chiết rắn -lỏng thông thường để chiết quercetin. Tuy nhiên, trong tương lai cần chú ý nhiều hơn các hợp chất tương tự khác có trong hành có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và hiệu suất chiết. 2.2. CHIẾT XUẤT QUERCETIN BẰNG NƯỚC SIÊU TỚI HẠN: [17] Phương pháp này được thực hiện tại đại học Ewha womans Hàn Quốc năm 2010, sử dụng nước làm chất lỏng siêu tới hạn. 2.2.1. Nguyên liệu và thiết bị: Chuẩn bị mẫu thử: củ hành tây được lấy từ Uiseong, Gyeongsangbuk-do, Hàn Quốc, chỉ những củ có bao phủ bên ngoài lớp vỏ màu da cam mới được sử dụng. Vỏ củ hành tây được sấy khô với không khí nóng ở 60oC trong 10 giờ và sau đó cắt thành miếng (<10 mm) sử dụng một máy trộn tốc độ cao (Blender 7012S, Waring Co., Torrington, CT, USA). Tất cả các mẫu được lưu trữ trong tủ lạnh duy trì ở 4oC. Các mảnh vỏ hành và diatomaceous earth (DE, tảo cát trái đất) (ASE® Prep DE, DIONEX Co., Sunnyvale, CA, USA) được pha trộn và cho vào tế bào chiết thép không gỉ 34 ml (DIONEX Co.) có chứa giấy lọc cellulose (30 mm, DIONEX Co.) như ở hình 2.5. Thiết bị: trình bày ở hình 2.5. Hình 2.5. Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn Sử dụng phần mềm thống kê SPSS (Version 17.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, giá trị biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). 2.2.2. Quá trình chiết xuất: Chiết bằng nước siêu tới hạn: Việc chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng một dung môi nhanh (100 ASE, Công ty DIONEX) với nước Milli-Q (MR-RO800, Công ty TNHH Mirae ST, An Dương, Hàn Quốc) như là dung môi duy nhất. Vỏ hành tây (1-2 g) và DE được trộn tỷ lệ hỗn hợp giữa 0,5:3,5 và 02:02. Quá trình chiết xuất được thực hiện như hình 2.5. Mẫu này được nạp vào tế bào chiết thép không gỉ và điền đầy dung môi trong khoảng 1 phút, tăng áp suất trong 5 phút. Sau khi áp suất đạt 90 bar, tế bào chiết được cung cấp nhiệt (tượng trưng cho thời gian chiết xuất) trong khi áp suất được duy trì ở 90-131 bar, nhiệt độ chiết xuất từ 100-190oC. Tế bào chiết này có thể được rữa sạch dung môi qua các đường bơm mẫu trong vòng 30s. Việc rữa tế bào chiết được thực hiện khoảng 1-2 phút giữa các lần chiết xuất với khí nitơ. Dịch chiết được thu vào một lọ thủy tinh (40-50 ml) đã biết khối lượng. Chiết rắn - lỏng: Sử dụng dung môi chiết là ethanol 95% (Samchun pure chemicals Co., Seoul, Korea) và methanol 99,8% (Duksan pure chemicals Co., Ansan, Korea) ở 60oC trong 2 giờ với 40ml dung môi cho 1g