Đề tài Thiết lập qui trình Southern Blot

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1ĐẶT VẤN ĐỀ Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt cho thế kỷ 21. Trước hết là những đầu tư rất lớn để khai thác và ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu hại, cỏ dại và các loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp. Đây là một hướng nghiên cứu mới có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nước ta nếu được đầu tư phát triển sản xuất. Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, theo đó các kĩ thuật về sinh học phân tử đã ra đời như phương pháp Southern blot, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RADP (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến mới trong các hướng nghiên cứu về acid nucleic. Đặc biệt là các nghiên cứu sâu về gen và cấu trúc gen. Trong đó, phương pháp Southern blot được xem là một kĩ thuật đem lại kết quả chính xác cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử. Một trong những ứng dụng quan trọng của Southern blot là lập bản đồ giới hạn di truyền; phát hiện các khuyết tật về di truyền do gen; chẩn đoán phân tử; xác định số bản sao của gen. Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp. Với những trang thiết bị hiện có của Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. HCM, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Thiết lập qui trình Southern blot ”. 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu đề tài Thiết lập qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong điều kiện phòng thí nghiệm. 2 1.2.2 Yêu cầu - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng các enzyme giới hạn. - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ sản phẩm PCR. - Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Southern blot, một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do Ed Southern ở MRC một bộ phận của genome động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975). Đã gần 30 năm trôi qua, kĩ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất mhiều, chủ yếu bao gồm: - Tăng độ nhạy - Giảm một số bước trong quá trình lai - Giảm thời gian thực hiện - Về kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn trước nhiều. Theo đó, một số phương pháp chuyển lên màng cũng đã được mô tả bởi các tác giả sau: Southern (1979); Maniatis và ctv (1982); Meinkoth và Wahl (1984); Vandenplas và ctv (1984); Jeffreys và ctv (1985) nhưng đều dựa trên một nền tảng chung: - DNA được giữ trong một hệ thống gel thích hợp - DNA được vận chuyển lên một giá thể rắn - Probe đánh dấu được lai với DNA được giữ trên một vật thể và probe có thể được loại bỏ sau quá trình lai - Sản phẩm lai được phát hiện dựa trên một hệ thống phát hiện thích hợp. Song song đó, nhiều phương pháp chuyển DNA từ gel lên màng cũng được thực hiện như: blot mao dẫn hướng xuống (Lichtenstein và ctv, 1990; Chomozynki, 1992), blot chân không (Medveczky và ctv,1987; Olszewska và Jone, 1988; Trnovsky, 1992), blot hai chiều (Sambrook và Russell, 1999), và blot với đệm alkaline (Reed và Mann, 1985). Bên cạnh đó, vật liệu làm màng cũng đã được cải tiến đi rất nhiều. Phương pháp Southern blot đầu tiên được mô tả bởi Southern sử dụng màng nitrocellulose để chuyển DNA. Trong vài năm lại đây, vật liệu màng mới được phát triển và bao gồm giấy DBM, DPT và cả hai loại màng nylon tích điện và không tích điện, với mục đích tăng độ liên kết, có thể vận chuyển những phân tử nhỏ, và màng có thể sử dụng lại cho việc lai sau khi đã loại bỏ probe. 4 Cùng với sự phát triển đó, các phương pháp đánh dấu probe không dùng phóng xạ đã ra đời và đang được thương mại hóa trên thị trường. Bằng việc sử dụng các tiểu phần của biotin (Langer và ctv, 1981) và dùng enzyme gắn kết với DNA probe (Renz và Kurz, 1984). Năm 1990, Ishii thuộc Viện Lúa Quốc tế đề nghị cải tiến phương pháp Southern blot không dùng đồng vị phóng xạ, bằng cách sử dụng digoxigenin. Các phân tử lai được phát hiện bằng kháng thể của digoxigenin có gắn với enzym photphatase kiềm. Probe sử dụng có thể là DNA, RNA, cDNA. 2.2 NGUYÊN TẮC CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Đầu tiên cần tách chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước. Gây biến tính DNA trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M), sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai thường sử dụng là màng nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên gel, được giữ yên khi chuyển lên màng lai. Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ. Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 65oC trong 3 – 8 giờ, sau đó thêm dịch lai với chế độ nhiệt 65oC, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng. Rửa màng lai bằng dung dịch SSC (NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 65oC hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc hoặc sấy khô ở 65oC. Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 20oC, xử lý dưới ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai. 2.3 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Việc khám phá ra sự tương đồng của các chuỗi DNA thông qua phương pháp Southern blot đã góp một vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử và tái tổ hợp DNA. Southern blot là một phương pháp quan trọng để nghiên cứu những vấn đề cơ bản như sự hiểu biết về cấu trúc gen, biểu hiện của gen và các genome. Lai Southern blot được áp dụng để phát hiện số lượng bản sao của một gen trong genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn DNA, sự có mặt của các đoạn DNA 5 lạ, sự thay đổi vị trí của các transposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các intron, exon của một gen …. Khi áp dụng các chỉ thị phân tử (marker DNA) khác nhau làm mồi, chúng ta có thể phân biệt được các loài, cá thể dưới loài. Phương pháp Southern blot càng có vai trò trong chẩn đoán các bệnh do di truyền và những khám phá về vi khuẩn cũng như các chủng vi rút gây bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2001). 2.4 SỰ KHÁC NHAU GIỮA SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT VÀ WESTERN BLOT Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot, Northern blot và Western blot Southern blot Northern blot Western blot 1) Chiết xuất DNA từ tế bào 2) Cắt với enzyme giới hạn 3) Chạy điện di trên gel agarose 4) Thường chuyển lên màng bằng phương pháp mao dẫn 5) Lượng sản phẩm thừa là DNA 6) Lai với probe DNA 7) Rửa bỏ probe thừa làm tăng độ chính xác ở bước phát hiện 8) Phóng xạ tự ghi (autoradiograph) 1) Chiết xuất RNA từ tế bào 2) Biến tính với formaldehyde 3) Chạy điện di trên gel agarose 4) Thường chuyển lên màng bằng phương pháp mao dẫn 5) Lượng sản phẩm thừa là RNA 6) Lai với probe DNA 7) Rửa bỏ probe thừa làm tăng độ chính xác ở bước phát hiện 8) Phóng xạ tự ghi (autoradiograph) 1) Chiết xuất protein từ tế bào 2) Biến tính với SDS 3) Chạy điện di trên gel polyacryamide - SDSPAGE 4) Thường chuyển lên màng bằng phương pháp điện di 5) Lượng sản phẩm thừa là protein 6) Lai với probe kháng thể 7) Rửa bỏ probe thừa 8) Phóng xạ tự ghi (autoradiograph) hoặc phát triển với cơ chất chromogenic 2.5 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VI KHUẨN Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này 6 ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Thông thường các phương pháp tách chiết đều phải qua các bước sau. - Bước 1: Phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA. - Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein mà chúng thường được làm biến tính trong phenol và chloroform. - Bước 3: Tủa nucleic acid nhằm thu nhận chúng ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Mục đích của các phương pháp tách chiết nucleic acid là có thể thu được phần lớn các nucleic acid có trong mẫu ở dạng nguyên vẹn và đủ sạch để tiến hành các phân tích phân tử kế tiếp. Trong nghiên cứu này, việc chuẩn bị genomic DNA có vai trò rất lớn trong quá trình tạo mẫu lai. Đầu tiên, chúng được cắt với một hoặc nhiều enzyme để tạo ra những phân đoạn nhỏ và được phân biệt nhau theo kích thước khi chạy điện di. Những đoạn DNA này được làm biến tính in situ và vận chuyển từ gel lên một vật thể rắn (thường là một màng nylon hoặc nitrocellulose). Vị trí của những đoạn DNA phân biệt theo kích thước được giữ trong suốt quá trình chuyến đến màng. Sau đó, DNA sẽ được cố định trên màng và chuẩn bị cho việc lai. Thông thường để có được một qui trình ly trích DNA ổn định, đủ lượng và đủ tinh khiết để thực hiện các phân tích kế tiếp, cần phải trải qua các quá trình thử nghiệm; từ đó đưa ra qui trình thích hợp trên đối tượng nghiên cứu. Sau đây là các phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn. 2.5.1 Phƣơng pháp sử dụng SDS (Sambrook và ctv, 2001) 1. Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng qua đêm. 2. Thu sinh khối bằng ly tâm và rửa trong 5 ml Tris 50 mM (pH 8,0), EDTA 50 mM. 3. Đông huyền phù ở - 20oC. 4. Thêm 0,5 ml Tris 250 mM (pH 8,0), lysozyme 10 mg / ml để giảm xóc. Đem đông đá và làm tan ở nhiệt độ phòng. Khi đã tan, để trên đá 45 phút. 5. Thêm 1ml SDS 0,5 %, Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 0,4 M, proteinase K 1 mg / ml. Đem ủ ở bồn ủ nhiệt ở 50oC trong 60 phút. 7 6. Đem ly trích với 6 ml Tris được cân bằng phenol và ly tâm 10000 vòng/15 phút. Chuyển phần dịch nổi bên trên cho vào một tube mới (có thể thực hiện lại bước này khi cần thiết). 7. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ. Sau đó thêm vào 2 thể tích 95 % ethanol, lắc đều. 8. Tủa DNA và cho vào 5 ml Tris 50mM (pH 7,5), EDTA 1mM, RNAse 200 mg / ml, để qua đêm ở 4oC. 9. Ly trích cùng với thể tích chloroform, lắc đều và ly tâm 10000 vòng/5phút. Chuyển phần dịch bên trên vào một tube mới. 10. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ; cho vào 2 thể tích ethanol 95 %, lắc đều. 11. Làm tủa và hòa tan DNA trong 2 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM. 12. Kiểm tra sản phẩm ly trích bằng điện di và phân tích. 2.5.2 Phƣơng pháp sử dụng CTAB (Sambrook và ctv, 2001) 1. Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng LB, thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4oC. 2. Rửa sinh khối thu được với 1ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex . 3. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE 1X và đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ. 4. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5 M, hòa tan thật kỹ bằng voltex. 5. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút. 6. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/10phút, ở 4oC. 7. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt bề mặt chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa ở tốc độ lớn hơn). 8. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol(25:24:1) với sự ngang bằng về thể tích. Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng/10phút/4oC. 8 9. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở - 20oC / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng/10phút/4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm. 10. Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng/10phút/4oC. Thu kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. 11. Hòa tan hoàn toàn DNA kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X. Cho thêm vào 1µl RNAse, ủ phản ứng ở 37oC, trong 2 giờ . 12. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1). Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/5 - 10 phút/4oC. 13. Thu phần dung dịch bên trên và chiết xuất với chloroform / isoamyl alcohol (24:1). Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng / 5 - 10 phút / 4oC. 14.Thu phần dung dịch DNA bên trên. Thêm 2 µl dung dịch natri acetate 3 M (pH 5,0), isopropanol. Rửa kết tủa với 70% ethanol. Thu kết tủa làm khô. 15. Hòa tan kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X, đem mẫu giữ ở tủ 4oC. 2.5.3 Phƣơng pháp sử dụng Phase Lock Gel TM (Jones và Bartlet, 1990) 1. Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng, thu sinh khối vào eppendorf 1,5 ml bằng cách ly tâm. 2. Làm tan sinh khối trong 467 µl TE 1X. Thêm vào 30 µl SDS 10% và 3 µl Proteinase K (20 mg / ml), trộn đều và ủ 1 giờ ở nhiệt độ 37oC. 3. Thêm vào phenol / chloroform, lắc đều cho đến khi có sự hòa lẫn hoàn toàn. Cẩn thận chuyển hỗn dịch DNA phenol vào một tube Phase Lock Gel TM và ly tâm 2 phút. 4. Lấy phần dịch bên trên cho vào một eppendorf mới và thêm vào đó một lượng ngang bằng phenol / chloroform. Trộn đều và chuyển cẩn thận phần hỗn hợp đó vào một tube Phase Lock Gel TM mới, ly tâm 5 phút. Chuyển phần bên trên vào một eppendorf mới. 5. Thêm 1/10 thể tích natri acetate, trộn đều. 6. Thêm 0,6 thể tích isopropanol, trộn nhẹ cho đến DNA tạo kết tủa, ly tâm, bỏ phần dịch . 7. Rửa DNA trong 1 ml ethanol 70% trong 30 giây. 9 8. Làm tan DNA trong 100 – 200 µl đệm TE 1X. Có thể để vài ngày để DNA tan hoàn toàn. 9. Nếu giữ trong thời gian ngắn thì trữ ở 4oC; còn nếu giữ trong thời gian dài thì nên giữ trong tủ -20oC hoặc -80oC . 10. Sau khi DNA đã tan hoàn toàn trong TE, tiến hành xác định nồng độ DNA. 2.6 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG DNA Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như phương pháp đo mật độ quang, điện di, siêu ly tâm, sắc kí (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) 2.6.1 Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế Phương pháp này không thật chính xác nhưng cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu, và thường điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu. Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm- Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau đây. - Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: + 50 µg / ml cho một dung dịch DNA sợi đôi + 40 µg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn. - Ví dụ: một giá trị OD260nm = 0,9 sẽ tương đương với: + Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi = 0,9 x 50 = 4,5 µg / ml + Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA = 3,6 µg / ml Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm). 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm / OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2. 10 2.6.2 Điện di (Electrophoresis) Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thước. Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, tức là dưới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base. Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng. Thực hiện nạp mẫu điện di Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu nucleic acid đã được trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó được duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dưới UV. 11 2.6.3 Định lƣợng DNA bằng phân tử Mass Phương pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lượng so với band của phân tử Mass. Mẫu định lượng cần phải được pha loãng một lần, hai lần, ba lần, …, n lần. Sau đó, các mẫu pha loãng được kiểm tra bằng điện di và được so sánh với phân tử Mass, cho đến khi đạt được sự tương đương về kích thước và độ sáng giữa band của mẫu pha loãng với band của Mass. Từ đó, xác định được nồng độ của mẫu pha loãng, đồng thời ta có hệ số pha loãng so với mẫu gốc tính được nồng độ của mẫu gốc. Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng) 10 µg 1000 bp 100 ng 1000 bp 7 µg 700 bp 70 ng 700 bp 5 µg 500 bp 50 ng 500 bp 2 µg 200 bp 20 ng 200 bp 1 µg 100 bp 10 ng 100 bp Một số điểm chú ý khi sử dụng phân tử Mass. Mỗi tube phân tử Mass chuẩn chứa thể tích là 250 µl nên có thể được sử dụng cho 100 giếng khi sử dụng thể tích là 2,5 µl / giếng. Nồng độ của dung dịch chuẩn là 100 µg / ml trong đệm TE. Hình 2.1 Thang chuẩn về nồng đô của phân tử Mass (Bio- Rad) 2,5 µl mẫu chuẩn được pha loãng với 10 µl loading buffer và TE được bơm vào gel agarose 1,8 %. Gel này được đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X. Gel được ngâm trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg / ml EtBr) trong 15 phút và được giữ trong nước 30 phút. 12 Phân tử Mass chuẩn có thể được giữ ở nhiệt độ phòng, nhưng nên giữ ở nhiệt độ 4 o C là tốt nhất (ở nhiệt độ này nó có thể được dùng ổn định trong 1 năm). Tuy nhiên, nó có thể được giữ trong thời gian dài trong tủ - 20oC. Phân tử Mass được điện di với gel agarose có nồng độ 1,8 % và gel polyacryamide với nồng độ 8 %. Nồng độ của Mass được xác định dựa vào sự hấp thu bước sóng 260 nm của phân tử Mass, với mức độ sai số là 1 %. 2.7 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME) Tế bào vi khuẩn bị nhiễm thực khuẩn thể (phage) thường bị phage phá huỷ. Có một số chủng vi khuẩn bị nhiễm phage không bị phage tiêu diệt, do DNA của phage bị cắt thành từng đoạn nhỏ nhờ một số loại enzyme trong tế bào. Những enzyme đó được gọi là enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA của phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn (Khuất Hữu Thanh, 2001). Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influenzae. Chủng Rd đặt tên là Hind II. Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme - RE) thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết trong phân tử DNA. Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn. Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất. 2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn Qui ước quốc tế các enzyme giới hạn kí hiệu như sau: chữ đầu viết chữ in hoa chỉ tên chi hoặc loài vi khuẩn mà từ đó các enzyme giới hạn được tách chiết; hai chữ tiếp theo viết chữ in thường chỉ giống của vi khuẩn; tiếp đến là một chữ viết hoa chỉ chủng vi khuẩn, cuối cùng là chữ số la mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn có enzyme giới hạn được phát hiện. 13 Ví dụ: Chi, loài Giống Chủng Thứ tự dòng Escherichia Coli Ry13 Eco RI E co R I Eco RV E co R V 2.7.2 Các loại enzyme giới hạn Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người ta chia enzyme giới hạn làm ba loại (Khuất Hữu Thanh, 2001). Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn) di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide cắt tại đó và giải phóng độ vài chục nucleotide. Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại này thường sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp. Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước. 2.7.3 Các kiểu cắt của enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp xếp khác nhau). Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 44 = 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 46 = 4096 cặp nucleotide có một chỗ bị cắt. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định. Có theo hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le (Khuất Hữu Thanh, 2001). Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt ends). Các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với nhau. Để nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzym nối – DNA ligase, hoặc các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme. 14 Ví dụ: Enzyme SmaI cắt tạo đầu bằng giữa các đoạn 6 bp 5’ … CCCGGG … 3’ 3’ … GGGCCC … 5’ 5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’ 3’ … GGG ~ P OH ~ CCC … 5’ Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn, tạo nên các đầu so le (hay đầu dính – cohesive ends). Các đầu so le tạo nên sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase, nhờ đặc tính này enzyme giới hạn cắt đầu sole được sử dụng nhiều trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Ví dụ: Vị trí phân cắt phân tử DNA của enzyme Eco RI 5’ … GAATTC … 3’ 5’ … G ~OH + P ~ AATTC … 3’ 3’ … CTTAAG … 5’ 3’ … CTTAA ~ P HO ~ G … 5’ 2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng Thường trong nghiên cứu sinh học phân tử, cũng như trong một phòng thí nghiệm về sinh học phân tử luôn luôn phải có một bộ enzyme thông dụng. Trong đó, enzyme giới hạn đặc biệt không thể thiếu trong các phân tích về genome như nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể, tạo dòng. Sau đây, liệt kê một số enzyme thường hay sử dụng trong các thí nghiệm về phân tử (bảng 2.3). EcoRI 15 Bảng 2.3 Một số enzyme thƣờng sử dụng và các trình tự đặc hiệu Enzyme Trình tự đặc hiệu Số vị trí cắt Nguồn gốc (tên vi sinh vật) Ở thực khuẩn thể 1 Ở pB 322 Alu I Bam HI Bst I Eco RI Hae I Hind III Hpa I