Đề tài Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương

PHẦN I MỞ ĐẦU Lí do chọn đề tài Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quí hiếm [1]. Đặc trưng của rừng nhiệt đới là sự đa dạng về loài, song thường là các loài hiếm do kích thước quần thể nhỏ, mật độ thấp, nhiều loài bị suy giảm mạnh do tàn phá rừng. Hiểu biết của con người về mối tương tác và sự phụ thuộc lẫn nhau giữa các loài trong hệ sinh thái còn ít. Do vậy những nghiên cứu để bảo tồn đa dạng sinh học cần phải tiến hành đồng thời với việc bảo tồn hiệu quả giữa các loài và hệ sinh thái. Bảo tồn nguồn gen thực vật là việc cấp thiết và thường xuyên nhằm bảo vệ đa dạng sinh học ở nước ta [12], [13]. Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam có rất nhiều cây thuốc quí, trong số đó cây Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv. ) là một trong những loài thực vật trong danh mục cần được bảo tồn của Vườn Quốc gia Cúc Phương [11], [14]. Ngoài công dụng chữa một số bệnh thông thường như trị ghẻ, sâu đốt, ngộ độc thức ăn hay bệnh vàng da thì cây Mắt trâu còn phục vụ cho công tác nghiên cứu tìm ra hoạt chất phòng và chống bệnh [9], [41], [42]. Theo Ma và cộng sự thì trong dịch chiết vỏ thân cây Mắt trâu phân tích được micromeline, 5 hợp chất alkaloids mới có khả năng kháng chủng vi khuẩn H37Rv gây bệnh lao [32]. Bên cạnh đó, cây Mắt trâu còn có giá trị về mặt bảo tồn quần thể thực vật Vườn Quốc gia Cúc Phương. Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu sâu về tác dụng chữa bệnh của cây Mắt trâu. Vì vậy, cần có những nghiên cứu đầy đủ hơn về ứng dụng cũng như nhân giống và bảo tồn loài cây này. Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương. Mục đích, nội dung nghiên cứu Mục đích Xây dựng qui trình hoàn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro cây Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv.) của Vườn Quốc gia Cúc Phương. Nội dung Khử trùng được mẫu sạch để nuôi cấy in vitro. Xác định công thức môi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro. Xác định công thức môi trường thích hợp tạo cây in vitro hoàn chỉnh. Xác định giá thể thích hợp cho cây in vitro nuôi trồng ngoài tự nhiên. PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Mắt trâu Cây Mắt trâu có tên khoa học là Micromelum hissutum Oliv. Thuộc bộ: Rutales (Cam) Họ: Rutaceae (Cam) Đặc điểm sinh học, sinh thái Mắt trâu là cây gỗ nhỏ có thể cao đến 6m. Thân ít phân cành, cành có nhiều lông nhung, màu hung, lá màu xanh sẫm, kép lông chim lẻ, lá chét từ 5 - 9, mọc so le, thuôn mũi mác hay mũi mác, dài 1,7 - 13cm, rộng 1 - 5cm, không cân ở góc và mũi nhọn sắc, đài dài, hơi có răng, có lông nhung ở mặt dưới. Hoa trắng, hay vàng xanh, thành cụm hoa phủ lông nhung, ngắn hơn lá, cánh hoa có lông cứng. Quả nạc dạng bầu dục, màu đỏ, cam hay hung và có mùi thơm. Mùa hoa tháng 1 - 4, mùa quả chín tháng 4 - 5 [2], [6], [34]. Cây Mắt trâu phân bố ở một số khu vực như Ninh Bình, Nha Trang, Hòa Bình, Thanh Hóa. Loài cây này cũng được tìm thấy ở Ấn Độ, Malayxia, Lào, Campuchia, Thái Lan [8], [39]. Lá cây Mắt trâu dùng trị bệnh ghẻ, nấu xông chữa bệnh vàng da hay ngộ độc thức ăn. Sử dụng lá giã ra cùng với lá me sau đó thêm ít muối dùng đắp vào da làm dịu đau khi bị sâu đốt. Theo nghiên cứu của các tác giả Ma và Cộng sự (2005) trong dịch chiết của vỏ cây Mắt trâu (Micromelum hissutum Oliv.) chứa chất có khả năng kháng chủng vi khuẩn gây bệnh lao H37Rv. Các thí nghiệm đang trong giai đoạn thử nghiệm trên chuột [32], [42]. Cây Mắt trâu nằm trong danh sách các loài thực vật cần được bảo tồn của VQG Cúc Phương. Vì vậy, mà ngoài giá trị về làm thuốc hay dùng trong nghiên cứu thì loài cây này còn đóng góp vốn gen của mình vào trong quần thể thực vật VQG Cúc Phương, hiện đang được lưu giữ và bảo tồn nguồn gen trong các phòng thí nghiệm [39], [41]. Trên thế giới, nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã bảo tồn thành công nhiều cây thuốc như Centella aistica, Rehmannia glutinosa [22], [38]. Năm 2009 Geetha và cộng sự đã thông qua phương pháp vi nhân giống hai loài cây Holostemma adakodien và Ipomoea mauritiana đồng thời cũng tuyên truyền cho người dân biết bảo tồn các cây thuốc quí trước thảm họa bị tuyệt chủng [27]. 2.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn gen thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn 100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng [16]. 2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng. Bao gồm: - Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành - Nuôi cấy cơ quan - Nuôi cấy phôi - Nuôi cấy mô sẹo - Nuôi cấy tế bào trần Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902. Theo quan niệm sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó: Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào ngược lại với sự phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Như vậy, kỹ thật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng). Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [7], [10], [16]. 2.2.2. Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu. Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 - 27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp giá thể sạch tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [5], [17]. 2.2.3. Phương pháp nhân đa chồi Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh [16]. Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao. Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến. Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động. Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [18]. Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước sau [10]: Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong in vitro 2.2.4. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô. Đặc tính của Auxin Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của các auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ ... Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) [18]. Đặc tính của cytokinin Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 - Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin ), zeatin (6 - (4 - hydroxy - 3metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước chồi nuôi cấy…
là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn [19]. 2.2.5. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt là đối với cây trồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Dưới đây là một số thành tựu đã đạt được. Trong nước Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt đới quí hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt đầu từ các cây Thông (Taxus sps.) là một loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số loài thực vật có giá trị làm thuốc [20]. Cây Màng tang (Litsea verticillata) là loại cây thân gỗ có chứa một số hợp chất có khả năng kháng HIV (+)- demethoxyepiercelsin và verticillatol [29], [40]. Tác giả Lê xuân Đắc và Cộng sự đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật [4]. Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) được biết là một vị thuốc quí trong việc chữa một số bệnh ung thư. Tác giả Lưu Trường Sinh và Cộng sự đã tạo ra cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [15]. Các tác giả Nguyễn Thanh Danh và Cộng sự (2005) đã nghiên cứu thành công nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.), sử dụng phôi hạt của quả Vù hương xanh thu hái trước khi chín 30 ngày đã nhân giống được cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh [3]. Thế giới Năm 2003, Bedir và Cộng sự đã vi nhân giống thành công giống Hydrastis Canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc nước Mỹ [23]. Cũng cùng năm 2003 Part và Cộng sự đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây thuốc Anemopaegma arvense trong ống nghiệm trên môi trường MS có chứa 4% đường sorbitol, kết quả sau 6 tháng mới phải cấy chuyển một lần [36]. Năm 2008 Balaraju và Cộng sự đã nhân giống và tái sinh in vitro thành công cây thuốc Vitex agnus castus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường MS có bổ sung 0,1mg/1ml IBA [21]. Gần đây những thành tựu trong việc hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây thuốc đang có nguy cơ bị tuyệt chủng như Gynura procumbens, Crotalaria verrucosa, Momordica tuberosa [24], [30], [33]. Năm 2009 bằng kỹ thuật vi nhân giống in vitro các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc nhân nhanh nhiều cây thuốc quí hiếm như Phyllanthus urinaria hay cây Givotia rottleriformis [31], [37]. Park và Cộng sự (2009) tái sinh thành công loài Rehmannia glutinosa quí hiếm đang bị khai thác quá mức [35]. Hiện nay những công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực tái sinh cây thuốc quí bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật vẫn đang được tiến hành. 2.2.6. Phương pháp bảo tồn thực vật quí hiếm Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật bị đe dọa có nguy cơ tiệt chủng, nhiều giống cây trồng bị thoái hóa không giữ được đặc điểm nguyên sơ ban đầu như chất lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, thì việc sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen là hết sức cần thiết. Bảo quản trong điều kiện in vitro được coi là giải pháp công nghệ có triển vọng đối với cây trồng nhân giống vô tính và cây có hạt dễ mất khả năng nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp. Bảo tồn in situ Là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất bao hàm các quần thể tái sinh nhân tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ cây mẹ mà không áp dụng có định hướng. Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các loài cây có phân bố rải rác, như vậy quần tụ bảo tồn được dùng làm nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo [12]. Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình thức bảo tồn in situ, song hai vấn đề được quan tâm là: - Có qui hoạch cụ thể và xác định vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao cho cá thể vẫn giữ nguyên được toàn bộ biến dị di truyền của loài. - Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới, xây dựng giống và phục vụ trồng rừng. Bảo tồn ex situ Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây sống, rừng trồng với mục đích bảo tồn [12]. Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là: - Thu thập các mẫu gen tiêu biểu; - Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài; - Làm tăng số lượng mẫu thu thập được; Khó khăn nhất trong bảo tồn ex situ là chi phí cao mà diện tích của một quần tụ bảo tồn được đề xuất với 10 ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ và được lượng biến dị đủ lớn nghĩa là thu hạt từ càng nhiều kiểu gen càng tốt. PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật Cây Mắt trâu được thu thập từ VQG Cúc Phương, do Trạm nghiên cứu khoa học - VQG Cúc Phương cung cấp. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ nghiên cứu là các trang thiết bị như: box cấy vô trùng, panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo PH, máy khuấy từ... (của các hãng chuyên dụng như: Sanyo, Metler Toledo, Satorius...). Hóa chất: Môi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog (1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP, IAA, NAA, kinetin, IBA... (của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck, Invitrogen...). Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27°C và chế độ chiếu sáng 12h/12h với cường độ chiếu sáng là 2000 lux. 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thời gian: Từ tháng 4/2008 đến 4/2010. 3.2. Phương pháp nghiên cứu Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau và có công thức đối chứng. Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. 3.2.2. Khử trùng mẫu Khử trùng mẫu bao gồm các bước sau: Cắt cành cây Mắt trâu thành đoạn dài 6 - 8 cm; Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng; Rửa sạch nước xà phòng loãng dưới vòi nước; Rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng; Rửa trong cồn 70 °C (Trong 15 giây); Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần; Khử trùng trong dung dịch 1% NaClO, lắc trong 10 phút; Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng; Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng; Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cắt tỉa thành những đoạn dài khoảng 1,0 - 1,5 cm có từ 1 - 2 đốt thân và được cấy vào môi trường MS. Sau khoảng 20 ngày, chồi non phát sinh in vitro các chồi non này được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo [4]. 3.2.3. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH = 5,8. Nhân đa chồi cây Mắt trâu Thí nghiệm 1: Thăm dò nồng độ BAP và NAA đối với khả năng tạo chồi Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ BAP và NAA thích hợp nhất cho sự tạo chồi. CT Môi trường  Chất KTST    BAP (mg/l)  NAA (mg/l)   ĐC  0  0   MT1  0,5  0,5   MT2  1,0  0,5   MT3  1,5  0,5   MT4  2,0  0,5   MT5  2,5  0,5   MT6  3,0  0,5   Thí nghiệm 2: Thăm dò nồng độ BAP và IBA đối với khả năng tạo đa chồi Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi và tăng trưởng chồi Mắt trâu. CT Môi trường  Chất KTST    BAP (mg/l)  IBA (mg/l)   ĐC  0  0   MT7  0,5  0,5   MT8  1,0  0,5   MT9  1,5  0,5   MT10  2,0  0,5   MT11  2,5  0,5   M12  3,0  0,5   Thí nghiệm 3: Thăm dò nồng độ BAP và kinetin đối với khả năng tạo chồi Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và kinetin đến khả năng tạo chồi cây Mắt trâu. CT Môi trường  Chất KTST    BAP (mg/l)  kinetin (mg/l)   ĐC  0  0   MK1  0,5  0,5   MK2  1,0  0,5   MK3  1,5  0,5   MK4  2,0  0,5   MK5  2,5  0,5   MK6  3,0  0,5   Các thí nghiệm 1, 2 và 3 được bố trí ở điều kiện: Nhiệt độ 25 - 27°C Cường độ ánh sáng 2000 lux Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l agar, pH = 5,8. Cành Mắt trâu được cắt toàn bộ lá chỉ giữ lại phần thân, thân được cắt thành đoạn có chiều dài 2 - 3 cm gồm 1 - 3 chồi nách. Nhân đa chồi bằng cách cấy thẳng đứng trên môi trường thạch, quan sát khi đếm: Số chồi phát sinh/mẫu. Công thức thích hợp sẽ được chọn để áp dụng cho các lần tạo đa chồi tiếp theo. 3.2.4. Tạo cây Mắt trâu in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra trồng ngoài tự nhiên. Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bên ngoài. Các chất kích thích sinh trưởng có tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay vào đó là chất kích thích sinh trưởng tạo rễ như IBA, NAA… Thí nghiệm 4: Thăm dò nồng độ IBA đối với khả năng tạo rễ Mục đích là khảo sát nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu CT Môi trường  Nồng độ IBA (mg/l)   ĐC  0   MTI1  0,3   MTI2  0,6   MTI3  0,9   MTI4  1,2   MTI5  1,5   Thí nghiệm 5: Thăm dò nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ Mục đích thí nghiệm là khảo sát nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu nhằm chuẩn bị đưa cây con khỏe mạnh ra ngoài vườn ươm. CT Môi trường  Nồng độ NAA (mg/l)   ĐC  0   MTN1  0,3   MTN2  0,6   MTN3  0,9   MTN4  1,2   MTN5  1,5   Trong các thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5 được bố trí ở điều kiện như sau: Nhiệt độ 25 - 27°C Cường độ ánh sáng là 2000 lux. Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l agar, pH = 5,8. Các chồi có kích thước 2 - 3 cm được sử dụng cấy thẳng đứng trên môi trường thạch. Chỉ tiêu quan sát: Số rễ/mẫu 3.2.5. Trồng cây trong bầu Đây là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này cây non cần sự thích nghi dần với điều kiện bên ngoài ống nghiệm. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần trong thời gian này cây non phải được bảo vệ và chăm sóc tốt trước những yếu tố bất lợi. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các giá thể đến hiệu quả trồng cây Mắt trâu Mục đích thí nghiệm là tìm ra giá thể thích hợp trồng cây Mắt trâu trong bầu Công thức  Thành phần giá thể  Tỷ lệ   1  Đất trồng cây  1   2  Đất trồng cây : Trấu hun  1:1   3  Trấu hun  1   Ghi chú: Đất trồng cây là hỗn hợp đất phù sa + 5% NPK + 15% mùn do Trại thực nghiệm sinh học cung cấp. 3.2.6. Các chỉ tiêu nghiên cứu Để đánh giá và tìm ra được môi trường thích hợp nhất chúng tôi sử dụng các chỉ tiêu sau: Tổng số mẫu tạo chồi Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy Tổng số chồi Số chồi TB/mẫu = Tổng số mẫu tạo chồi Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100 Tổng số chồi nuôi cấy Tổng số rễ Số rễ TB/chồi =