Đề tài Tìm hiểu về Sulfamit (sas), metronidazole(mtd)

xydimetridazole trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha động H2O- ACN, detector UV phát hiện tại bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi cho các mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5%. Khoảng tuyến tính từ 0,7 -60mg/kg. Độ lệch chuẩn tương đối của 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn và thịt xông khói tăng, ở nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%. Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng thời metronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện sắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa giải gradient 0,05M đệm phosphate (pH =2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút. Khoảng tuyến tính của metronidazole: 0,005-1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g. Khoảng tuyến tính của piamycin: 0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g. 1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam (penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước thải bệnh viện. Phương pháp phân tích là HPLC – MS. Các chất phân tích có nồng độ thay đổi theo thời gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h. Nồng độ chất phân tích thay đổi trong phạm vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole 0,1-90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l); trimethoprim 0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l). Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng thời 7 sulfamit (sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonomethoxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm bằng sắc ký HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6 mm, 5µm). Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút. Phát hiện bởi detector PDA tại 268 nm. Giới hạn định lượng 3 - 80 mg/g. Khoảng tuyến tính của các sulfamit 20-200 mg/ml. Khoảng tuyến tính của metronidazol, chloramphenicol 40-400 mg / ml. Hiệu suất thu hồi trung bình là 83,8% - 105,3% . Độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%. Phương pháp này thường được sử dụng cho việc xác định bảy sulfamit và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm. Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Ở Việt Nam nuôi tôm đã trở thành hoạt động quan trọng nhất và được xem là mục tiêu chủ yếu của kế hoạch phát triển nuôi trồng thủy sản. Sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi tôm dẫn đến tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cũng gia tăng. Họ thuốc kháng khuẩn SAs, MTD là nhóm có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong chăn nuôi tôm để phòng ngừa và chữa nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn cho vật nuôi. Sau khi vật nuôi đã sử dụng các chất đó, nếu không đảm bảo thời gian cách ly để vật nuôi tự làm sạch thì sẽ có tồn dư chất kháng khuẩn có thể gây tổn hại cho sức khoẻ người tiêu dùng. Dư lượng kháng sinh trong tôm tác động xấu cho người tiêu dùng đã được cảnh báo từ nhiều năm trước nhưng đến nay vẫn còn tồn tại vì thế các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này hiện rất quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện sự bền vững trong nuôi tôm theo định hướng bảo vệ môi trường và sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn. Vì vậy đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là Metronidazole sulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxazon (SMX) được sử dụng nhiều trong chăn nuôi. Mục tiêu của đề tài chính là cần tìm ra phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các chất trên trong tôm cho độ nhạy, độ chính xác cao mà đơn giản, phù hợp với trang thiết bị sẵn có. Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là detector UV-Vis. 2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định đồng thời các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector UV-Vis. Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau: Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng thời năm chất bằng HPLC: Chọn bước sóng của detector Chọn pha tĩnh Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo. Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích: Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích một số mẫu tôm. Phương pháp nghiên cứu Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rất phức tạp. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để khảo sát các điều kiện tách và định lượng các chất. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC [4 ; 8] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Chất tan sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển đến detector để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau. Trong một hệ pha HPLC, dung lượng hấp phụ của pha tĩnh được đặc trưng bằng hệ số dung tích k’. Nếu k’ càng lớn thì chất phân tích sẽ bị lưu giữ càng nhiều trên cột tách. Hệ số dung tích được tính theo biểu thức : (tR: thời gian lưu tổng cộng, to: thời gian không lưu giữ). Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau: Tương tác hấp phụ Tương tác trao đổi ion Tương tác theo cơ chế rây phân tử Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau: Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP - HPLC) Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC) Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC) Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môi không và kém phân cực. Ngược lại trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực, thông thường pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt tạo thành các vật liệu nhồi kém phân cực. Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực. Khác với hệ pha thường dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thể phân tích nhiều loại chất với độ phân cực khác nhau. Do các ưu điểm như xác định được nhiều loại chất, hiệu quả tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng nhiều hơn. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau: Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ Phân tích định lượng bằng HPLC Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu này để định tính được chất đó thông qua mẫu chuẩn. Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất. Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích. H = k.Cb S = k.Cb Trong đó: H - chiều cao pic sắc ký của chất S - diện tích pic sắc ký của chất k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1 Ở vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính: H = k1.C = f(C) S = k2.C = f(C) Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn. Dùng phương pháp đường chuẩn thì nhanh, đơn giản. Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn. Đối với các pic tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn. Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích. Nên trong phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic. Tuy nhiên đối với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc đo diện tích píc lại chính xác hơn. Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng độ chất theo phương pháp thêm chuẩn. Giới thiệu chung về phương pháp chiết pha rắn [9] Khi lượng chất phân tích có trong mẫu quá nhỏ, bước làm giàu chất phân tích qua cột chiết pha rắn là rất cần thiết. Hơn nữa, mẫu thực phẩm là loại mẫu có nền rất phức tạp, ngoài chất phân tích còn có rất nhiều các chất béo khác nên cần phải chiết pha rắn để lấy các chất phân tích một cách định lượng từ dung dịch, loại tạp chất và thu hồi toàn bộ nó. Sau khi làm sạch chất phân tích được rửa giải vào một thể tích nhỏ dung dịch và lấy một cách định lượng khỏi dung dịch nên có hệ số làm giàu cao. Cơ sở chính của phưong pháp này về căn bản rất giống với sắc ký lỏng (đã được giới thiệu ở trên), chỉ khác ở chỗ: HPLC tách các hợp chất trong một hệ có pha động chảy liên tục, trong khi chiết pha rắn giữ chất phân tích ở chất hấp phụ, các tạp chất bị loại vào pha động và chất phân tích được rửa giải vào dung môi thích hợp sau đó. Chiết pha rắn là một dạng HPLC đặc biệt, chỉ giữ chất này và không giữ chất kia. HPLC đòi hỏi một cột (pha tĩnh) có số đĩa lý thuyết lớn (hàmg trăm ngàn đến hàng triệu đĩa) trong khi chiết pha rắn chỉ yêu cầu một cột có số đĩa lý thuyết nhỏ (khoảng vài chục đĩa). Nguyên tắc chung của phương pháp chiết pha rắn. Chiết pha rắn là quá trình chuyển chất tan (chất phân tích) từ pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích. Quá trình chiết pha rắn được tiến hành qua 4 giai đoạn: Giai đoạn 1: Hoạt hoá chất hấp thu (pha rắn): Người ta cho dung môi chảy qua cột chiết để thấm ướt các hạt pha rắn, hoạt hoá các nhóm chức, đuổi bọt khí, lấp đầy dung môi vào các khoảng trống. Sau khi hoạt hoá, pha rắn cần được ngâm trong dung môi. Giai đoạn 2: Cho mẫu phân tích chảy qua cột chiết. Các chất phân tích bị hấp thu thành dải ở phần đầu của cột chiết nhờ lực tương tác Van-de-van (Vanderwaals), cũng có thể lực liên kết hidro; lực lưỡng cực - lưỡng cực hoặc theo cơ chế trao đổi ion. Giai đoạn 3: Giai đoạn làm sạch mẫu phân tích. Người ta tiến hành rửa cột chiết bằng dung môi để loại bỏ các chất lạ bị hấp thu cùng với chất phân tích. Giai đoạn 4: Rửa giải toàn bộ chất phân tích bằng một lượng nhỏ dung môi. Hệ số làm giàu càng cao khi lượng dung môi rửa càng ít. Hoá chất và dụng cụ Hoá chất Sulfadoxin (SDO), sulfaguanidin (SGU), sulfamethoxypyridazine (SMP), sulfamethoxazon(SMX), metronozazol(MTD) tinh khiết 99.9% của Viện Kiểm nghiệm Dược Bộ y tế - Hai Bà Trưng, Hà Nội. Dung dịch gốc 1000 mg/ml được pha từ lượng cân trong metanol tinh khiết HPLC, dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Các dung dịch chuẩn được pha từ dung dịch gốc bằng dung môi giống như pha động chạy sắc ký để tránh pic ảo do sai khác dung môi gây ra. Metanol (MeOH), axetonitril (ACN), axít axetic, muối natri axetat loại tinh khiết HPLC của hãng Meck, Đức. Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách: chuẩn bị 2 dung dịch: - Dung dịch CH3COONa.H2O có nồng độ 100mM: cân một lượng chính xác chất phân tích loại tinh khiết đã tính trước, hoà tan bằng nước cất hai lần, chuyển vào bình định mức dung tích 250ml, định mức. - 250ml dung dịch axit acetic nồng độ 100mM: được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ axit acetic đặc của Meck. - Chỉnh pH của dung dịch bằng cách trộn dung dịch CH3COONa.H2O và axit acetic với tỉ lệ xác định, sao cho nồng độ đệm bằng 10mM. Dụng cụ Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent - Mỹ, điều khiển bằng phần mềm Chemstation cho phép quét phổ từ 190 – 1100 nm. Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer – Đan Mạch với điện cực thuỷ tinh Red – Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm: Bộ loại khí cho dung môi, Degasser – DGU-14AM Van trộn dung môi FCV-10ALVP. Bơm dung môi bốn kênh LC-10ATVP. Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-10 ASVP Van bơm mẫu 6 chiều VS-7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòng mẫu (sample loop) 20µl. Detector UV – Vis SPD- 10AVVP. Hệ điều khiển SCL-10AVP Phầm mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1. Cột chiết pha rắn : ODS, Sbề mặt : 546 m2/g ; kích thước lỗ trung bình : 60Ao, pH =7, kích thước hạt : 54µm. Cattrige lọc cỡ 0,45mm, 0,2mm, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy, máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác. Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký 3.1.1. Chọn bước sóng của detector Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là HPLC ghép nối detector UV – Vis. Việc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một độ dài sóng nào đó. Chính vì thế để thu được pic cao, rõ ràng đủ để định lượng cần phải đo ở cực đại hấp thụ. Dựa trên cấu trúc của các SAs, MTD trong phân tử đều có chứa vòng liên hợp và chứa các nhóm mang màu và trợ màu làm tăng khả năng hấp thụ trong vùng tử ngoại. Tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng UV trên máy UV-Vis 8453 trong những điều kiện sau: Nồng độ chất phân tích 1 ppm đối với các chất Dung môi 20% ACN và 80% đệm axetat, pH= 4,5; Cđệm =10mM Khoảng quét phổ 200 – 400nm Kết quả được thể hiện ở hình 3.1: a/SGU b/MTD c/SMP c/SDO d/SMX Chồng các phổ: 1:SGU, 2:SDO, 3:SMP, 4:SMX, 5:MTD Hình 3.1: Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các SAs Từ quang phổ, chúng tôi thấy rằng các chất hấp thu cực đại tại bước sóng không khác nhau nhiều và nằm trong khoảng 260-275nm. Riêng MTD hấp thụ cực đại tại320nm . Vì vậy, để có bước sóng chung cho 5 chất chúng tôi chọn bước sóng 270nm cho các thí nghiệm tiếp theo. Đồng thời để định lượng chất MTD nhạy hơn, Detecto để 2 kênh 320nm và 270nm. Để kết quả chính xác hơn,chúng tôi khảo sát sự thay đổi diện tích pic sắc ký theo bước sóng của detector. Tiến hành bơm mẫu hỗn hợp 5 chất trong vùng điều kiện tách nhưng ở bước sóng khác nhau. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.1: Bảng 3.1: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector Bước sóng (nm) Diện tích pic (mAu.s) SGU MTD SMP SDO SMX 250 120360 36755 67201 77893 26946 255 120847 29482 70006 98663 43966 260 126935 23994 78870 109666 57835 265 121732 31364 102974 118734 64626 270 104070 38972 103742 128234 69567 275 86846 38018 90669 127522 64446 280 65296 43211 77747 117375 46194 285 48611 56150 64389 104110 40153 290 33492 63689 50176 72056 35132 295 25877 69590 30047 46784 30251 Dựa vào các số liệu trên chúng tôi tiến hành biểu diễn mối quan hệ trên đồ thị. Kết quả biểu diễn như trong hình 3.2: Hình 3.2: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector Qua đồ thị chúng tôi thấy: tại bước sóng 270nm các chất SGU,SMP,SDO, SMX đều đạt diện tích pic cực đại, tuy nhiên đối với MTD tại bước sóng 270nm thì diện tích chưa đạt cực đại. Khảo sát thêm khoảng bước sóng 300 – 330nm đối với MTD, chúng tôi thấy MTD đạt diện tích cực đại tại bước sóng 320nm(Spic = 258931 mAu.s). Kết quả sự phụ thuộc của diện tích pic vào bước sóng phù hợp với việc quét phổ hấp thụ UV- Vis riêng rẽ các chất. Như vậy, để định lượng tốt nhất 5 chất phân tích, chúng tôi đặt detector ở 2 kênh 270nm và 320nm trong quá trình chạy sắc ký. 3.1.2. Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18 Thời gian lưu được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Thời gian lưu phụ thuộc vào: Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp..) Pha động chạy sắc ký( loại dung môi, thành phần, tốc độ) Bản chất và cấu trúc phân tử của các chất phân tích. Môi trường pH của pha động. Muốn tách và xác định đồng thời các chất phân tích, chúng ta phải biết thứ tự xuất hiện pic của các chất. Vì vậy, việc khảo sát thời gian lưu là cần thiết và được thực hiện như sau: Pha 5 dung dịch chuẩn nồng độ 1,0ppm trong pha động chạy sắc ký (20% ACN – 80% dung dịch đệm axetat, nồng độ dung dịch đệm 10mM, pH=4,5). Nhiệt độ: 30oC. Tốc độ pha động: 1ml/phút. Detecto UV-Vis: 2 kênh 270nm và 320nm. Sau đó tiến hành chạy sắc ký trong cùng điều kiện đã chọn. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.3: a/SGU b/MTD c/SMP d/SDO e/SMX Hình 3.3: Thời gian lưu của các chất phân tích Bảng 3.2: Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích TT Thời gian lưu tRi (phút) Chất phân tích 1 3,30 SGU 2 4,48 MTD 3 8,49 SMP 4 13,23 SDO 5 15,08 SMX Dựa vào việc khảo sát thời gian lưu đối với các chất phân tích chúng tôi biết được thời gian lưu cụ thể của từng chất làm cơ sở cho quá trình phát hiện định tính rồi định lượng các sulfamit, metronidazole trong các đối tượng nghiên cứu sau này. 3.2. Chọn pha tĩnh Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định tới hiệu quả tách. Bản chất pha tĩnh quyết định cơ chế tách và khả năng lưu giữ của chất tan. Tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà chọn loại pha tĩnh, kích thước hạt nhồi, chiều dài cột cho phù hợp quá trình sắc ký. Hệ pha ngược được ứng dụng phổ biến do độ ổn định, độ lặp lại và khả năng tách được nhiều loại chất. Ngoài ra dung môi khi sử dụng cho pha ngược có tính kinh tế hơn. Để nghiên cứu tách và xác định các SAs, MTD đa phần là chất phân cực do đó chủ yếu các công trình công bố đều sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo như RP- C4, RP – C12 .Cột RP – C18 với kích thước hạt nhồi 5µm của hãng Sulpenco- Australia được chọn để tách các chất trên. 3.3. Tối ưu hoá pha động 3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động Các giá trị nồng độ dung dịch đệm được lựa chọn khảo sát trong khoảng 2 – 20mM. Điều kiện đo như sau: Pha tĩnh RP – C18 Nhiệt độ cột tách 300C Nồng độ các SAs: 1,0ppm Bước sóng của detector: 270nm, 320nm pH của dung dịch đệm: pH = 4,5 Tốc độ pha động: F = 1 ml/phút Sau khi chạy sắc ký tiến hành thiết lập mối quan hệ giữa hệ số dung tích của các chất phân tích và nồng độ dung dịch đệm trong pha động. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.4: Bảng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat của pha động Nồng độ đệm (mM) Hệ số dung tích k’ SGU MTD SMP SDO SMX 2 0,84 1,28 2,32 3,82 4,19 5 0,78 1,25 2,24 3,72 4,10 10 0,80 1,23 2,21 3,59 3,98 15 0,79 1,22 2,16 3,50 3,88 20 0,78 1,18 2,04 3,29 3,63 Hình 3.4: Sự phụ thuộc của k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động (a) (b) (c) (d) (e) Hình 3.5: Pic sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác nhau a. 2mM b. 5mM c. 10mM d. 15mM e. 20mM Dựa vào bảng kết quả và đồ thị nhận thấy: khi thay đổi nồng độ dung dịch đệm thì hệ số dung tích của nó hầu như không thay đổi. Hơn nữa, nhìn trên sắc đồ thì nồng độ đệm không có sự ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng tách và thời gian xuất hiện pic, diện tích pic sắc ký. Tại một nồng độ dung dịch đệm nhất định trong pha động hệ số dung tích của các chất phân tích có sự khác nhau rõ rệt, như vậy đã có sự tách tốt giữa các chất trong quá trình sắc ký .Với khoảng nồng độ đệm tiến hành khảo sát thì pic sắc ký đều rất sắc nét và riêng biệt. Dựa trên những nhận xét đó nồng độ dung dịch đệm thích hợp trong pha động được lựa chọn là 10mM. 3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat Ảnh hưởng của pH có ý nghĩa rất lớn đối với sắc ký trao đổi ion và cặp ion, tuy nhiên trong một số trường hợp hấp thụ pha ngược yếu tố này cũng thể hiện rất rõ, nhất là pha động có chứa nước. Dựa vào tính chất của chất đã phân tích dung dịch đệm thường được dùng để tách các chất thuộc họ SAs là: hệ đệm phot phat, hệ đệm amoni axetat hoặc pha loãng các axit hữu cơ với các chất cải biến hữu cơ (organic modifiers) ở pH nằm trong khoảng 2,1 đến 5,5. Do tính chất của các chất phân tích là chất lưỡng tính giá trị pKa nằm trong khoảng 5,4 đến 7,4 do đó việc sử dụng dung dịch đệm có tính axít thường thu được các píc sắc ký sắc nét. Với lý do như vậy chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pKa=4,75 ở vùng nồng độ 10mM với các giá trị pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5. Sau đó lựa chọn dung dịch đệm có pH phù hợp dựa vào mối quan hệ giữa hệ số dung tích và pH tiến hành khảo sát ở trên và píc sắc ký ở các giá trị pH đó. Kết quả thu được đối với các chất phân tích như sau: Bảng 3.4: Hệ số dung tích ở các giá trị pH khác nhau pH Hệ số dung tích k' SGU MTD SMP SDO SMX 3,5 0,57 1,43 2,76 4,98 5,61 4 0,56 1,15 2,64 4,78 5,42 4,5 0,53 1,12 2,65 4,76 5,35 5 0,54 1,16 2,77 4,59 5,03 5,5 0,53 1,11 2,55 3,45 3,55 Từ số liệu trên ta xây dựng đồ thị sự phụ thuộc k’ vào pH như sau: Hình 3.6: Sự phụ thuộc của k’ vào pH của pha động (a) (b) (c) (d) (e) Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký ở pH khác nhau a. pH = 3,5 b. pH = 4,0 c. pH = 4,5 d. pH = 5,0 e. pH = 5,5 Nhìn vào bảng kết quả và pic sắc ký ở khoảng pH đã khảo sát chúng tôi thấy: pH càng cao thì khả năng tách 2 chất SMX và SDO kém (pH=5,5). pH thấp thì thời gian rửa giải lâu (pH=3,5). Tại giá trị pH = 4,5 các pic sắc ký có sự tách biệt rõ rệt hơn, pic cân đối và không mất nhiều thời gian xuất hiện pic sắc ký. Mặt khác, dựa trên đồ thị nhận thấy ở pH này có sự khác nhau rõ rệt về hệ số dung tích cuả các chất phân tích. Như vậy, pH của pha động được chọn là 4,5 cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động Tỉ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột tách. Khi tỉ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung tích của chất phân tích. Khảo sát với các tỉ lệ khác nhau với thành phần pha động đã lựa chọn gồm dung dịch đệm axetat có pH=4,5 và dung dịch hữu cơ Acetonitrin (ACN) thay đổi tỉ lệ thành phần pha động theo điều kiện sau: Pha tĩnh: RP – C18 Nhiệt độ cột tách: 300C Nồng độ các SAs: 1,0ppm Bước sóng của detector: 270nm, 320nm pH của dung dịch đệm: pH=4,5 Nồng độ dung dịch đệm: 10mM Tốc độ pha động: F =1 ml/phút Sau khi chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu của các SAs đã thiết lập được mối quan hệ giữa hệ số dung tích của các SAs vào tỉ lệ thành phần pha động. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.5 và hình 3.8: Bảng 3.5: Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha động %ACN Hệ số dung tích k' SGU MTD SMP SDO SMX 10 0,65 4,16 15,3 28,03 32,97 15 0,6 1,7 4,93 9,08 9,89 20 0,53 1,11 2,62 4,72 5,24 25 0,48 0,81 1,65 2,87 3,18 30 0,44 0,63 1,65 1,14 2,09 Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha động (a) (b) (c) (d) Hình 3.9: Sắc đồ pic sắc ký tại các tỉ lệ thành phần pha động khác nhau a. 15%ACN – 85% đệm b. 20%ACN – 80% đệm c. 25%ACN – 75% đệm d. 30% ACN – 70% đệm Khi tăng dần tỉ lệ thành phần trong pha động thì thời gian rửa giải chất ra khỏi cột nhanh hơn, hệ số dung tích gần nhau hơn, trên sắc đồ các chân pic sắc ký lại không tách biệt rõ ràng, ảnh hưởng đến diện tích pic sắc ký (ví dụ như tỉ lệ 30% ACN – 70% đệm). Tuy nhiên, nếu tỷ ACN thấp quá thì sẽ mất rất nhiều thời gian để rửa giải chất phân tích. Vì vậy, chúng ta nên chọn tỷ lệ sao cho thời gian rửa giải không quá nhanh, không quá chậm, pic rõ ràng. Với những nhận xét như vậy chúng tôi lựa chọn tỉ lệ pha động gồm 20% ACN – 80% đệm là tỉ lệ phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.4. Tốc độ pha động Cùng với yếu tố thành phần pha động, thì tốc độ pha động khi chạy sắc ký cũng ảnh hưởng không ít đến kết quả tách sắc ký. Tốc độ pha động cũng là yếu tố quyết định đến quá trình rửa giải các chất trong cột sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa hai pha tĩnh và pha động. Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng pic, thời gian rửa giải các chất lớn làm giảm tính kinh tế của phương pháp. Nhưng tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng, chen lấn pic. Vì vậy cần chọn được tốc độ pha động phù hợp. Đối với một hệ pha tĩnh và thành phần pha động đã lựa chọn thì khả năng tách các chất phụ thuộc vào tốc độ pha động. Đối với một cột tách xác định thì sẽ có một tốc độ tối ưu. Tiến hành khảo sát tốc độ pha động trong khoảng từ 0,6 – 1,4 ml/phút với các điều kiện tối ưu tiến hành khảo sát ở trên (dung dịch đệm axetat có pH=4,5; nồng độ đệm 10mM; thành phần pha động gồm 20% ACN- 80% đệm), kết quả thu đư