Mục lục
mở đầu. 1
Phần 1: Tổng quan . 2
1.1. Vi khuẩn lactic . 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái . 2
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá . 3
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic . 3
a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon . 3
b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ . 4
c. Nhu cầu vitamin . 5
d. Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic . 6
e. Nhu cầu các muối vô cơ . 7
1.1.4. ứng dụng của vi khuẩn lactic . 7
1.2. Quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic . 8
1.2.1. Đường cong sinh trưởng . 8
1.2.2.1. Chủng giống . 11
1.2.2.2. Thành phần của môi trường nuôi cấy . 11
a. Nguồn cacbon. 11
b. Nguồn nitơ . 11
c. Nguồn muối khoáng. . 11
1.2.2.3. Điều kiện nuôi cấy . 12
a. Nhiệt độ . 12
b. pH . 12
c. Nồng độ cơ chất . 13
d. Tỉ lệ tiếp giống . 13
1.3. Thu hồi sinh khối vi khuẩn bằng các phương pháp sấy . 13
1.3.1. Sấy phun. 13
1.3.2. Phương pháp đông khô . 14
1.3.3. Phương pháp sấy chân không . 15
Phần II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu . 16
2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị . 16
2.1.1. Nguyên liệu . 16
2.1.2. Hoá chất . 16
2.1.3. Thiết bị . 17
2.1.4. Môi trường nuôi cấy . 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 18
2.2.1. Phương pháp vi sinh . 18
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
48
1/ Hoạt hoá . 18
3/ Nhuộm màu Gram . 18
4/ Kiểm tra khả năng di động . 19
5/ Xác định kiểu hô hấp . 19
6/ Xác định tỉ lệ sống sót (Phương pháp Kocch) . 19
2.2.2. Phương pháp hoá lý . 19
1/Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng ly tâm . 19
2/ Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng đo OD . 19
2.2.3. Phương pháp hoá học . 20
1/Xác định hàm lượng N tổng bằng phương pháp Kendan . 20
2/Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov . 20
3/Xác định hàm lượng axit lactic . 20
2.2.4. Phương pháp sấy thu hồi sinh khối . 20
1/ Sấy phun . 20
2/ Sấy đông khô . 20
3/ Sấy chân không . 20
2.2.5. Phương pháp toán học . 20
Phần 3 : Kết quả và thảo luận. 21
3.1. Sơ tuyển chủng giống vi khuẩn lactic dùng cho quá trình tạo sinh khối . 21
3.1.1. Kiểm tra lại đặc tính của các chủng . 22
3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic . 25
3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối . 27
3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ . 27
3.2.2 ảnh hưởng của điều kiện thông khí . 29
3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ . 30
3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường . 31
3.2.5 ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống . 34
3.2.6 ảnh hưởng của pH . 36
3.3.Tối ưu hoá quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic. . 37
3.4. Thu hồi chế phẩm vi khuẩn lactic của chủng Lc.340 và TL6 . 43
3.4.1. Động thái quá trình tạo sinh khối. . 43
3.3.2 Thu hồi chế phẩm vi khuẩn lactic . 44
Kết luận . 46
48 trang |
Chia sẻ: lynhelie | Lượt xem: 2528 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đồ án Nghiên cứu các điều kiện tối ưu của quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
dần dần cơ chất này
vào môi trường thì tốc độ phát triển của vi sinh vật này sẽ tăng lên đến đạt cực
đại. Tuy nhiên, khi nồng độ cơ chất dư thừa, tốc độ phát triển của vi khuẩn sẽ
giảm xuống, thậm chí bị ngừng lại hoàn toàn.
d. Tỉ lệ tiếp giống [12]
Tăng tỉ lệ tiếp giống cho phép giảm pha tiềm phát. Do đó cũng có thể
xác định được nồng độ tế bào cho vào môi trường ban đầu nhằm cải thiện hiệu
suất thu hồi sinh khối.
1.3. Thu hồi sinh khối vi khuẩn bằng các phương pháp sấy
1.3.1. Sấy phun
Quá trình sấy thực hiện bằnh cách phun vật liệu (chất lỏng) thành hạt
nhỏ vào môi trường không khí nóng. Môi chất sấy (không khí nóng, khói lò
) được thổi vào và chuyển động cùng với hạt vật liệu và sấy khô vật liệu.
Nhờ quá trình phun vật liệu thành hạt nhỏ nên bề mặt tiếp xúc giữa vật liệu và
môi chất sấy rất lớn nên cường độ sấy cao, thời gian sấy ngắn (vài giây đến vai
chục giây).
Sấy phun gồm có 4 giai đoạn: phun vật liệu thành bụi, quá trình tiếp
xúc giữa bụi và không khí nóng, quá trình bay hơi ẩm, quá trình tách sản phẩm
ra khỏi không khí. Các giai đoạn được trình bầy như sau:
Giai đoạn 1: Phun vật liệu thành bụi
à
à M
1
2
3
S
1.Thiếu cơ chất
2.Không thiếu cơ chất
3.ức chế thừa cơ chất
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
14
Cường độ quá trình sấy phun tỷ kệ thuận với độ phân tán của vật liệu
sấyđược phun thành bụi. Ta có thể dùng một trong ba phương pháp sau để
phun chất lỏng thành bụi: ly tâm với tốc độ 2000 – 5000 v/p, dùng vòi phun
trong đó chất lỏng được đẩy bằng bơm có áp suất 200 at, dùng khí nén đẩy
chất lỏng với áp suất 2,5 – 5 at. Thiết bị sấy trong đề tài này sử dụng cách thứ
3 theo cách này thì ta dùng không khí để phun dung dịch. Trước hết không khí
qua ống phun tăng tốc rồi phun ra miêng phun, dùng bơm đưa dung dịch đến
miệng vòi, không khí có tốc độ cao sẽ thổi dung dịch văng ra thành hạt nhỏ.
Tốc độ khí ra khỏi ống phun phụ thuộc vào tỷ số áp suăt trước và sau ống
phun.
Giai đoạn 2: Sự tiếp xúc giữa bụi và không khí
Sự tiếp xúc giữa bụi và không khí phụ thuộc vào vị trí tương đối giữa
vòi phun và đường không khí vào. Trong thiết bị sấy của chúng tôi, bụi được
phun trực tiếp vào không khí nóng trong buồng sấy. Đây chính là cách hay sử
dụng nhất đặc biệt đối với vật liệu nhậy cảm như vi khuẩn vì sự bay hơi nhanh,
thời gian bay hơi ngắn, tránh được sự phá huỷ bởi nhiệt độ.
Giai đoạn 3: Sự bay hưoi ẩm
Sự bay hơi ẩm gồm hai giai đoạn: ở giai đoạn đầu khi lượng ẩm trong
vật liệu nhiều, lượng ẩm khuyếch tán từ trong vật liệu ra đến bề mặt lớn hơn
lượng ẩm bốc hơi thì vận tốc bay hơi ẩm là không đổi. ở giai đoạc thứ hai, khi
lượng ẩm đến một giá trị giới hạn nào đó, lượng ẩm khuyếch tán nhỏ hơn
lượng ẩm bay hơi, thì tốc độ bay hơi giảm.
Giai đoạn 4: Tách sản phẩm khô ra khỏi không khí
Toàn bộ hỗn hợp sinh khối khô và không khí được hút sang thiết bị
tách cyclon. Trong thiết bị này, dưới tác dụng của lực ly tâm, sinh khối khô
lắng xuống dưới còn không khí đựơc bơm hút ra ngoài ở phía trên.
1.3.2. Phương pháp đông khô
Đông khô cũng là một trong những phương pháp tách ẩm ra khỏi vật
liệu để bảo quản tốt vi khuẩn. Thực chất đây là một phương pháp sấy đặc biệt,
sấy thăng hoa, ẩm từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không thông qua trạng
thái lỏng. Vật liệu được sấy ở môi trường chân không cao < 456mHg nhiệt độ
sấy có thể đạt đạt đến –150C, nên ngăn chặn các nguy cơ phá huỷ bởi nhiệt độ,
các phân tử hợp lại với nhau khi cô đặc, không sảy ra quá trình vi sinh.
Trước khi tiến hành sấy, vật liệu được làm lạnh đông sâu nhanh nhằm
biến đổi toàn bộ nước có trong vật liệu trong trạng thái rắn, các cấu tử hoà tan
được cố định tránh trường hợp các cấu tử này được tập hợp với nhau. Khi sấy
ở áp suất rất thấp nước sẽ bay hơi, hơi ẩm thoát sang thiết bị ngưng tụ và
ngưng tụ thành nước đá. Thiết bị ngưng tụ này được làm lạnh bằng hơi nước
muối có nhiệt độ vào là -100C và ra là 400C. Trong quá trình làm lạnh sâu có
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
15
thể vi sinh vật bị chết. Để khắc phục ta phải tiến hành nhũ hoá_keo bảo vệ hỗn
dịch như: Sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, peptôn, muxin hay các loại
đường. Thật vậy trong quá trình làm đông khô một số lớn vi sinh vật bị chết, tỷ
lệ của những vi sinh vật sống sót còn 5% - 30%. Khi cho nước vô khuẩn vào
phẩm vật đã đông khô, thì phục hồi được môi trường chứa vi sinh vật, giữ
nguyên vẹn được toàn bộ khả năng phát triển và đặc tính trao đổi chất của vi
sinh vật.
Các chất độn trước khi làm đông khô cần phải có những yêu cầu sau:
Đảm bảo cho môi trường giống sau khi đông khô là một khối đặc
có chất bảo vệ giống cho khỏi bị khô quá mức
có chất trung hoà nhóm cacbonyl
Chủng làm đông khô là các chủng trưởng thành nhưng không già. Tốc
độ làm lạnh lúc đầu (từ -100C tới -200C) khoảng 1 – 30 C/phút sau đó có thể
nâng lên 100C/phút hoặc lớn hơn.
Khi làm khô lúc đầu giữ nhiệt độ vật liệu không quá -230C đến –250C
và cuối cùng không cao hơn –300C đến –450C. Không để làm tan băng trong
khi đông khô.
Phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn so với các phương pháp sấy
khác là tránh được sự phân chia tế bào, khả năng sống sót cao nhưng chi phí
lại rất cao, thời gian sấy kéo dài. Do đó, không nên áp dụng phương pháp này
trong sản xuất chế phẩm vi khuẩn với quy mô lớn.
1.3.3. Phương pháp sấy chân không
Nhiệt độ sôi và áp suất hơi bão hoà là hai thông số phụ thuộc vào
nhau, áp suất giảm thì nhiệt độ sôi cũng giảm và ngược lại. Dựa trên quy tắc
này, phương pháp sấy chân không được áp dụng để sấy các vật liệu dễ bị biến
đổi ở nhiệt độ cao.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
16
Phần II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Chủng giống vi khuẩn: sử dụng 4 chủng vi khuẩn lactic của Bộ môn Công
nghệ các sản phẩm lên men với các kí hiệu sau:
+VTP : Lactococcus lactis dùng để sản xuất axit lactic
+SD16 : Lactococcus lactis sử dụng trong lên men sữa chua
+Lc.340 : Lactococcus lactis sử dụng trong sản xuất sữa chua của
Pháp
+TL6 : Lactococcus lactis ứng dụng trong lên men rau quả
- Sữa men của các xưởng sản xuất bia tại Hà Nội.
- Enzym Neutrase
2.1.2. Hoá chất
Tên Nguồn gốc
Glucoza, saccaroza Pháp
Cao thịt Pháp
Cao nấm men Pháp
CH3COONa Nga
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
17
K2HPO4 Trung Quốc
Amoni xitrat Slovaki
MgSO4.7H2O Hungari
MnSO4.4H2O Trung Quốc
Tween 80 Đức
Bromocresol tía Trung Quốc
Kali xitrat Trung Quốc
Na2HPO4 Trung Quốc
KNO3 Trung Quốc
2.1.3. Thiết bị
Tên Nhãn hiệu
Kính hiển vi OLYMPUS Model CHD, Japon
Máy đo pH (744 pH Meter) METROHM, Suisse
Máy đo OD 6300 JENWAY, Grande-Bretagne
Nồi hấp 3850M TUTTNAUER, Allemagne
Máy ly tâm Beckman ALLEGRA, Allemagne
2.1.4. Môi trường nuôi cấy
Môi trường giữ giống : Môi trường MRS (Deman, Rogosa, Sharpe, 1960),
g/l :
Glucoza 20 ; Pepton 10 ; Cao nấm men 8 ; Cao thịt 10 ; CH3COONa 2 ;
K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; Thạch 14 ;
Tween 80 1ml ; Nước 1000ml.
Thanh trùng ở 1210C trong 40 phút, pH = 6 - 6,2.
Môi trường nhân giống :
Glucoza 20 ; Pepton 10 ; Cao nấm men 8 ; Cao thịt 10 ; CH3COONa 2 ;
K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; Tween 80
1ml ; Nước 1000ml.
Thanh trùng ở 1210C trong 40 phút, pH = 6 - 6,2.
Môi trường nuôi sinh khối :
Glucoza 20 ; Cao men 6.4 ; Dung dịch nấm men thuỷ phân 20ml;
CH3COONa 2 ; K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O
0,04 ; Tween 80 1ml ; Nước 1000ml.
Thanh trùng ở 1210C trong 40 phút, pH = 6 - 6,2.
Chuẩn bị dịch nấm men thuỷ phân :
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
18
Sau khi rửa, men sữa được thuỷ phân trong 12h có bổ sung enzim Neutrase
(0,05%) ở 52oC. Dịch thu được đem đi lọc ở 5 oC và được bảo quản lạnh trước khi
sử dụng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
1/ Hoạt hoá
Quá trình hoạt hoá 4 chủng vi khuẩn lactic được tiến hành trên môi trường
MRS theo sơ đồ sau :
2/Soi tiêu bản sống[4]
Chuẩn bị một phiến kính và một lá kính tiệt trùng. Để pha loãng, trên phiến
kính, nhỏ một giọt nước cất vô trùng. Dùng que cấy lấy canh trường cho vào giọt
nước cất. Đặt lá kính sạch lên trên giọt nước tránh tạo bọt khí và tránh tràn nước ra
ngoài nhờ giấy thấm.
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi.
3/ Nhuộm màu Gram[4]
Phương pháp nhuộm màu Gram dựa trên sự khác nhau về cấu trúc thành
tế bào của vi sinh vật. Phương pháp này cho phép phân chia vi sinh vật thành
hai nhóm : Gram (+) và Gram (-). Canh trường sử dụng phải trẻ, được nuôi cấy
sau 24 h.
Chuẩn bị tiêu bản khô của canh trường cần nghiên cứu. Nhỏ vài giọt gentian
tím lên vết bôi. Sau 2 phút, đổ dung dịch tím gentian đi. Nhỏ vài giọt Lugol lên vết
bôi, giữ trong 1 phút. Nhúng phiến kính vào dung dịch cồn tuyệt đối trong 30 giây.
Nuôi cấy ở 30oC trong 24 h
Canh trường trên môi trường thạch
nghiêng
Môi trường MRS lỏng
Môi trường MRS đặc trên đĩa Petri
Môi trường thạch nghiêng
Nuôi ở 30oC trong 48 h
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
19
Rửa cẩn thận vết bôi bằng nước. Nhuộm lại vết bôi bàng dung dịch fucsin 1% trong
vòng 1 phút. Rửa vết bôi bằng nước. Sấy khô vết bôi bằng đèn cồn. Quan sát tiêu
bản dưới kính hiển vi.
4/ Kiểm tra khả năng di động
Cấy một giọt canh trường vi khuẩn lactic lên bề mặt môi trường MRS đặc
chứa trong hộp Petri (môi trường này được nhỏ thêm vài giọt bromocresol tía
1,6%). Nếu vi khuẩn có khả năng di động, axit hữu cơ sinh ra sẽ di chuyển về
mọi hướng và làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng. Nếu vi khuẩn không
có khả năng di động, sự đổi màu của chỉ thị chỉ được quan sát thấy xung quanh
giọt canh trường.
5/ Xác định kiểu hô hấp
Nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS thạch đứng cao
6-7 cm trong ống nghiệm. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc theo vết cấy.
6/ Xác định tỉ lệ sống sót (Phương pháp Kocch)
Canh trường được pha loãng đến tỉ lệ thích hợp, sau đó được trang đều
trên môi trường MRS đặc. Nuôi cấy trong 48 giờ. Đếm số khuẩn lạc và tính toán
tỉ lệ sống sót.
2.2.2. Phương pháp hoá lý
1/Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng ly tâm
Sau một thời gian nuôi cấy, canh trường được ly tâm ở 6000 v/p trong 10
phút. Sinh khối thu được tiếp đó được cân và tính toán.
2/ Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng đo OD
Tồn tại sự tỉ lệ thuận trong một vùng giới hạn nào đó giữa OD của một canh
trường và khối lượng tế bào có trong đó. Bằng việc đo OD của canh trường ở một
thời điểm nào đó, ta có thể suy ra được sự phát triển của vi khuẩn lactic và nhờ đó vẽ
được đường cong sinh trưởng.
Trước tiên cần xây dựng đường chuẩn sinh khối : Mẫu canh trường cần xác
định được ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút. Một lượng xác định sinh khối vi khuẩn
được pha loãng trong nước cất đến các nồng độ : 1/1, 1/2, 1/4, 1/8,...Xác định OD
của dung dịch sau pha loãng. Vẽ đường chuẩn sinh khối biểu diễn mói quan hệ giữa
OD và lượng sinh khối. Như vậy cũng xác định được OD giới hạn của vùng tuyến
tính.
Bước sóng sử dụng trong trượng hợp này là
OD giới hạn
Vùng tuyến tính
OD(620nm)
Sinh khối (g/l)
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
20
2.2.3. Phương pháp hoá học
1/Xác định hàm lượng N tổng bằng phương pháp Kendan[5]
Phương pháp này được dử dụng để xác định hàm lượng N tổng số trong
dung dịch nấm men thuỷ phân.
2/Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov[3]
Phương pháp này được sử dụng để xác định hàm lượng đường trong môi
trường lên men.
3/Xác định hàm lượng axit lactic[4]
- Phương pháp chuẩn độ : Sử dụng dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn, chỉ
thị là phenolphtalein.
- Phương pháp dựng đường chuẩn : Đường chuẩn biểu diễn mối quan
hệ giữa thể tích dung dịch NaOH 0,1N sử dụng và hàm lượng axit
lactic.
2.2.4. Phương pháp sấy thu hồi sinh khối
1/ Sấy phun
Ly tâm canh trường sau nuôI cấy ở 6000 v/p trong vòng 10 phút. Sinh khối
thu được đem pha loãng với nước cất đến nồng độ thích hợp . Dịch thu được mang
đI sấy phun. Nhiệt độ vào là 40oC, nhiệt độ ra là 30oC.
2/ Sấy đông khô
Canh trường được trộn với chất độn theo tỉ lệ thích hợp rồi được ly tâm ở
6000v/p trong 10 phút. Hỗn hợp thu được được cho vào ống nghiệm (1/2 thể tích
ống) rồi đem đi lạnh đông trong vòng 24 giờ. Sấy đông khô mẫu ở chế độ nhiệt độ -
84
o
C. Chất độn sử dụng ở đây là pepton 1% và lactoza 30% so với lượng sinh khối
ẩm.
3/ Sấy chân không
Canh trường được trộn với chất độn theo tỉ lệ thích hợp rồi được ly tâm ở
6000v/p trong 10 phút. Hỗn hợp thu được mang đi sấy ở chế độ nhiệt độ 40oC. Chất
độn sử dụng ở đây là hỗn hợp tinh bột: glucoza: sữa tách béo (86:11:33) với tỉ lệ
chất độn : sinh khối ẩm là 14:1.
2.2.5. Phương pháp toán học [19]
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
21
Để đạt được mục đích nghiên cứu tối ưu của mình, chúng tôi đã chọn ma
trận DOEHLERT. Ma trận này cho phép tìm được vùng tối ưu trongkhoảng thời hạn
đã xhọn và thường dùng để tối ưu hoá. Ma trận còn cho phép phân chia rất cân đối
các điểm thí nghiệm trong giới hạn cùng đang nghiên cứu và cho phép đi xa hơn ra
ngoài giới hạn theo bất kì hướng nào. Dựa vào ma trận, chúng ta có thể thêm các
biến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận.
Số thí nghiệm cần tiến hành : N = k2 + k + 1 ( k là biến số độc lập)
Với k = 3, số thí nghiệm cần tiến hành là 13.
Từ ma trận và kết quả thực nghiệm, chúng ta sẽ tìm ra được giá trị của các
hệ số trong các phương trình thực nghiệm có dạng :
Yi = bo + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11(X1)
2
+ b22(X2)
2
+ b33(X3)
2
+ b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
Yi : Các đại lượng cần xác định
bi : Giá trị của các hệ số
Xi : Các biến số
Kết quả thí nghiệm được xử lí bằng phần mềm NEMROD – New efficient
methodology for research using optimal design.
Phần 3 : Kết quả và thảo luận
3.1. Sơ tuyển chủng giống vi khuẩn lactic dùng cho quá trình tạo
sinh khối
Trong sản xuất, chất lượng chủng giống là yếu tố quan trọng quyết định sự
thành công của các quá trình lên men. Chủng giống càng đáp ứng được các
yêu cầu thì xác suất thành công của quá trình càng cao. Vì vậy, việc lựa chọn
chủng giống là cần thiết và phải tiến hành trước tiên.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
22
Với mục đích nghiên cứu chọn chủng có khả năng tạo sinh khối cao để
sản xuất tạo chế phẩm vi khuẩn lactic , chúng tôi sử dụng 4 chủng có kí hiệu
như sau: VTP, TL6, Lc.340, SD16.
3.1.1. Kiểm tra lại đặc tính của các chủng
Các chủng vi khuẩn lactic được hoạt hoá trong môi trường MRS lỏng
trong 24 h rồi cấy lên môi trường MRS đặc trong các hộp petri. Sau 48h, lựa
chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy giữ giống trong các ống thạch nghiêng.
Các chủng tiếp đó được kiểm tra lại các đặc tính trước khi sử dụng. Kết quả
thu được được tổng kết lại trong bảng 1 dưới đây.
Bảng 1 : Đặc tính của các chủng kiểm tra
Đặc điểm VTP SD16 TL6 Lc.340
Đặc điểm khuẩn lạc Tròn, trắng
ngà,d<2mm
Tròn, trắng
ngà, d<2mm
Tròn, trắng
sữa, d<2mm
Tròn, trắng ngà,
d<4mm
Hình dáng và cách sắp
xếp tế bào
Hình cầu, xếp
đơn hoặc đôi
Hình cầu, xếp
đơn hoặc đôi
Hình cầu, xếp
đơn hoặc đôi
Hình cầu, xếp
đơn, đôi hoặc
chuỗi ngắn
Tạo bào tử Không
Di động Không
Tạo catalaza -
Kiểu hô hấp Yếm khí tuỳ tiện
Nhuộm màu Gram +
4 chủng trên đều hình cầu, có đường kính khuẩn lạc <2mm, riêng khuẩn
lạc của chủng Lc.340 lớn hơn (4mm), Gram(+), yếm khí tùy tiện, không tạo
bào tử, không có khả năng di động, không có hoạt tính catalaza. Như vậy, cả 4
chủng đều có các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của nhóm vi khuẩn
lactic.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
23
Hình 1a : Khuẩn lạc chủng VTP
Hình 1b : Nhuộm Gram chủng VTP, x 1000
Hình 1c : Khuẩn lạc chủng SD16
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
24
Hình 1d : Nhuộm Gram chủng SD16, x 1000
Hình 1e : Khuẩn lạc chủng Lc.340
Hình 1f : Nhuộm Gram chủng Lc.340, x 1000
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
25
Hình 1g : Khuẩn lạc chủng TL6
Hình 1h : Nhuộm Gram chủng TL6, x 1000
3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic
Yêu cầu chúng tôi đặt ra là lựa chọn được những chủng có khả năng tạo
sinh khối cao, và có khả năng chịu nhiệt tương đối tốt. Dựa trên các yêu cầu
này, quá trình chọn chủng được tiến hành như sau:
Cỏc chủng vi khuẩn được nhân giống và nuôi cấy trong 100ml môi
trường MRS lỏng trong 24h. Việc lấy mẫu được tiến hành sau mỗi 4h trong
các điều kiện như nhau với cả 4 chủng. Mẫu được đem đi xác định hàm lượng
axit lactic (g/l) và đo OD. Ta thu được kết quả sau:
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
26
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
T(h)
O
D
6
2
0
n
m
VTP SD16 Lc.340 TL6
Hình 2. So sánh khả năng tạo sinh khối của 4 chủng vi khuẩn lactic
Hai chủng Lc.340 và VTP có pha tiềm phát tương đối dài hơn so với hai
chủng TL6 và SD16. Nhưng khi đã làm quen với môi trường, chủng Lc.340 lại
phát triển mạnh mẽ, vượt trội hơn hẳn các chủng còn lại. Chủng TL6 có pha
tiềm phát ngắn, sinh trưởng tương đối tốt. Lượng sinh khối đạt được cao nhất
sau 20 h đối với cả 4 chủng.
Để tiện cho việc so sánh, lựa chọn các chủng, chúng tôi tiến hành tính
toán hiệu suất thu hồi, hiệu suất lên men của các chủng. Kết quả được chỉ ra ở
bảng 2.
Bảng 2. So sánh hiệu suất thu hồi của 4 chủng
Các chỉ tiêu
Chủng vi khuẩn lactic
VTP TL6 Lb340 SD16
Sinh khối (g/l) 14,3 16,6 18,7 15,1
HS thu hồi sinh khối(%) 35,8 41,5 46,9 37,7
axit lactic(g/l) 5,2 6,5 8,4 5,5
HS lên men lactic(%) 26,1 32,4 42,2 27,5
HS thu hồi thực tế(%) 61,9 73,9 89,1 65,2
Dựa vào đồ thị và kết quả thu được, ta có thể kết luận: trong số 4 chủng
so sánh, chủng Lc.340 và chủng TL6 cú hiệu suất thu hồi sinh khối và lượng
axit lactic tạo thành cao, hiệu suất thu hồi sinh khối theo thứ tự là 46.9 %,
41,5%, lượng axit lactic tạo thành là 42,2% và 32,4%. Do đó, hai chủng này
được lựa chọn để nghiên cứu quá trình tạo sinh khối.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
27
3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh
khối
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối: pH, nhiệt độ,
nồng độ đường,Để thu được lượng sinh khối lớn, cần tạo điều kiện thích hợp
nhất cho sinh trưởng phát triển của các chủng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu các yếu tố sau:
Nhiệt độ
Mức độ thông khí
Nguồn N
Loại đường và nồng độ đường
Tỉ lệ tiếp giống
pH
3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong số các yếu tố ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình
sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Nhiệt độ có thể kích thích, kìm hãm,
thậm chí ức chế hoàn toàn sự sống của vi sinh vật. Mỗi chủng lactic đều có
khoảng nhiệt độ hoạt động tối ưu, vì vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ được chúng
tôi khảo sát trước hết:
Tiến hành nuôi cấy hai chủng vi khuẩn lactic Lc.340 và TL6 trên môi
trường MRS lỏng trong 48h ở các nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, và 37oC.
Đo OD của canh trường sau mỗi 6h. Vẽ đường cong sinh trưởng của các mẫu
và trên cơ sở đó chọn ra nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của mỗi
chủng.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
T(h)
O
D
6
2
0
n
m
25 oC 30 oC 37 oC
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
28
Hình 3a. ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo sinh khối của chủng
Lc.340
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
T(h)
O
D
6
2
0
n
m
25 oC 30 oC 37 oC
Hình3b ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo sinh khối của chủng TL6
Hình 7 và 8 thể hiện rõ tỉ lệ thuận giữa nhiệt độ với khả năng tạo sinh
khối của cả hai chủng TL6 và Lc.340. Lượng sinh khối thu được lớn nhất ở 37oC.
Để có thể đưa ra kết luận chính xác, việc tính toán các hiệu suất thu hồi và hiệu
suất lên men là thiết yếu.(Bảng 3)
Bảng 3: ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng của các chủng
Các chỉ tiêu
Nhiệt độ (oC)
Lc.340 TL6
25 30 37 25 30 37
Sinh khối(g/l) 12,2 18,8 23 12 16 19
HSTH sinh khối(%) 30,6 47 57,5 30 41 47,5
axit lactic(g/l) 7,4 8 7,9 7 8.8 8,4
HSLM lactic (%) 36,9 40 40 35 44 41,8
HSTH thực tế(%) 67,5 87 97,5 65 84 89,3
Trong vùng nhiệt độ nghiên cứu, chủng Lc.340 phát triển mạnh hơn
chủng TL6. Đối với cả hai chủng, từ 25-37oC, khả năng phát triển của các
chủng tăng cùng với sự tăng nhiệt độ. Hiệu suất thu hồi sinh khối đạt cao nhất
ở 37oC (57,5% đối với chủng Lc.340 và 47,5% đối với TL6). Điều này chứng
tỏ khả năng chịu nhiệt tương đối tốt của các chủng. Lượng axit lactic tạo thành
không có sự khác nhau đáng kể. Vậy nhiệt độ 37oC là nhiệt độ thích hợp cho
quá trình tạo sinh khối.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
29
3.2.2 ảnh hưởng của điều kiện thông khí
Điều kiện thông khí cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến
lượng sinh khối nhận được. Vì lý do này, cần phải lựa chọn điều kiện thông
khí thích hợp để nâng cao chất lượng của quá trình tạo sinh khối.
Nuôi cấy các chủng ở các điều kiện đảo trộn khác nhau: nuôi cấy tĩnh
hoặc lắc với tốc độ 100 vòng/phút, 200 vòng/phút, và khuấy trộn bằng khuấy
từ. Lấy mẫu và đo OD. Từ kết quả thu được, chọn ra chế độ thích hợp nhất cho
quá trình tạo sinh khối.
0
2
4
6
8
0 6 12 18 24 30
T(h)
O
D
6
2
0
n
m
TÜnh 100v/p 200v/p KhuÊy tõ
Hình 4a ảnh hưởng của điều kiện thông khí lên khả năng tạo sinh khối của
chủng Lc.340
0
2
4
6
8
0 6 12 18 24 30
T (h)
O
D
6
2
0
n
m
TÜnh 100 v/p KhuÊy tõ
Hình 4b ảnh hưởng của điều kiện thông khí lên khả năng tạo sinh khối của
chủng TL6
Lượng sinh khối tạo thành có sự khác nhau đáng kể khi thay đổi các chế
độ thông khí khác nhau. Tốc độ khuấy càng cao thì sinh khối thu được càng
lớn.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
30
Chủng Lc.340 pha tiềm phát được rút ngắn khi tăng cường thông khí.
Còn đối với chủng TL6, khi thông khí bằng cách sử dụng khuấy từ thì pha
tiềm phát thể hiện không rõ rệt.
Bảng 4: ảnh hưởng của chế độ khấy trộn lên sinh trưởng phát triển các chủng
Môi trường
Lc.340 TL6
Tĩnh
Lắc (v/p) Khuấy
từ Tĩnh
Lắc(v/p) Khuấy
từ 100 200 100
Sinh khối(g/l) 18,7 22 25 33 16,4 23,9 31,3
HSTH sinh khối 46,9 55,1 62,5 82,5 40,9 47,8 62,5
axit lactic(g/l) 6,6 6,3 5,79 2,2 6,5 5,69 3,21
HSLM lactic(%) 33 31,7 29 11 32,4 28,5 16,1
HSTH thực tế 79,9 86,8 91,5 93,5 73,3 76,3 78,6
Chế độ đảo trộn có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi
khuẩn lactic. Nuôi cấy với tốc độ khấy trộn càng cao thì khả năng tạo sinh khối
càng lớn, cụ thể khi nuôi cấy dùng khuấy từ ở mức 5, hiệu suất thu hồi sinh
khối đạt được đối với chủng Lc.340 là 82,5% và đối với chủng TL6 là 62,5%
(tăng gấp đôi hoặc gấp rưỡi). Lượng axit lactic sinh ra giảm dần khi tăng tốc
độ đảo trộn. Như vậy để đạt được hiệu suất thu hồi sinh khối lớn thì phải tăng
cường quá trình đảo trộn, tuy nhiên do điều kiện thí nghiệm, quá trình nghiên
cứu tiếp theo chúng tôi chỉ tiến hành ở điều kiện đảo trộn là 100 v/p.
3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Môi trường MRS sử dụng pepton, cao men, cao thịt làm nguồn N. Các
sản phẩm này tuy có chất lượng cao nhưng giá thành rất đắt, đặc biệt là pepton.
Như vậy, việc ứng dụng sản xuất lớn sinh khối ở qui mô công nghiệp sử dụng
MRS làm môi trường nuôi cấy là không kinh tế. Chúng tôi đó sử dụng dịch
nấm men thủy phõn để thay thế dần các nguyên liệu đắt tiền này. Do điều kiện
thí nghiệm, quá trình khảo sát chỉ tiến hành với chủng Lc.340. Chủng vi khuẩn
được nuôi cấy trên các môi trường với các tỉ lệ thay thế dịch nấm men thủy
phân khác nhau, từ 0% đến 100%. Canh trường được đo OD sau mỗi 6h nuôi
cấy. Tỉ lệ tốt nhất thay thế nguồn N bằng nấm men thuỷ phân được xác định
dựa vào hiệu suất thu hồi sinh khối tính toán.
Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế
31
0
10
20
30
40
50
60
0% 25% 50% 75% 100%
Sinh khèi (g/l) HiÖu suÊt (%)
Hình 5 ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men thuỷ phân thay thế lên khả năng tạo sinh
khối của chủng Lc.340
Bảng 5: ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men thuỷ phân thay thế lên sinh trưởng và
phát triển của chủng Lc.340
Các chỉ tiêu
Tỉ lệ NMTP thay thế (%)
0 25 50 75 100
Sinh khối(g/l) 22,6 22,3 21,6 176 14,5
HSTH sinh khối(%) 56,5 55,7 54 43,9 36,2
axit lactic(g/l) 6,5 4,3 3,7 3,8 3,3
HSLM lactic (%) 32,4 21,4 18,5 19,2 16,6
HSTH thực tế(%) 88,9 77,1 72,5 63,1 52,8
Với tỉ lệ dịch nấm men thuỷ phõn thay thế là 50%, hiệu suất thu hồi sinh
khối đạt 54%. Ở tỉ lệ này, hiệu suất thu hồi sinh khối khụng nhỏ hơn nhiều so
với hiệu suất thu được khi sử dụng nguồn N từ pepton, cao men, cao thịt mà lại
thay thế được đáng kể nguồn N đắt tiền. Hơn nữa, lượng axit lactic tạo thành ở
tỉ lệ thay thế này ít hơn nhiều so với khi sử dụng môi trường MRS. Như vậy,
cú thể núi , thay thế nguồn N bằng dịch nấm men thuỷ phõn với tỉ lệ 50% là
chấp nhận được. Quá trình lên men từ
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- TP0156.pdf