Đề tài Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con, tốc độ tăng trƣởng nhanh, ít tiêu tốn thức ăn và phẩm chất quày thịt tốt. Vì vậy các nhà chọn giống đã không ngừng nghiên cứu, chọn lọc và cải tạo giống nhằm đem lại năng suất và hiệu quả cao nhất. Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của việc chăn nuôi heo nhƣ: phẩm chất con giống, dinh dƣỡng, trình độ chăm sóc quản lý, vệ sinh phòng bệnh…Trong đó phẩm chất con giống là yếu tố đặc biệt quan trọng. Để cải thiện năng suất sinh sản trên heo nái, đặc biệt là số con trên ổ, tỉ lệ sống sót của các heo con sau khi sinh các nhà chọn giống ở các nƣớc đã áp dụng nhiều chƣơng trình chọn giống mới kết hợp với phƣơng pháp chọn lọc truyền thống. Ngƣời ta đã tiến hành chọn giống heo dựa vào gen đánh dấu (Marker assisted selection – MAS). Theo các nghiên cứu của Vincent và cộng sự (1998), Drogemuller và cộng sự (2000), Rothchild và cộng sự (1996, 2000) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR), gen thụ thể estrogen (ESR) và retinol binding protein 4 (RBP4) có mối liên hệ với năng suất sinh sản của nái. Trong nƣớc đã có một số tác giả đã áp dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện sự hiện diện của các gen có liên quan đến sự sinh sản của heo (Lê Thị Thúy và cộng sự, 2002; Nguyễn Ngọc Tuân và cộng sự, 2001; Võ Thị Tuyết và cộng sự, 2005) Công nghệ sinh học đã bắt đầu đi vào giải quyết các vấn đề thực tiễn của nghành chăn nuôi. Đƣợc sự đồng ý của Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Võ Thị Tuyết chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire” 1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích Ứng dụng PCR để phát hiện sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và xác định kiểu gen của nó trong quần thể. 1.2.2 Yêu cầu Ly trích DNA từ mẫu máu và da tai 2 Xác định qui trình phản ứng PCR phù hợp nhất Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu ly trích đƣợc Xử lý enzyme các mẫu có sự hiện diện của gen PRLR Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR trên các mẫu 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorkshire Đây là giống heo lai giữa giống Large White và giống khác ở vùng Yorkshire của Anh Quốc, nên lấy tên gọi là giống Yorkshire. Giống heo này hiện nay đƣợc nuôi rộng rãi khắp nơi trên thế giới, và hầu hết các trại giống ở Việt Nam do những ƣu điểm thích nghi rộng và năng suất cao. Về hình dáng bề ngoài giống Yorkshire có những đặc điểm nhƣ thân hình dài, trông dáng vẻ nặng nề, đầu to, trán rộng, bụng gọn. Ngực rộng và sâu. Hai chân dài chắc khỏe, đùi to. Hai tai lớn hình tam giác, dựng đứng, sắc trắng. Sáu tháng tuổi đạt 90 – 100 kg, khi trƣởng thành nặng khoảng 250 – 300 kg. Mỗi năm đẻ từ 1.8 – 2.2 lứa, mỗi lứa khoảng 8 – 9 con, trọng lƣợng heo con sơ sinh 1.8 kg / con. Giống Yorkshire có đặc điểm nuôi con giỏi, là giống đứng đầu trong tổng đàn ngoại nhập ở nƣớc ta. 2.2 Prolactin 2.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo Prolactin còn gọi là LTH (Luteo tropic hormone) . Ở ngƣời và các loài động vật hƣu nhủ prolactin đƣợc tổng hợp và phân tiết ở tế bào ƣa acid của tuyến não thùy. Nó là một polypeptide gồm mƣời chín cấu tử amino acid và trọng lƣợng phân tử khoảng 23000 Da. 2.2.2 Tác dụng của prolactin Prolactin có tác động sinh học lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của ngƣời và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con. Trên một số loài động hữu nhũ, prolactin còn tác động đến hoàng thể kích thích sự phân tiết hormone progesterone. Prolactin đƣợc phân tiết từ các tế bào ƣa acid của tuyến não thùy theo máu di chuyển đến cơ quan đích, ở đây xảy ra sự tiếp nhận prolactin. Sự tiếp nhận này đƣợc quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích. Bình thƣờng bất cứ heo mẹ, heo bố hay heo con nào cũng phân tiết đƣợc prolactin, nhƣng chỉ những cá thể có thụ thể tiếp nhận prolactin (prolactin receptor) thì mới chịu ảnh hƣởng của hormone này. Sự xuất hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền (prolactin receptor gene). 4 2.2.3 Cơ chế tác động của prolactin Prolactin khi đến tế bào mục tiêu sẽ kết hợp với các protein chuyên biệt (receptor) tạo thành phức hợp hormone – receptor ở màng tế bào, phức hợp này hoạt hóa enzyme adenylcyclase định vị ở màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP. c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học trong tế bào chất và trong nhân, nhƣ tác động vào đơn vị ức chế trong protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động và xúc tác phản ứng phosphoryl hóa các cấu tử serine trong các protein ở tế bào mục tiêu dẫn đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển cơ chất qua màng và cả hoạt tác gen. Nguồn gốc: Hình scan từ Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM của PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận Hình 2.1: Cơ chế tác động của hormone tại tế bào mục tiêu Hoạt tác gen Kích hoạt các enzyme, hormone 5 2.2.4 Gen thụ thể prolactin Cùng với sự phát hiện ra gen thụ thể estrogen, gen halothan...Ngƣời ta cũng đã phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Gen này đƣợc nghiên cứu nhƣ gen dự tuyển trong công tác chọn giống ở các dòng heo: Large White, Landrace, Duroc...Theo các nghiên cứu của Vincent (1998), Linville, Drogemuler (2001), Hamann (2001) nếu trên các cá thể heo có sự xuất hiện của gen thụ thể prolactin thì số con trên ổ đẻ nhiều, tỉ lệ sống sót của các heo con cao. Đặc biệt, trọng lƣợng heo con sinh ra vẫn duy trì ở mức bình thƣờng không có chênh lệch đáng kể so với các ổ đẻ có số con ít. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng thấy sự tăng khối lƣợng trên ngày của các cá thể heo con có sự hiện diện của gen thụ thể prolactin cao hơn các cá thể không có sự hiện diện của gen này. Các nghiên cứu về gen thụ thể prolactin chỉ dừng lại ở mức xác định mối tƣơng quan giữa sự hiện diện của gen thụ thể prolactin với sự tăng năng suất sinh sản và tăng trọng của cơ thể heo chứ không xác định rõ cơ chế của gen này lên sự tăng năng suất sinh sản hay tăng trọng cơ thể. Có nhiều giả thuyết cho rằng sự xuất hiện của gen này kèm theo xuất hiện của một gen khác kiểm soát các tính trạng về năng suất của heo (Vincent, 1998). Ở heo gen PRLR đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể 16. Gen này liên kết khá chặt chẽ với ba marker nằm tại các locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23). Để xác định đƣợc tính đa hình của gen PRLR, Vincent và cộng sự đã dùng kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Trƣớc ông dùng kỹ thuật PCR để phân lập một đoạn DNA của gen PRLR, sau đó dùng enzyme AluI phân cắt đoạn DNA này. Với cách này thì ông đã xác định đƣợc kích thƣớc của các băng cắt DNA nhƣ sau: 124, 110, 90, 79 và 76 bp. Trong đó, băng 110 và 90 bp đƣợc xác định là đa hình. Những sản phẩm PCR nào có hiện diện băng 90 bp đƣợc xác định là alen A, băng 110 bp đƣợc xác định là alen B. Gen PRLR có tính đa hình rất cao. Ở các dòng heo khác nhau khi xử lý enzyme AluI gen PRLR thì các đoạn cắt cũng có nhiều kích thƣớc khác nhau. Hai alen A và B tạo thành các kiểu gen AA, AB, BB. Trong ba kiểu gen này thì trên các giống heo Large White, Meishan, Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, kích thƣớc heo con sinh ra đồng đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB. 6 Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank Locus SSU96306 Định danh Gen PRLR Số truy cập U96306 Sinh vật Ngƣời và các động vật hữu nhủ Tác giả Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Robic A., Rothschild M.F. Trình tự 1- agcaggagaa cggcgaccgg ccggagaagg ctggcgcccc tgaaaccagc aaggaatacg cccaggtgtc ccgggtgatg gataaccaca tcctggtgtt agtgcaggat ccgcgagctc gaaacgtggc tccgtttgaa gaaccaacca aggagacccc gccatcccgg ccgcagaatc cagctgcgaa agacctggcc agcttcacca cggccccggg ccactgcaga cacccgctgg gtgggctgga ttacctcgat cccgcaggct ttatgcactc ctttcagtga gagcttggtt catgggatga tgggttacaa ggtggggttt ttttcaggtc gcactacgtg aaatgcactc taccagagaa agctcgaaaa tggggttaga atgacactac ccagactcac agttcactcc tcttcatgct ccattttcaa ccacttgcc- 449 bp 2.3 Giới thiệu về DNA (Deoxyribonucleotide acid) Acid nucleic là vật chất mang thông tin di truyền của cơ thể sống. Acid nucleic đƣợc cấu tạo từ các đơn phân (monomer) là các nucleotide. Mỗi nucleotide gồm có ba thành phần: nhóm phosphate, đƣờng pentose, và nhóm bazơ hữu cơ. Bazơ hữu cơ gồm có hai nhóm: nhóm bazơ purin và nhóm bazơ pyrimidine. Nhóm purin gồm có: adenine (A) và guanine (G). Nhóm pyrimydine gồm có: thymine (T) và cytosine (C). Bốn loại bazơ hữu cơ này kết hợp với nhóm phosphate và đƣờng pentose tạo thành bốn loại nucleotide, ngƣời ta viết tắt chúng là A, T, G, C. Các nucleotide này nối với nhau thành một chuỗi dài hay mạch DNA. Phân tử DNA có cấu trúc xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Hai mạch đơn liên kết với nhau bằng liên kết hidro, liên kết đƣợc hình thành giữa các bazơ bổ sung A với T và G với C. A liên kết với T bằng hai liên kết hidro, G liên kết với C bằng ba liên kết hidro. Mỗi mạch đơn có một đầu OH tự do và một gốc phosphate tự do. Ngƣời ta qui ƣớc là đầu chứa gốc phosphate tự do là đầu 5’, đầu chứa gốc OH tự do là đầu 3’. 7 Một đặc điểm có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu phân tử DNA đó là khả năng hồi tính và biến tính của DNA: Sự biến tính là hiện tƣợng hai mạch DNA tách rời nhau do đứt gãy các liên kết hidro bởi nhiều yếu tố vật lý và hoá học nhƣ: nhiệt độ, dung dịch kiềm, formaline, urea…Hiện tƣợng biến tính do nhiệt độ xảy ra khi nhiệt độ nóng chảy (melting temperature, Tm) của DNA thấp hơn nhiệt độ của môi trƣờng. Tm cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần của DNA. DNA chứa càng nhiều G, C thì nhiệt độ nóng chảy càng cao do G liên kết với C bằng ba liên kết hidro tƣơng đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lƣợng hơn để phá huỷ liên kết này. Hồi tính là hiện tƣợng hai mạch đơn DNA sau khi tách rời ban đầu gắn với nhau theo nguyên tác bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép. Đặc điểm hồi tính và biến tính của DNA là cơ sở để thực hiện phản ứng PCR (polymerase chain reaction). N N NH N NH2 N NH NH N NH2 O N NH NH2 O NH NH O O CH3 Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide nhƣ sau: Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide OH O O OH OH OH O P Bazơ hữu cơ Adenine Cytosine Guanine Thymine 8 2.3.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA DNA đƣợc xem là vật chất sống vì nó có khả năng tự nhân đôi . Đặc điểm cơ bản của sự tái bản này là sự tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semiconservative replication). Khi bắt đầu quá trình sao chép có sự tách rời của chuỗi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau và giống với DNA mẹ, mỗi phân tử DNA con đƣợc hình thành từ một mạch mới và một mạch cũ. Ở mỗi một lần tái bản, có sự tháo xoắn chuỗi DNA mẹ nhờ enzyme topoisomerase và protein DNA A. Trong quá trình sao chép các chuỗi tách rời nhau dƣới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme này phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide. Nhiều loại helicase cùng họat động đồng thời, một số gắn lên mạch 3’ – 5’, một số gắn trên mạch 5’ – 3’. Các mạch tách rời sẽ đƣợc ổn định dƣới dạng mạch đơn nhờ các protein SSB (single strand binding) gắn lên khắp các mạch đơn làm các mạch này không thể gắn lại với nhau. Sự tái bản đƣợc khởi đầu bằng việc kéo dài một đoạn mồi có bản chất là RNA (ribonucleotide acid) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn nhờ các DNA polymerase. Sự thêm các nucleotide luôn theo hƣớng 5’– 3’. Tức là trên hai mạch DNA có một mạch sự tái bản diễn ra theo chiều thuận và mạch còn lại sự tái bản diễn ra theo chiều nghịch. Trên mạch khuôn 3’ - 5’ sự tái bản theo chiều 5’- 3’ cùng hƣớng với chiều tháo xoắn sự tái bản trên mạch này diễn ra một cách liên tục và đƣợc gọi là sợi tiến nhanh. Trên mạch còn lại sự tái bản diễn ra ngƣợc với chiều tháo xoắn. Sự tổng hợp mạch mới ở đây không diễn ra liên tục mà dƣới dạng những đoạn ngắn gọi là những đoạn Okazaki. Sự tái bản bán bảo thủ có vai trò rất quan trọng vì qua đó khi tế bào phân chia có thể truyền sang tế bào con bản sao nguyên vẹn toàn bộ cơ cấu di truyền của nó. Trong sự phân bào bình thƣờng thì DNA đƣợc nhân đôi khi các nhiễm sắc thể tách rời nhau. 9 Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA STT Tên Chức năng 1 DNA mẹ Làm khuôn cho sự tổng hợp 2 Nucleotide: A, T, G, C Nguyên liệu cho sự tổng hợp 3 Mg 2+ Cần thiết cho hoạt động của các enzyme DNA polymease 4 Ezyme: DNA polymerase, topoisomerase, helicase, RNA primase, protein DNA A… Tháo xoắn, tách các mạch đơn, cố định mạch đơn, tổng hợp mồi và kéo dài chuỗi. Hình 2.4: Sự nhân bản DNA Mạch đƣợc tổng hợp liên tục Mạch đƣợc tổng hợp từ các đoạn Okazaki 10 2.3.2 Gen, allen và sự đa hình của gen 2.3.2.1 Gen Gen là một đoạn DNA có khả năng kiểm soát một chức năng hoặc một tính trạng nào đó của cơ thể sống. Đoạn DNA có khả năng sao mã tạo ra mRNA (RNA thông tin). Từ mRNA thông tin này có thể đƣợc mã hóa tạo ra protein. Protein là đơn vị cấu tạo nên sự sống, mọi thành phần của cơ thể sống hầu hết đƣợc cấu tạo từ protein nhƣ các men tiêu hóa, các hormone, các thành phần cấu tạo của tế bào… Có nhiều gen không tham gia tổng hợp protein nhƣng nó có khả năng ức chế hoạt động của một gen hay một tổ hợp gen khác. Những loại gen này rất phổ biến ở động vật và ngƣời. Cấu trúc tổng quát của một gen động vật đƣợc phân chia thành hai vùng nhƣ sau: vùng mã hoá và vùng điều hoà ở đầu 5’(Lê Đức Trình, 2001; Bùi Trang Việt, 2002). Vùng mã hoá bao gồm một chuỗi lần lƣợt các exon và intron. Các exon là các vùng gen mã hoá protein. Theo qui ƣớc ngƣời ta gọi nucleotide thứ nhất nơi khởi sự sao chép là +1, nucleotide trƣớc đó là -1. Còn các intron là các vùng gen không mã hoá acid amin. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra rõ chức năng của vùng này trong quá trình biểu hiện gen. Vùng điều hoà gồm các enhancer và promotor. Các enhancer là nơi chứa các trình tự nhận biết chuyên biệt của nhiều yếu tố điều hoà. Các promotor bao gồm các trình tự từ 6 – 8 nucleotide (đôi khi đến 20 nucleotide), nhận biết một cách gián tiếp RNA polymerase, thƣờng nhất là : TATA box (trình tự giàu T và A, ví dụ TATAAA), GC box, CCAAT box. Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen Sự biểu hiện gen ở động vật rất phức tạp. Sự biểu hiện này bị tác động bởi các yếu tố điều hoà có bản chất là protein, steroid, DNA. Trên cấu trúc của gen, các enhancer có các vùng trình tự nhận biết đƣợc các yếu tố này và có thể dẫn đến hiện tƣợng sao chép DNA tạo ra mRNA. Nếu xảy ra sự sao chép thì mRNA tạo ra ban đầu sẽ trải qua quá trình trƣởng thành. Cả exon và intron đều đƣợc sao chép thành mRNA, nhƣng trƣớc khi rời khỏi nhân, các đoạn tƣơng ứng với intron bị loại đi, các đoạn exon còn lại nối lại với nhau tạo thành mRNA có trình tự liên tục mã hoá acid amin. 11 Sự liên kết giữa gen và marker Marker là một đoạn DNA liên kết với gen (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000). Khi phát ra những đoạn DNA mới kiểm soát một chức năng nào đó của cơ thể sống, ngƣời ta cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gen định vị trên nhiễm sắc thể nào đó. Điều này hoàn toàn có thể thực hiện đƣợc nhờ công trình có tính lịch sử của Morgan về liên kết gen và khoảng cách di truyền (tính bằng centi Morgan, viết tắt là cM). Bản đồ di truyền của ruồi giấm đƣợc phát hiện rất sớm vào năm 1925. Những tính trạng di truyền chung với nhau đƣợc xếp chung vào một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể. Những tính trạng này đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể tùy mức độ liên kết của nó. Sự sắp xếp độc lập của các nhiễm sắc thể giúp cho việc xác định vị trí các locus trong các nhóm liên kết gen. Sự xuất hiện của hiện tƣợng quấn chéo (crossing over) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự các locus trong nhiễm sắc thể. Khoảng cách di truyền đƣợc đo bằng tần suất tái tổ hợp gen. Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ liên kết với một tính trạng hình thái nào đó, mà ngƣời ta có thể đo đếm đƣợc – gen đó có thể xem là marker gen. Việc lập bản đồ gen và việc chọn lọc marker hình thái nhƣ vậy tốn rất nhiều thời gian, thậm chí hàng chục năm trời. Số lƣợng marker thu đƣợc theo kiểu chọn lọc này rất ít và chỉ có ở qui mô hình thái. Do vậy ngƣời ta đã sử dụng marker isozyme đã làm cho vấn đề thay đổi theo chiều hƣớng tốt hơn, nhƣng số lƣợng marker thu đƣợc cũng rất ít không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu. Trong tình hình này thì DNA marker đƣợc đề xuất (Tankley và ctv, 1980). Về căn bản thì bất cứ chuỗi mã DNA nào đƣợc dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem nhƣ một DNA marker. Nhƣng nó phải đảm bảo về tính ổn định, sự xuất hiện của nó phải luôn luôn có sự xuất hiện của gen quan tâm. 2.3.2.2 Allen và sự đa hình của gen Gregor Mendel (1856) định nghĩa allen nhƣ sau: “ Allen là các dạng khác nhau của một gen cùng qui định một tính trạng”, các đối tƣợng đƣợc ông khảo sát ở đây là đậu Hòa Lan. Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, các khái niệm về nhiễm sắc thể, khoảng cách di truyền và locus đƣợc hình thành thì allen đƣợc định nghĩa lại nhƣ sau: “ Allen là 12 các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”. Allen là cơ sở để xác định tính đa hình của gen. Gen có càng nhiều allen thì tính đa hình càng cao. Mỗi allen đƣợc hình thành từ sự đột biến đoạn mã di truyền của gen gốc do các yếu tố môi trƣờng sống, các tác nhân vật lý, hóa học hay các sai sót trong quá trình sao chép. Các đột biến này nếu tạo thuận lợi cho sự sống sót, sinh sản của cá thể sẽ đƣợc duy trì và lan truyền trong quần thể. Nhƣ vậy, gen là đơn vị có tính chất đột biến ( Bùi Chí Bữu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong tự nhiên hai cá thể cùng một loài mang cùng một gen chƣa hẳn là có đoạn trình tự chuỗi mã di truyền của gen giống nhau, giữa những cá thể khác nhau thì luôn xuất hiện đột biến khác nhau nhƣng hiếm khi biểu hiện thành các đặc điểm hình thái. Tính đa hình của gen trong trƣờng hợp này chỉ đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phân tích ở mức phân tử. 2.3.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật DNA đƣợc chiết tách từ mô và các cơ quan của động thực vật. Ở động vật DNA đƣợc chiết tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu. Qui trình này cơ bản gồm 3 bƣớc: Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tiến hành nghiền mô, tế bào trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa DNA bằng hổn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phƣơng pháp ly tâm. Bƣớc 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc trong ethanol hoặc isopropanol. 13 2.3.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA 2.3.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) Phƣơng pháp này không thật chính xác, chỉ ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ acid nucleic có trong mẫu. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng λ = 260 nm. Một đơn vị OD tƣơng ứng với nồng độ là: - 50 μg / ml cho một dung dịch sợi đôi - 40 μg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn Ví dụ: một OD260 nm= 0,9 sẽ tƣơng ứng với: - Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi bằng 0,9*50 = 4,5 μg - Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA bằng 0,9*40 = 3,6 μg Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với dung dịch có độ tinh sạch cao. Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA thu đƣợc ngƣời ta đo thêm giá trị OD 280 nm, ở bƣớc sóng này protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhƣng các protein cũng hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm, do đó làm sai giá trị thật của acid nucleic có trong mẫu. Một dung dịch acid nucleid đƣợc xem là sạch nếu có tỉ số OD260 nm / OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2. Nồng độ DNA trong mẫu đƣợc tính bằng công thức sau: Nồng độ (ng / μl) = OD260 nm*62,9 - OD280 nm*36 2.3.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kích thƣớc của các đoạn DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gelling). Giữa những hạt nhƣ vật có những lỗ rất nhỏ. Tùy theo nồng độ của gel mà kích thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel càng cao thì kích thƣớc của các lỗ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lỗ nhỏ này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này. DNA có kích thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kích thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị trí 14 và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng trong dung dịch ethium bromide và đặt dƣới tia tử ngoại. 2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 2.4.1 Giới thiệu về phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase. Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94 - 95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR 2.4.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 2.4.2.1 Taq polymerase Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. 2 4 6 8 1 0 Biến tính Ủ bắt cặp Kéo dài Lặp lại n lần 94–95o C 72 o C 45-56o C 15 Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2.4.2.2 Các nucleotid dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. 2.4.2.3 Primer (mồi) Primer (mồi) là những đoạn oligoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymeresa bắt đầu kéo dài chuỗi DNA. 2.4.2.4 Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg 2+. Nó rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1.5 mM. Môi trƣờng đệm KCl đã và đang áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg 2+. Những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate làm giảm những sản phẩm đƣợc phát triển một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen có kích thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide. 16 2.4.2.5 DNA khuôn Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1 µg xuống khoảng 20 ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. 2.4.2.6 Số chu kỳ phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì sản phẩm PCR thu đƣợc ít.