Đề tài Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Câu - Đồng Hỷ - Thái Nguyên

áng bệnh cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại... kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [16]. Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ... Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng XK từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như polixin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium moniliforme... [16]. Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng XK có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [1]. Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được từ đất chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [4]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định. Ngoài công tác bảo vệ thực vật thì CKS còn được sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản, công nghệ thực phẩm… Các loại CKS thường được sử dụng trong chăn nuôi như: biomycin, terranycin, tetracyclin, bacitrcin… để phòng chống, điều trị bệnh và tăng trọng cho gia súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm cho chúng khỏe mạnh tăng trưởng tốt. Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở quy mô 12 tấn /năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng 15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 - 7% [1]. Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng CKS kết hợp với công nghệ làm lạnh có thể làm tăng thời gian bảo quản của thực phẩm mà không gây độc hại cho con người. Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảo quản thực phẩm như: clotetracyclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Các chất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để tác động lên cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị. Vì vậy để khắc phục tồn tại trên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải tuân theo đúng nguyên tắc. 1.5. Khả năng tổng hợp enzym ở vi sinh vật 1.5.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzym Enzym là chất xúc tác sinh học do tế bào tổng hợp nên và chúng có vai trò rất quan trọng, quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào. Việc sản xuất và sử dụng enzym đã có từ lâu ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, chỉ sau khi con người chứng minh được khả năng xúc tác của enzym ngoài tế bào thì việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzym mới thực sự phát triển mạnh mẽ. Ngày nay, nhiều loại enzym đã được sản xuất ra với sản lượng lớn và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con người đã tiến hành sản xuất chế phẩm enzym từ động, thực vật với khối lượng lớn (hàng vạn tấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, do lượng enzym trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế. VSV trái lại có thể tổng hợp được một lượng lớn các enzym khác nhau. Do vậy VSV là đối tượng chính được sử dụng để sản xuất enzym trong vòng 30 năm trở lại đây [22]. Hệ enzym ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầu hết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N2, S, Fe, CO2, CH4… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzym tương ứng [3]. Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm và chọn lựa những phức hệ enzym cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzym không thể khai thác được từ nguồn động vật và thực vật. Enzym VSV có hoạt tính cao hơn enzym từ các sinh vật khác do VSV có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh chóng, hàm lượng enzym trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được lượng lớn chế phẩm enzym. Việc lên men sản xuất enzym có thể triển khai trên quy mô sản xuất công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết, khí hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu đơn giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzym hiện nay chúng thường dùng các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của một số ngành sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzym nhờ VSV có khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh tế cao. VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay điều chỉnh hoạt lực của enzym) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi trường nuôi. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng hay điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có khả năng điều chỉnh phổ các enzym sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng lực sinh tổng hợp enzym hay làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngoài ra, so với nguồn enzym động vật và thực vật, đối với nhóm enzym ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thu enzym ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn. 1.5.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzym cao từ tự nhiên VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzym đa dạng và phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzym như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzym [19]. Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm, lựa chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzym mong muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzym chịu nhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV sinh enzym chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng sinh amylaza thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng sinh enzym chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọn chủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy. Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng trong sản xuất đòi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Tuy hiện nay có nhiều chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người. 1.5.3. Một số enzym vi sinh vật chủ yếu Tuy đã biết hơn 1000 loại enzym khác nhau nhưng cũng chỉ các enzym thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau, đó là các enzym amylaza, enzym cellulaza và enzym proteaza. Lượng các enzym sản xuất hàng năm: Proteaza từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, proteaza từ nấm mốc là 10 tấn/năm, pectinaza là 10 tấn/năm [22]. Các enzym này có ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn… Enzym được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên thế giới. - Enzym amylaza: enzym này bao gồm nhiều nhóm men khác nhau, đó là amylaza, glucoamylaza, glucozidaza, dextrinaza… Các enzym này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô, khoai, sắn... Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylaza có thể dùng để sản xuất alcohol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylaza và glucoamylaza, từ các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và sinh học. - Enzym cellulaza: Trong thập kỷ qua, enzym thuỷ phân cellulose ngày càng được quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzym này có khả năng thủy phân chất thải chứa celluloza, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocelluloza và celluloza trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác. Thí dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng ethanol [29]. - Enzym proteaza: Proteaza thuộc nhóm enzym thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và thịt. Proteaza có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Proteaza thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzym lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà proteaza được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối [30]. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Các mẫu đất được lấy ở những địa điểm khác nhau thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên. Từ đó phân lập được 92 chủng xạ khuẩn. 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Xạ khuẩn 92 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên. 2.2.2. Vi sinh vật kiểm định 7 chủng VSVKĐ nhận từ Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam và Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và Khoa Vi sinh vật - Bệnh viện Đa khoa TW - Thái Nguyên. (Bảng 2.1). Bảng 2.1. 7 chủng Vi sinh vật kiểm định Vi sinh vật kiểm định Cơ quan cung cấp VK G (+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tế Bacillus subtilis VTCC-B-888 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV VK G (-) Escherichia coli VTCC-B-883 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Nấm mốc Fusarium oxysporum VTCCF-1301 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Fusarium solani VTCCF-1302 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Aspergillus niger VTCCF-001 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.3.1. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose… của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất. - Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, FeSO4.7H2O… nhập từ Anh, Trung Quốc. - Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck (Đức). - Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)… của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất. 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị - KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan) - Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật) - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton - Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp - Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam… 2.3.3. Môi trường nghiên cứu * Môi trường gause 1 (g/l) (môi trường phân lập xạ khuẩn) - Tinh bột tan - 20 - FeSO4 - 0.01 - NaCl - 0.5 - Thạch - 20 - K2HPO4 - 0.5 - Nước cất vừa đủ 1 lít - MgSO4.7H2O - 0.5 - pH = 6,8 - 7 - KNO3 - 1 * Môi trường MPA (g/l) (môi trường nuôi vi khuẩn) - Cao thịt - 5 - Thạch - 20 - Pepton - 10 - Nước cất vừa đủ 1 lít - NaCl - 5 - pH = 7 -7,2 * Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l) (môi trường phân lập và giữ giống nấm) - Khoai tây - 200 - Nước cất vừa đủ 1 lít - Đường - 20 - pH = 7 - 7,4 - Thạch - 20 * Môi trường xác định hoạt tính enzym ngoại bào - Môi trường tinh bột tan (g/l) + Tinh bột tan - 2 + Thạch - 18 + Nước cất vừa đủ 1 lít. - Môi trường CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) (g/l) + CMC - 2 + Thạch - 18 + Nước cất vừa đủ 1 lít. - Môi trường casein (g/l) + Casein - 2 + Thạch - 18 + Nước cất vừa đủ 1 lít. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu đất Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất ở bề mặt từ 5 - 20 cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) trong 1 vùng 50 m2. Trộn đều các mẫu đất và đựng vào túi nilông đã khử trùng. Ngoài túi ghi rõ loại đất, ngày và nơi lấy mẫu [11]. Đất lấy về được phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ. 2.4.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 2.4.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3… 10-6. Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0,1ml dịch sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy ria 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1 để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause 1, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12]. Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng XK được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm màu trắng, Grey (Gy) nhóm màu xám, Red (R) nhóm màu đỏ, Yellow (Y) nhóm màu vàng, Green (Gn) nhóm màu xanh, Blue (B) nhóm xanh màu da trời, Violet (V) nhóm màu tím, và nhóm màu không xác định (X) [16, 17, 30]. 2.4.2.2. Phương pháp phân lập bằng que cấy vòng Pha đất với nước cất tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy lấy một vòng dịch huyền phù đất. Đặt que cấy vào một góc đĩa, ria thành đường zích zắc thứ 1. Thanh trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội sau đó đặt que cấy bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ 1, ria thành đường zích zắc thứ 2 có chiều khác với đường ria thứ 1. Thanh trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Đặt đầu que cấy bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ 2,ria đường zích zắc thứ 3 có chiều khác với đường ria 1 và 2 trên phần thạch còn lại. Phương pháp phân lập này thuận tiện cho sự phân lập lại để thuần chủng các giống bị nhiễm trong khi cấy giữ giống hoặc nghi ngờ giống chưa thuần chủng. 2.4.2.3. Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, đếm số lượng khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa petri, để từ đó tính số lượng tế bào trong 1 g đất. * Cách đếm: Đếm số khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa petri, trên mặt đáy phía ngoài của đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu các khuẩn lạc đã được đếm. Nếu số lượng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia mặt đáy thành các phần và đếm số khuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại. Không đếm các đĩa khuẩn lạc mọc quá dày không thể đếm được hoặc các đĩa bị nhiễm ảnh hưởng đến sự phát triển của XK. * Cách tính kết quả: Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào. Tuy nhiên trên thực tế khó có thể xác định được chính xác là một khuẩn lạc có thể được hình thành từ 1 hay nhiều tế bào. Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong 1 đơn vị thể tích, người ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 đơn vị thể tích” (CFU - Colony Forming Unit). Như vậy từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) có trong 1 g đất theo công thức sau: CFU/g = A x 1/K x 1/V Trong đó: A: Số lượng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng độ pha loãng. V: Thể tích dịch đất pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch. K: Độ pha loãng của dịch đất được cấy trên thạch. Số CFU/1 đĩa petri được coi là tốt để tính tổng số CFU/1g đất nếu khi cấy 0,1 ml dịch đất pha loãng trên môi trường đếm được từ 30 - 300/1 đĩa. 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh * Phương pháp thỏi thạch Đây là phương pháp nhằm sơ tuyển XK có HTKS. XK được nuôi cấy trên môi trường Gause 1, Gause 2, hoặc ISP4 trong hộp petri sau 5 - 7 ngày. Nuôi cấy VSVKĐ trên các môi trường thích hợp trong các đĩa petri (vi khuẩn nuôi trên môi trường MPA, nấm mốc nuôi trên môi trường PDA). Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có XK được nuôi cấy từ 5 - 7 ngày, sinh trưởng tốt, không bị nhiễm. Đặt các thỏi thạch lên bề mặt môi trường thạch đĩa đã cấy VSVKĐ. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 - 5 giờ để CKS khuếch tán rồi nuôi ở 28 - 300C. Đọc kết quả sau 24 giờ đối với vi khuẩn kiểm định, 48 - 72 giờ đối với nấm kiểm định. HTKS của mỗi chủng XK được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn: D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính của thỏi thạch. * Phương pháp đục lỗ Đây là phương pháp xác định HTKS của XK trong dịch lên men. Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể (bỏ thạch) trên máy lắc 220 vòng/phút sau 5 ÷ 7 ngày thì thu dịch kháng sinh thô từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng khoan nút chai khoan lỗ trên bề mặt thạch đã cấy VSVKĐ trong các đĩa petri. Nhỏ vào môi trường 0,1 ml dịch kháng sinh cần thử. Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch [7, 9, 14]. 2.4.4. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy truyền sang bình nón dung tích 250 ml có chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi trên máy lắc 220 vòng/phút ở 28 - 300C, trong khoảng thời gian từ 5 - 7 ngày. Sau đó thu dịch lên men và xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ. HTKS của các chủng XK được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn [15]. 2.4.5. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống Do mật độ của khuẩn lạc giảm dần theo độ pha loãng của dịch huyền phù nên ở các đĩa thạch có độ pha loãng thấp, các khuần lạc thường mọc tách rời nhau và có khả năng được hình thành từ một tế bào riêng rẽ. Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít tế bào từ các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa cấy vào các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause 1, để vào tủ ấm 28 - 300C trong thời gian từ 4 - 7 ngày, sau đó kiểm tra thật kỹ độ thuần chủng của các chủng giống, loại bỏ các ống bị nhiễm. Giữ các ống giống này trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 40C. Để bảo quản giống cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành cấy chuyển giống định kỳ 3 tháng một lần trên môi trường thạch nghiêng Gause 1, trước khi sử dụng cần cấy chuyển giống sang ống thạch mới [9]. 2.4.6. Phương pháp lên men xạ khuẩn Từ ống thạch nghiêng, giống đã được hoạt hóa được cấy sang các bình nón có dung tích 250 ml chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 300C trong thời gian 5 - 7 ngày. Sau đó thu dịch lên men, li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu riêng sinh khối và phần dịch. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà sử dụng phần dịch hay phần sinh khối: Xác định HTKS trong dịch lên men hay trong sinh khối tế bào [9]. 2.4.7. Xác định hoạt tính enzym của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch * Chiết dịch enzym Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể (bỏ thạch) trên máy lắc 220 vòng/phút sau 5 ngày thì thu dịch enzym từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, chiết dịch trong thì thu được dịch enzym thô. * Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau: - Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza) - Casein (xác định hoạt tính proteaza) - CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza). Chuẩn bị môi trường cơ chất - thạch gồm: 18g thạch, 2 g cơ chất, nước cất vừa đủ 1 lít. Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các đĩa petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3 mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dung dịch enzym cần thử, để ở tủ lạnh 40C khoảng 4 - 5 giờ cho enzym khuếch tán vào trong thạch, sau đó đặt vào tủ ấm 300C trong 24 giờ để enzym hoạt động phân giải cơ chất [14]. Nhuộm màu đĩa thạch bằng dung dịch lugol để kiểm tra khả năng phân giải cơ chất của enzym trong dịch lên men. Vòng cơ chất không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch. Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng thuỷ phân cơ chất, d là đường kính lỗ thạch. 2.4.8. Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzym Dịch nuôi cấy sau khi lọc được đun cách thủy ở 400C, 500C, 600C, 700C, 800C kéo dài 20, 40 và 60 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng được dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức: - Giá trị trung bình (): - Độ lệch chuẩn (): - Sai số m: Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập xạ khuẩn 3.1.1. Phân bố của xạ khuẩn ở trong đất Từ 19 mẫu đất thu từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Trại Cau, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 92 chủng XK thuộc chi Streptomyces. Số lượng và sự phân bố của XK trong đất được trình bày trên bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau Loại đất lấy mẫu Số lượng mẫu Tính chất của đất Thảm thực vật pH của đất Số lượng XK/g (CFU/g) Số chủng phân lập được Đất trồng chè 3 Cây chè 4.15 2 × 106 6 Đất trồng keo 6 Cây keo 4.88 6,83 × 106 22 Đất trồng màu 4 Ngô, khoai, mía 6.83 17 × 106 36 Đất trồng lúa 2 Cây lúa 5.64 7,5 × 106 10 Đất vườn 2 Cây ăn quả, đất rau 6.53 12 × 106 15 Đất đồi trọc 2 Bụi cỏ 4.06 1,5 × 106 3 Tổng 19 92 Từ kết quả trên bảng 3.1 cho thấy sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú và phụ thuộc nhiều vào đặc điểm, tính chất của từng loại đất. Xạ khuẩn thường phân bố nhiều ở các loại đất tơi xốp, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, có pH trung tính và độ ẩm thích hợp. Số lượng XK gặp nhiều nhất ở loại đất trồng màu và đất vườn. Đất trồng màu và đất vườn là những loại đất thường xuyên được cuốc xới, bổ sung nguồn dinh dưỡng và pH thích hợp. Tất cả các đặc tính này là điều kiện rất thuận lợi cho sự phân bố của XK. Vì vậy, số lượng XK phân lập được từ hai loại đất này cũng nhiều nhất. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh học của XK. 3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu Từ 92 chủng XK đã được phân lập và thuần khiết, chúng tôi nhận thấy màu sắc hệ khuẩn ty rất đa dạng. Có 7 nhóm màu xuất hiện với số lượng và tỷ lệ khác nhau, được thể hiện trên bảng 3.2, hình 3.1 và 3.2. Bảng 3.2. Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu Nhóm màu Số lượng chủng Tỷ lệ (%) Xám (Grey) 54 58,7% Trắng (White) 16 17,4% Hồng (Pink) 7 7,6% Nâu (Brown) 7 7,6% Tím (Violet) 4 4,3% Xanh (Blue) 3 3.3% Vàng (Yellow) 1 1,1% Tổng 92 100% Từ kết quả trên bảng 3.2 cho thấy như thường lệ, XK thuộc 2 nhóm xám và trắng vẫn chiếm ưu thế. Tỷ lệ các chủng XK thuộc nhóm xám chiếm 58,7%, tiếp đó là nhóm trắng chiếm 17,4%, các nhóm hồng, nâu chiếm 7,6%, nhóm tím chiếm 4,3%, nhóm xanh chiếm 3,3%, và nhóm vàng chiếm 1,1%. Kết quả của chúng tôi cũng rất phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả [6, 9, 20, 24] khi phân lập XK cũng đã nhận thấy nhóm màu xám là chiếm ưu thế. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của tác giả Vũ Hồng Kim khi phân lập XK từ đất Sơn La thì nhận thấy nhóm màu trắng chiếm ưu thế hơn, sau đó mới đến nhóm màu xám và các nhóm màu khác. Sự khác biệt này có thể do tính chất của đất, các vùng đất khác nhau có các điều kiện tự nhiên như: độ ẩm, độ màu mỡ, độ thoáng khí khác nhau nên các VSV nói chung và XK nói riêng có sự đa dạng về màu sắc khác nhau. Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng