Đề tài Ứng dụng của Protease trong công nghệ thực phẩm

m nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong kiểm tra chất lượng sữa. Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và tính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường. Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú và chiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa. Có thể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong công nghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin (chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa đông tụ… Ứng dụng trong việc sản xuất fomat: Hình 4: Sản xuất Fomat Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic. Đây là môt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và thích hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ. Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat. Protease được thu nhận từ một số vi sinh vật như Asp. candidus, P. roquerti, Bac. mesentericus,… Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat Nhóm Nguồn gốc Tên enzyme Động vật Dạ dày bê Chymosin A, pepsin và gastriscin Dạ dày cừu Chymosin và pepsin Dạ dày dê Chymosin và pepsin Dạ dày heo Pepsin A, B và gastricin Thực vật Cynara cardunculus Cyprosin 1, 2, 3 hoặc cardosin A, B Vi sinh vật Rhizomucor miehei Aspartic protease R. pusillus Cryphonectria parasitica Vi sinh vật chuyển gen Chymosin từ bê Aspergillus niger Chymosine B Kluyveromyces lactis Rennin: Khái niệm chung: Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoá ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin. Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê… mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê. Khi con vật lớn hơn 5 tháng tuổi, bắt đầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng pepsin. Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin cố định trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền [3]. Phân loại: Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3. Rennin đặc biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein của sữa). Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh thể hình lập phương. Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có gắn glycine trong mạch có vòng cacbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động. Trong thành phần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có tính acid nhưng ít hơn pepsin. Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin. Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin: Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4,5. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường kiềm. Đặc hiệu thuỷ phân: Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amin. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và phenylalanine. Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH = 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số liên kết peptit trong phân tử casein. Sự hoạt hoá prorennin thành rennin: Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữ lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme. Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH < 3 quá trình chuyển hoá từ prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh. Nhưng quá trình hoạt hoá prorennin không phải là quá trình tự xúc tác và peptit được giải phóng ra không thể có tác động kìm hãm với rennin. Các yếu tố ảnh hưởng: Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưu của rennin nằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tuỳ theo cơ chất vào khoảng 3,4 – 4. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH = 3,7, các ion Ca2+ làm tăng hoạt độ rennin, những cation hoá trị 1+ làm giảm hoạt độ của nó. Ở pH = 7 có sự tự phân huỷ và hoạt tính thuỷ phân của rennin ở pH này rất thấp. Hoạt tính bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao. Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dần nhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng. Bảo quản rennin: Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu trắng đến nâu nhạt. Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC. Dịch rennin được bảo quản ở nồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene – glycol để bảo quản. Thu nhận enzyme rennin: Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi. Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%. Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏ khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điều kiện cho quá trình trích ly. Chiết enzyme và chỉnh pH = 4: Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày động vật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết tách enzyme. Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân. Cả hai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid. Phương pháp 1: phương pháp chiết: dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền ngâm vào nước 5% butanol hay glycerin có cloroform để tránh nhiễm khuẩn, thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường. Sau đó chế hoá bằng etanol để rennin kết tủa. Phương pháp 2: phương pháp tự phân: Niêm mạc dạ dày xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hoá prorennin thành rennin. HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật giúp prorennin được hoạt hoá thành rennin. Thời gian tự phân 30 giờ ở 40 – 42oC. Dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường về 4 sẽ cho hoạt tính enzyme cao, khả năng hoà tan tốt. Chiết enzyme dựa theo phương pháp tự phân do phương pháp này có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào, hiệu suất thu enzyme cao hơn phương pháp chiết 5–7 lần. Phối trộn NaCl 12% vào dạ dày bê theo tỉ lệ 1: 3 giúp cho quá trình chiết tách . Khuấy: khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri benzoat 1% để tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hoá,.. Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn để thu được dịch enzyme. Kết Tủa: tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối NaCl nồng độ bão hoà 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ đến khi dung dịch bão hoà, để tủ lạnh 20 phút. Tủa bằng muối trung tính có nồng độ cao để kết tủa thuận nghịch enzyme mà không làm giảm hoạt tính của chúng. Ngoài ra, có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol… Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính enzyme. Do đó, dung dịch sau tự phân đã lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5–10 phút, nhiệt độ thấp 0–5oC. Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm lạnh ở 4oC, trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa. Tinh sạch enzyme rennin: Có thể sử dụng hai phương pháp sau: Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm (cellophan) Nguyên tắc: Màng bán thấm (cellophane) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dùng để tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến khi đạt cân bằng nồng độ. Cho dịch rennin thô vào giấy cellophan, đặt vào nước cất lạnh có nhiệt độ 0–4oC, khuấy và thay nước cất lạnh cho đến khi thử âm tính với AgNO3, thời gian thẩm tích khoảng 2 ngày đêm. Phương pháp 2: phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G–50 Nguyên tắc: Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng. Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau. Sấy đông khô: Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: Nguyên tắc của phương pháp sấy đông khô là tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nước). Nhờ vậy, nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu. Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1– làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp. Giai đoạn 2– sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống -40oC để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh. Giai đoạn 3– sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa. Tính chất của sản phẩm sấy đông khô: Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng, mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp cho enzyme giữ nguyên được tính chất hoá lý và có thể bảo quản trong thời gian dài. Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng. Quy trình chế biến fomat: Giai đoạn lên men sữa, kết tủa casein: Sữa sau khi đã thanh trùng Pasteur ở 85 – 95oC từ 15 - 20 phút, dùng chế phẩm men Rennin và vi khuẩn lactic để kết tủa sữa. Vi khuẩn lactic lên men sinh ra acid lactic, làm giảm pH môi trường tạo điều kiện thuận lợi để casein kết tủa và enzyme Rennin giúp cho sự kết tủa casein tốt hơn, casein lắng xuống và thu được fomat. Ngoài tác dụng kết tủa, Renin còn thủy phân một phần casein thành pepton, acid amin… Chú ý: Thanh trùng để tiêu diệt các loại vi trùng là cần thiết. Tuy nhiên, thanh trùng đã phá vỡ cân bằng giữa các muối, làm giảm hàm lượng muối calci mà kết quả là làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng men sữa (rennin). Để khắc phục nhược điểm này, người ta phải bổ sung calci dưới dạng CaCl2. Giai đoạn ép nén tách huyết thanh: Phần casein kết tủa được ép từ 20 - 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 50oC. Trong thời gian này sự lên men lactic vẫn tiếp tục mạnh mẽ. Sau khi ép huyết thanh ra khỏi cục sữa kết tủa, Fomat lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid. Huyết thanh sữa bị loại ra chứa lacto, lactalbumin, lactoglobulin… Giai đoạn muối fomat: Khối fomat sau khi tách huyết thanh sẽ cho vào bể nước muối nồng độ 24% ngâm trong vài ngày để tăng vị mặn, tạo sự đồng nhất về thành phần cho khối fomat và kìm hãm vi sinh vật có hại phát triển chủ yếu là trực khuẩn đường ruột. Giai đoạn ủ chín: Sau khi muối xong, khối fomat được chuyển vào hầm lên men ở nhiệt độ 18 – 22oC, độ ẩm 80 - 90%. Quá trình lên men chậm dần do đường lactoza đã bị tách hầu hết trong giai đoạn ép nén. Trong khối fomat, vi khuẩn Propionic hoạt động mạnh, lên men lactic thành acid propionic, acid acetic và CO2. Cả hai acid này làm cho Fomat có vị chua, hăng đặc biệt. Sự lên men propionic sẽ kết thúc sau 2 – 2,5 tháng. Giai đoạn này gọi là quá trình ủ chín. Tuy vậy, quá trình ủ chín Fomat vẫn được tiếp tục một thời gian nữa cho fomat hoàn toàn chín. Trong thời gian này casein tiếp tục được phân giải thành đạm dưới tác dụng của enzyme Rennin và vi khuẩn lactic. Khi fomat chín thì 2/3 casein được phân giải thành pepton, acid amin và một ít NH3. Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm và chống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acid amin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành acid amin, peptid. Thành phần đạm có trong nước mắm: Đạm toàn phần 13 – 30g/l Đạm formon 12 – 18g/l Đạm NH3 4 – 6g/l Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm Gồm 3 hệ enzyme lớn: Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ 5–7, pI = 4–5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+.. Hệ enzyme serin-protease: Điển hình là enzyme trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton). Hệ enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5–10, mạnh nhất ở pH=9. Hệ enzyme acid-protease: Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha Pha 1 (trong khoảng 25 ngày đầu): Có sự gia tăng thể tích của phần chất lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan. Pha 2 (80 – 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp xúc với enzyme, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích. Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 – 140 ngày. Pha 3 (140 – 200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ. Ngoài ra đường, chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid hữu cơ. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme serin–protease mất hoạt tính. Quá trình thủy phân kém. Vì vậy phải tạo một nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động. Nhiệt độ 30 – 47oC thích hợp cho quá trình chế biến chượp. Chượp càng phơi nắng nhiều nước mắm càng ngon, càng rút ngắn đườc thời gian “chượp chín” tăng hiệu suất thủy phân. Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong cá mất hoạt tính. Đây là yếu tố điều chỉnh tốc độ phản ứng cho enzyme xúc tác, đơn giản nhưng rất hiệu quả. pH: Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nước mắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm cho thấy: pH môi trường tự nhiên từ 5,5–6,5 enzyme trypsin và pepsin hoạt động được, đồng thời ở pH này có tác dụng ức chế một phần vi khuẩn gây thối. Vì vậy ở môi trường tự nhiên có pH thích hợp cho quá trình sản xuất nước mắm hơn. Lượng muối: Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước mắm, thiếu muối nước mắm không hình thành được. Yêu cầu của muối trong sản xuất nước mắm phải là loại muối ăn, càng tinh khiết càng tốt, kết tinh hạt nhỏ có độ rắn cao, màu trắng óng ánh (không vón cục, ẩm ướt, vị đắng chát). Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein nhanh hơn, chượp mau chín. Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế làm mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài (protein bị kết tủa bởi muối trung tính bão hòa). Thường lượng muối cho vào khoảng 20–25% so với khối lượng cá. Nên thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối, tỉ lệ muối của mỗi lần và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước mắm. Diện tích tiếp xúc: Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có sự tiếp xúc tốt giữa enzyme và cơ chất. Các enzyme trong cá tập trung nhiều ở nội tạng, nên để tăng tốc độ thủy phân người ta tìm cách tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và thịt cá. Có thể dùng các biện pháp: Phương pháp xay nhỏ cá: Ưu điểm: xay nhỏ cá diện tích tiếp xúc lớn, enzyme phân tán. Nhược điểm: protein dễ bị biến tính do tác dụng cơ học, làm nồng độ enzyme loãng ra. Phương pháp đập dập: Ưu điểm: Cá đập dập sẽ giữ được hình dạng ban đầu, cơ thịt bên trong bị mềm ra, tổ chức cơ thịt lỏng lẻo giúp enzyme dễ ngấm vào trong thịt. Cá đập dập xương cá không bị vỡ vụn, khi chượp chín kéo rút dễ dàng. Phương pháp cắt khúc: Nhược điểm: thịt cá vẫn còn chắc nên enzyme khó ngấm vào hơn phương pháp đập dập, protein ở mặt ngoài dễ bị biến tính do tiếp xúc với dung dịch có nồng độ muối cao. Như vậy, để tăng diện tích tiếp xúc sử dụng phương pháp đập dập kết hợp với đánh khuấy chượp là tốt nhất. Bản thân nguyên liệu: Những loài cá khác nhau, thành phần hóa học và cấu trúc cũng khác nhau, nhất là hệ enzyme trong cá vì vậy tạo ra loại nước mắm có chất lượng khác nhau. Cá tươi chế biến chất lượng tốt hơn cá ươn. Loại cá có kết cấu cơ thịt lỏng lẻo, mềm mại, ít vảy dễ chế biến hơn loại cá cứng, chắc, nhiều vảy. Nếu cá có nhiều mỡ thì nước mắm có mùi ôi khét khó chịu, mùi chua (do sự thủy phân chất béo thành acid béo và glycerid) hoặc khét do oxy hóa chất béo.. Các phương pháp chế biến nước mắm Phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền Nguyên lý: Sử dụng enzyme protease có sẵn trong trong nguyên liệu cá [9] ban đầu( do vi sinh vật trong ruột cá và mang cá), thủy phân protein cá thành axit amin. Có 3 phương pháp chế biến chượp cổ truyền * Phương pháp đánh khuấy: - Cho muối nhiều lần, - Cho nước lã, - Đánh khuấy liên tục. * Phương pháp gài nén: - Cho muối một lần hoặc nhiều lần, - Không cho nước lã, - Gài nén và không đánh khuấy. * Phương pháp hỗn hợp: - Kết hợp giữa 2 phương pháp gài nén và đánh khuấy, - Lúc đầu thực hiện phương pháp gài nén, - Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy. Phương pháp: Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền Ưu điểm: nước mắm có hương vị thơm ngon đặc trưng, không gây hại cho sức khỏe. Nhược điểm: thời gian lên men dài, có độ đạm thấp (khoảng 30 độ). Chế biến nước mắm sử dụng protease vi sinh vật Nhằm khắc phục thời gian sản xuất nước mắm cổ điển quá dài (khoảng 9 tháng), phương pháp mới chỉ 1-1,5 tháng. Nguyên lý: Trên cơ sở sản xuất nước mắm dân gian, dùng enzyme trong ruột, mang cá. Đồng thời bổ sung thêm các enzyme từ vi sinh vật bên ngoài nhằm tăng enzyme tổng số Các chế phẩm enzyme sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm mốc Asp. Orzyzae dạng bột, dạng lỏng. Phương pháp: Sơ đồ 3: Qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật * Xử lý: cá phải rửa sạch bùn, đất, tạp chất, cá to phải cắt nhỏ. * Thủy phân: Mốc: yêu cầu tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, hình thái khuẩn ty to và mập, tốt nhất là sau 2 ngày ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. Tỉ lệ giữa mốc và cá từ 3–4% tính theo chế phẩm mốc thô và cá xay nhỏ trộn với mốc. Nước: cho vào 5–10% để vừa đủ ngấm mốc, giúp men hoạt động tốt, nhiệt độ thủy phân 37–41oC, thời gian 10–15 ngày chượp sẽ chín. Muối: sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào 4-6% so với khối lượng cá Lọc: nước lọc và nước rửa bã bằng 30% so với khối lượng cá. Đun sôi: nhỏ lửa có tàc dụng khử mùi, vi sinh vật, chất bẩn. Thêm muối vào để đạt đến độ mặn nước chấm. Ưu điểm: Thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, giá thiết bị không cao, phù hợp điều kiện sản xuất ở địa phương, vốn đầu tư ban đầu không lớn. Không cần sử dụng thiết bị chịu axit, chịu kiềm, chịu áp suất và nhiệt độ cao. Không độc hại với công nhân và môi trưòng do không sử dụng hóa chất. Điều kiện sản xuất nhẹ nhàng, ôn hòa: nhiệt độ khoảng 30 – 45oC, pH trung tính (hay acid yếu hay kiềm yếu), áp suất thường. Không tổn hao acid amin trong quá trình sản xuất Nhược điểm: Hiệu suất thủy phân không cao. Thời gian và quy trình sản xuất kéo dài hơn phương pháp hóa giải, cần thêm công đoạn nuôi mốc giống cho quá trình thủy phân. Phương pháp cho muối nhiều đợt và thêm H2O: Phương pháp cho muối nhiều đợt là làm cho protease không bị ức chế bởi nồng độ NaCl cao ngay từ đầu, ở nồng độ muối thấp, quá trình thủy phân xảy ra với tốc độ cao hơn. Người ta còn cho thêm nước vào khối cá và muối ướp, tác dụng làm khối cá được mềm, loãng ra, dễ dàng thủy phân hơn. Tỉ lệ nước – muối thường theo bảng sau: Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá Loại cá Cá (kg) Nước (lit) NaCl (kg) Cá to 20cm 100 20 – 30 36 – 39 Cá vừa 8cm 100 15 – 25 35 – 36 Cá nhỏ 2 – 5cm 100 10 – 20 30 – 35 Ướp muối đợt 1: làm cho nồng độ muối chung giảm đi, khối cá loãng hơn và tạo điều kiện thích hợp cho sự thủy phân protit cá của enzyme vi sinh vật. Ướp muối đợt 2, 3: Sự cho muối lần 2, 3 đúng thời gian rất quan trọng, quyết định chất lượng nước mắm thành phẩm. Toàn bộ thời gian cho muối đợt 1 đến 4 là 15 – 25 ngày (mùa hè); 20 – 30 ngày (mùa đông). Cá ướp muối, được phơi nắng, khuấy đều luôn, với nhiệt độ ấm, sự thủy phân sẽ nhanh hơn. Cơ sở khoa học phương pháp này là: Sự cho nước thêm vào chượp: tác dụng làm loãng nồng độ muối, làm loãng chượp tạo điều kiện cho enzyme hoạt động tốt. Cho muối nhiều đợt: mục đích cho muối là để khống chế kìm hãm hoạt động của vi sinh vật gây thối. Nhưng nếu cho tất cả lượng muối cần cho sản xuất nước mắm vào một lúc thì nồng độ muối cao ngay từ đầu sẽ ức chế đối với hoạt động của enzyme protease. Enzyme này chỉ hoạt động tốt khi không có muối hay muối lạt, mặt khác với nồng độ muối cao thịt cá sẽ chắc lại khó thủy phân, do vậy làm chậm tốc độ thủy phân protit cá. Nhược điểm: cho nước dễ tạo điều kiện xâm nhập, hoạt động vi sinh vật gây thối. Cần theo dõi sát sao quá trình sản xuất các hiện tượng bất thường, tạo mùi vị xấu… để bổ sung kịp thời NaCl ngăn chặn sự hư hỏng chượp cá. Protease trong công nghệ sản xuất tương [1] Xì dầu hay nước tương (phương ngữ miền Nam Việt Nam) là một loại nước chấm được sản xuất bằng cách lên men hạt đậu tương, ngũ cốc rang chín, nước và muối ăn. Nước chấm này, có nguồn gốc từ Trung Quốc, được sử dụng khá phổ biến trong ẩm thực châu Á tại khu vực Đông Á và Đông Nam Á. Trong công nghiệp nước tương thường được sản xuất từ bánh dầu đậu phộng (bã đậu phộng sau khi đã ép dầu) hoặc bánh dầu đậu nành (bã đậu nành). Sản xuất nước chấm lên men nhìn chung bao gồm các giai đoạn sau: Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm Nước tương có thể được chế biến theo 2 phương pháp chủ yếu: phương pháp lên men vi sinh vật và phương pháp thuỷ phân bằng hoá chất. 2.3.1 Phương pháp lên men vi sinh vật Nguyên lý: Chủ yếu dựa vào tác dụng của Enzym thu được từ mốc giống đã chọn lọc, nuôi cấy để thuỷ phân protid và glucid của nguyên liệu thực vật. Phương pháp: Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật Mốc giống được nuôi trong môi trường thạch sẽ được nhân ra và cấy vào hỗn hợp khô đậu tương (bã đậu nành) hoặc khô lạc (bánh dầu đậu phộng) và bột mì (bột làm bánh mì chớ không phải bột khoai mì) đã hấp chín, đánh tơi ra và để nguội. Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylaz, invertaz, maltoz, proteaz và cataz có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin. Ủ mốc ở nhiệt độ ấm (30 – 380C), nơi thoáng khí, có độ ẩm tương đối của không khí hơn 90%. Khi giai đoạn phát triển mốc kết thúc, làm tơi nguyên liệu đã lên mốc, pha trộn vào đó dung dịch nước muối 20% theo tỷ lệ từ 25 – 30% và đem ủ ấm ở nhiệt độ 50 – 600C. Sau đó chiết rút và pha tiếp nước muối vào và tiếp tục chiết r