Đồ án Nghiên cứu thu hồi sinh khối của chủng vi khuẩn lactic Lc.TL6 và ứng dụng trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả

nhu cầu về thực phẩm của một lượng lớn dân số. Bảng 3 đưa ra các ví dụ về các sản phẩm lên men từ rau và quả trên thế giới. Bảng 3 : Các sản phẩm rau quả lên men trên toàn thế giới [21] Địa điểm Loại sản phẩm Ấn độ Acar, Achar, Tandal achar, Garam nimboo achar Rau quả muối mặn Gundruk Rau khô muối Chanh muối, xoài muối Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 15 Đông Nam Á Asinan, Burong mangga, Dalok, Jeruk, Kiam-chai, Kiam-cheyi, Kong-chai, Naw-mai-dong Rau quả muối mặn Bai-ming, Leppet-so, Miang Lá chè lên men Nata de coco, Nata de pina Dịch quả lên men Nhật Bản, Hàn Quốc Bossam-kimchi, Chonggak-kimchi, Dongchimi, Kachdoo kigactuki, Kakduggi, Kimchi, Muchung- kimchi, Tongbaechu-kimchi, Tongkimchi, Totkal kimchi Lên men trong dịch muối Cha-ts’ai, Hiroshimana, Jangagee, Nara senkei, Narazuke, Nozawana, Nukamiso-zuke, Omizuke, Pow tsai, Red in snow Rau quả muối mặn Châu Phi Dấm từ các loại quả Dấm Lamoun makbouss, Mauoloh, Msir, Mslalla, Olive Rau quả muối mặn Ogili, Ogiri, hạt hibiscus Hạt rau và quả muối Vang Hoa quả muối Châu Mỹ Dưa chuột muối, bắp cải muối, thìa là muối Rau quả muối Hạt lupin Hạt cây có dầu muối Vani, vang Rau quả muối Trung Đông Kushuk Rau quả muối Lamoun makbouss, Mekhalel, Oliu, Torshi, Tursu Rau quả muối mặn Châu âu và toàn thế giới Oliu, Sauerkohl, Sauerruben Rau quả muối mặn Vang Hoa quả muối (G Campbell-Platt (1987)) Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 16 I.4. Sản xuất sinh khối vi khuẩn I.4.1. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh dưỡng rất phức tạp. Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH+4 [7]. Mặc dù đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn lactic vẫn đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như vitamin, axit amin, lipit, những chất này phải có trong môi trường lên men [7]. a. Nguồn cacbon Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit như: glucoza, lactoza, maltoza, saccaroza. Các nguồn cacbon này được sử dụng làm nguồn năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ khác như axit citric, malic, pyruvic, fumaric,axetic... Tuy nhiên các loài vi khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau. Khi không có mặt các cơ chất cacbon, vi khuẩn lactic sẽ sử dụng nguồn năng lượng từ các axit amin như glutamic, arginin, tyronin. Khi đó sẽ xảy ra quá trình decacboxyl hóa và tạo thành CO2. b. Nguồn nitơ Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều loại axit amin khác nhau vì vậy chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ để đảm bảo sự phát triển của mình. Ví dụ như Lactobacillus sake không thể phát triển được nếu thiếu các axit amin sau: glycin, phenylalanin, histidin, methionin, valin, prolin, theonin, tyrosin và arganin (Lauret và cộng sự, 1996). Axit amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzim proteaza và peptidaza ngoại hay nội bào. Vi khuẩn lactic cũng có thể đồng hóa các axit amin cần thiết cho sự phát triển của chúng từ nguồn nitơ phức tạp như dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt, pepton, trypton...Đây cũng chính là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp thì khó có thể sử dụng nguồn nitơ này vì nó rất tốn kém [15]. c. Nguồn vitamin [17] Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin, vì vậy cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất có chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 17 rốt, dịch chiết nấm men và nhiều chất khác. Các vitamin đóng vai trò là coenzim trong quá trình trao đổi chất của tế bào - một vai trò quan trọng không thể thay thế được. E.I.Kvasnikov và O.A.Hestrenko đã nghiên cứu quan hệ giữa các chủng và vitamin. Họ đã kết luận rằng yêu cầu về vitamin riêng biệt của từng vi khuẩn lactic có thể thay đổi khi trong môi trường có chứa các axit amin hoặc axit béo và dizoxylribosit. Mặc dù có rất nhiều các nghiên cứu khác nhau về nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic tuy nhiên họ đều có quan điểm chung rằng nhóm vitamin B rất cần thiết để kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic. Nhu cầu về vitamin còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như điều kiện nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường. Chẳng hạn nếu thay đổi nhiệt độ khoảng 3-4oC thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường bên ngoài của Lactobacillus helveticus thay đổi khoảng 25%. d. Các hợp chất vô cơ Để đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần phức hợp các chất cô cơ như đồng, sắt, mangan, natri, kali , photpho, lưu huỳnh, magiê... đặc biệt là mangan. Chính mangan ngăn cản sự tự phân của tế bào, tham gia vào cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzim, giải độc các tế bào khỏi sự có mặt của oxy. Mn2+ thay thế dioxyt dimustaza để thải các gốc O2-,, mặt khác mangan còn tham gia ổn định cấu trúc riboxom. e. Nhu cầu cation [17] Ngoài các công trình nghiên cứu về vai trò cụ thể của các cation trong các quá trình chuyển hoá, còn có ít nghiên cứu về vai trò tổng thể của các kim loại trong dinh dưỡng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, người ta cũng đã chứng minh được rằng, ion Fe 3+ , Mg 2+ , Mo 4+ , Se 4+, có thể ảnh hưởng đến dinh dưỡng của các cầu khuẩn lactic, hay các ion Mg 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ có ảnh hưởng đến phát triển của trực khuẩn, đặc biệt là Mg 2+. Riêng đối với Lactobacillus, các ion Mg2+, Mn2+, Fe2+ có ảnh hưởng thuận lợi đến khả năng phát triển và sinh axit lactic của chúng (Ledesma, 1976). I.4.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình trao đổi chất I.4.2.1. Ảnh hƣởng của oxy Nói chung các vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy, nhưng một vài loài (sống trong đường tiêu hóa của động vật) là yếm khí nghiêm ngặt. Khi có mặt của oxy các loài này không có khả năng photphoryl hóa, tổng hợp cytochrom, Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 18 tổng hợp enzim. Một số tác giả lại cho rằng nhờ vào flavo-protein oxy hóa hay peroxi hóa, các loài yếm khí nghiêm ngặt cũng có thể thực hiện quá trình photphoryl hóa khi có mặt của oxy nhưng không quá nhiều. Các loài vi khuẩn có phản ứng khác nhau với độ hiếu khí của môi trường thậm chí còn đối nghịch nhau. Trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt chỉ có trực khuẩn lên men dị hình bắt đầu phát triển còn trực khuẩn lên men dị hình sinh trưởng giảm 10%, lên men giảm 23%. Các cầu khuẩn lên men dị hình, lên men arabinoza đạt tối ưu trong sinh trưởng ở điều kiện yếm khí, còn các loài không sử dụng được pentoza thì phát triển kém trong điều kiện này. I.4.2.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ [14], [17] Người ta phân chia vi khuẩn thành ba nhóm theo giới hạn nhiệt độ phát triển của chúng (Desmazeaud và Roissanrt, 1994) - Nhóm ưa lạnh là những vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ dưới 7-10oC. - Nhóm ưa ấm là những vi sinh vật mà nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là trên nhiệt độ môi trường (20 oC) và dưới nhiệt độ cơ thể con người (37 oC). Lactobacillus thuộc nhóm này. - Nhóm ưa nhiệt là những vi sinh vật mà nhiệt độ phát triển tối thích cử chúng trên 40 o C. Đối với vi khuẩn lactic nhiệt độ giới hạn của chúng là từ 5-55 oC, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 20-45 oC. Còn đối với thực khuẩn thể nhiệt độ này chỉ khoảng 30-37 o C. I.4.2.3. Ảnh hƣởng của pH [17] Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động mạnh của pH. Nếu pH không thích hợp vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém, hay bị tiêu diệt. Chính vì vậy trong quá trình lên men lactic, khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH<3,8) [1]. Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4,0. Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng từ 4,5-6,5. Sự liên quan giữa pH đến hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu. Theo Giraud và cộng sự (1991) đối với vi khuẩn Lactobacillus plantarum A6, sự giảm pH sẽ làm giảm sự chuyển hóa cơ chất. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 19 I.4.2.4. Ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu. Màng tế bào của vi khuẩn Gram dương là màng bán thấm nên nồng độ muối có ảnh hường rất lớn đến khả năng phát triển của tế bào. Nếu trong môi trường có nồng độ muối lớn tế bào sẽ bị mất nước, chịu trạng thái khô sinh lí, co nguyên sinh chất và sẽ bị chết nếu kéo dài. Ngược lại nếu nồng độ muối trong môi trường thấp, nước sẽ xâm nhập vào trong tế bào làm áp lực tăng lên. Vi khuẩn lactic có thể bị ức chế nếu nồng độ muối > 5%, tuy nhiên một số loài có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn. Có thể tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic nếu bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 20 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - hoá chất - thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu  Chủng giống vi khuẩn : Một chủng vi khuẩn lactic thuần khiết Lactobacillus lactis của Viện Thực Phẩm và hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ nước dưa muối tự nhiên.  Nguyên liệu đầu : Giống rau cải bẹ Đông Dư được trồng ở xã Chiến Thắng, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên. Đây là giống cải bẹ có nguồn gốc từ xã Đông Dư, huyện Gia Lâm chuyên dùng để muối dưa và được trồng phổ biến ở phía bờ Bắc sông Hồng. Các loại nguyên liệu khác như cà pháo, cải thảo, dưa chuột... được mua từ chợ Bách Khoa. 2.1.2. Hoá chất Các hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu gồm:  Các loại đường: Glucoza, saccharoza, maltoza, raffinoza, lactoza, galactoza, mannitol, Pháp  Cao thịt (Extrait de viande) - Biokar Dianogstique, Pháp  Cao men ( Extrait de levure) - Biokar Dianogstique, Pháp  CH3COONa (REACHIM, Liên Xô cũ)  KH2PO4 (Trung Quốc)  MgSO4.7H2O (Reanal, Hungary)  MnSO4.4H2O (Trung Quốc)  Pepton (Trung Quốc)  Thạch (Việt Nam)  Tween 80 (Merck, CHLB Đức)  Bromocresol tía (Trung Quốc) Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 21 2.1.3 Thiết bị  Kính hiển vi quang học OLYPIUS Model CHD Nhật Bản  Máy đo pH (744 pH Meter),  METROHM, Thuỵ Sỹ  Cân điện tử PB 303, METTRER TOLEDO, Thuỵ Sỹ  Cân điện tử SPB 54, SCALTEC, Canada  Micropipette Model P220, GILSON, Pháp  Tủ ấm Liên Xô  Máy đo OD 6300, JENWAY, Anh  Nồi hấp 3850M, Tuttnauer, Đức  Máy ly tâm 2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy  Môi trường MRS (Deman, Rogosa, Sharpe, 1960), g/l: Glucoza 20 ; pepton 10 ; cao nấm men 8 ; cao thịt 10 ; CH3COONa 2 ; K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; thạch 14 ; Tween 80 1ml ; nước cất 1000ml. Thanh trùng ở 1210C trong 20 phút, pH = 6 - 6,2. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung và trình tự nghiên cứu 1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu rau cải bẹ Cải được rửa sau hai lần nước, để ráo và xay bằng máy xay (lượng cải được xay có tỉ lệ đồng đều giữa lá, bẹ và ngọn). Lấy cải đã xay làm mẫu để phân tích các chỉ tiêu: a/ Xác định thành phần hoá lí  Hàm lượng chất hoà tan  Hàm lượng nước trong nguyên liệu  Hàm lượng đường tổng số  Hàm lượng axit hữu cơ tổng số  Hàm lượng vitamin C  Hàm lượng muối Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 22 b/ Xác định thành phần vi sinh  Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí  Kiểm tra tổng số nấm men, nấm mốc 2. Phân lập và chọn chủng a/ Tiến hành muối dưa tự nhiên, lấy nước dưa vừa muối để phân lập chủng vi khuẩn lactic. b/ Nghiên cứu các đặc điểm hình thái học và tế bào học của hai chủng phân lập được và đối chứng với các đặc điểm của chủng Lb. lactis  Quan sát khuẩn lạc  Soi tiêu bản sống  Nhuộm tiêu bản  Xác định khả năng di động  Xác định hoạt tính catalaza  Xác định khả năng lên men các nguồn đường khác nhau  Nhuộm Gram Các đặc điểm sinh lí, sinh hoá  Kiểu hô hấp  Nhiệt độ phát triển  Khả năng chịu mặn  Khả năng phát triển ở các pH khác nhau c/ Khảo sát khả năng chịu mặn của ba chủng : sử dụng các chủng này để muối chua rau cải bẹ, đánh giá cảm quan sản phẩm. Chọn chủng thích hợp cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả dựa vào kết quả thu được từ các nghiên cứu trên. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản xuất sinh khối vi khuẩn.  Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và động đến khả năng tạo sinh khối lactic.  Khảo sát ảnh hưởng của chế độ duy trì pH trong quá trình nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối lactic.  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối lactic. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 23 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí [7] Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí nhằm đánh giá chất lượng nguyên liệu về mặt vi sinh vật học. Nguyên tắc: Nuôi cấy một lượng sản phẩm nhất định trên môi trường đặc trong hộp petri. Sau một thời gian nuôi cấy nhất định, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc tương ứng. Từ số khuẩn lạc trong hộp thạch tính được số vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu cần phân tích. Tiến hành : Sử dụng một lượng rau cải đã nghiền nhỏ, pha loãng, sau đó dùng micropipet lấy 0,1 ml để nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng đựng trong hộp petri ở nhiệt độ 30  10C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 24 - 72h. Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó. Môi trường nuôi cấy, g/l: Pepton 5 Thạch 15 Cao men 2,5 Nước 1000ml Glucoza 4 Tổng số vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau: C N = ( n1 + 0,1 n2) d C : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Số khuẩn lạc đếm được trong một đĩa phải nhân với hệ số 10 (quy cho 1 ml canh trường). n1 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất n2 : Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ hai d : Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 24 2. Xác định khả năng di động [6] Khả năng chuyển động của vi khuẩn lactic được nghiên cứu trên môi trường bán lỏng có thành phần như sau, g/l: Pepton 5 Thạch 15 Cao men 8 Tween80 0,5ml Cao thịt 5 Kali xitrat 1 MnSO4.4H2O 0,04 Bromocresol tía1,6% 2,8ml Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 1210C trong 20 phút, pH của môi trường là 6,5. Nhỏ một giọt dịch có chủng nghiên cứu vào chính giữa hộp petri (không giàn đều bằng que gạt). Sau một thời gian phát triển, nếu vi khuẩn có khả năng chuyển động thì axit hữu cơ sinh ra sẽ khuếch tán đều về các phía và làm thay đổi màu của chất chỉ thị trên bề mặt hộp Petri. Nếu vi khuẩn không có khả năng chuyển động thì sự thay đổi màu chất chỉ thị chỉ được quan sát thấy ở xung quanh giọt chất lỏng nhỏ vào. 3. Nhuộm màu Gram [12] Việc nhuộm màu Gram được tiến hành với những tế bào còn non, thường là các giống nuôi cấy một ngày đêm. Thao tác nhuộm được tiến hành như sau: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên trên phiến kính, dàn đều. Làm khô vết bôi trong không khí và cố định trên ngọn lửa. Nhuộm vết bôi bằng tím gentian trong 1 - 2 phút, sau đó đổ thuốc nhuộm đi, xử lí bằng dung dịch Lugol trong 1 - 2 phút cho đến khi thẫm lại. Đổ dung dịch Lugol đi rồi khử màu bằng etanol 96% trong 0,5 - 1,0 phút. Rửa sạch tiêu bản bằng nước sau đó nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin. Đợi tiêu bản khô thì quan sát bằng vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ. 4. Xác định khả năng tạo catalaza [14] Catalaza là một enzyme xúc tác phản ứng phân huỷ H2O2 thành nước và oxy không khí. Tất cả các vi khuẩn hiếu khí đều có hoạt tính catalaza. Sự có mặt của enzyme này rất quan trọng đối với sự phát triển của vi khuẩn lactic. H2O2 mất đi được nhận biết bởi sự tạo ra bọt oxy trên bề mặt của các khuẩn lạc. 5. Xác định khả năng lên men các nguồn đường [8] Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần như sau, g/l : Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 25 NH4H2PO4 1 Bromocresol tía (1,6%) 1 ml KCl 0,2 Đường (*) 10 MgSO4 0,2 Agar 15 (*) : Glucoza, saccharoza, maltoza, dextrine, raffinoza, galactoza, lactoza, manitol Thanh trùng môi trường ở 1210C trong 21 phút, pH của môi trường từ 6,8 – 7. Nuôi cấy vi khuẩn được bảo quản trong ống thạch nghiêng MRS trong môi trường trên trong 7 ngày ở 300C. Nếu vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit và làm giảm pH của môi trường, màu của chỉ thị sẽ chuyển sang vàng. 2.2.2.2. Phƣơng pháp hoá lý 1. Xác định hàm lượng chất hoà tan Hàm lượng chất hoà tan được xác định bằng chiết quang kế (Refractometer). Dịch rau, quả sau khi lọc ép được khuấy đều và lấy 1 - 2 giọt nhỏ vào chiết quang kế, đọc chỉ số trên chiết quang kế, đơn vị đo là 0Bx ở 200C. 2. Xác định hàm lượng nước trong nguyên liệu theo phương pháp sấy Nguyên tắc: nguyên liệu được sấy đến trọng lượng không đổi.Căn cứ vào khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy, tính được hàm lượng nước trong nguyên liệu. Tiến hành: Lấy một chén nhôm hoặc sứ đem sấy ở 1050C đến trọng lượng không đổi, đặt chén trong bình làm khô đến khi nguội và cân chén (chính xác đến 0,001g). Sau đó cho vào chén 10g mẫu, sấy sơ bộ ở 500C trong 1giờ sau đó sấy ở 105oC. Sau khoảng 3 h lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân, rồi lại đặt trong tủ sấy tiếp khoảng 30 phút rồi lại đặt trong bình hút ẩm và cân. Đến khi sai số giữa hai lần cân không quá 0,001g thì xem như quá trình sấy kết thúc. Tính kết quả: X: Hàm lượng nước có trong nguyên liệu (%) G1: Trọng lượng chén và mẫu trước khi sấy (g) G2: Trọng lượng chén và mẫu sau khi sấy (g) G: Trọng lượng chén không (g) 3. Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Graxianop [6] 100* G1G 2G1GX    Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 26 Cơ sở của phương pháp : phương pháp dựa trên phản ứng: 2K3Fe(CN)6 + KOH 2 K4Fe(CN)6 + H2O + O Tiếp theo oxy nguên tử sẽ oxy hóa đường tạo thành axit saccaric: CH2OH(CHOH)4CHO + O COOH(CHOH)4COOH Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 27 Phản ứng tổng là: 4K3Fe(CN)6 + 4 KOH + CH2OH(CHOH)4CHO 4 K4Fe(CN)6 + COOH(CHOH)4COOH + H2O Tiến hành : - Chuẩn bị dịch đường đem phân tích: Cân 50 gam mẫu đã nghiền nhỏ cho vào một bình định mức 250 ml, thêm nước cất tới 3/4 bình rồi đun cách thủy ở 70--80oC trong thời gian 30--45 phút, trong thời gian đun thỉnh thoảng lắc mạnh để chất hòa tan được hòa tan hoàn toàn. Sau đó làm nguội và thêm nước cất tới vạch định mức rồi đem lọc. Sau khi lọc xong lấy 100 ml dịch lọc cho vào bình định mức 250 ml, thêm vào 5--7 ml axit HCl đặc rồi thủy phân ở 75--80oC trong 5 phút. Thủy phân xong đem trung hòa axit dư bằng dung dịch NaOH 30%, rồi thêm nước cất tới vạch định mức ta được dịch đường. - Xác định đường: Lấy 20ml Ferixianua kali 1% và 5ml KOH 2,5N cho vào bình tam giác, nhỏ thêm vài giọt xanh metylen, lắc đều, đun sôi trong 1 - 2 phút. Sau đó dùng dung dịch đường để chuẩn tới khi màu xanh metylen chuyển sang vàng rơm. Tính kết quả: D: Hàm lượng đường trong mẫu (g/l) V: Số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn hết 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% a: Lượng glucoza tương ứng với 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% 4. Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp trung hòa [6] Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp là dựa trên phản ứng trung hòa giữa axit và kiềm. Từ lượng kiềm tiêu hao, tính được lượng axit tổng số có trong mẫu. Tiến hành - Cân 5 - 10g mẫu, nghiền nhỏ bằng cối sứ, thêm vào khoảng 50ml nước cất và đun cách thuỷ ở nhiệt độ 700C -80oơtrong 30-45 phút. Sau đó làm nguội tới nhiệt độ thường rồi định mức đến thể tích 100ml bằng nước cất rồi đem lọc. 100* V a D  Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 28 - Lấy 50 ml nước cất nóng cho vào một bình tam giác 250 ml, thêm vài giọt phenolphtalein rồi dùng NaOH 0,1N đến màu hồng nhạt.Sau đó cho vào bình tam giác 20 ml dịch lọc rồi dùng dung dịch NaOH 0,1 N chuẩn đến màu tương tự. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 29 Tính kết quả: X: Lượng axit hữu cơ hoà tan trong mẫu (%) a: Lượng NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) k: Lượng axit tương ứng với 1ml NaOH 0,1N V: Thể tích mẫu pha loãng (ml) v: Lượng dung dịch lấy để chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 5. Xác định hàm lượng Vitamin C [6] Hàm lượng vitamin C được xác định bằng phương pháp chuẩn độ Iod 0,01N. Cân 5 - 10 g nguyên liệu cho vào cối sứ nghiền nhỏ, cho vào khoảng 50ml HCL 2% và để trong bóng tối 10 phút để lượng axit ascocbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn. Sau đó định mức đến 100ml bằng nước cất và đem lọc. Lấy 20 ml dịch lọc, thêm vào vài giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh lam. Tính kết quả: X: Lượng Vitamin C có trong nguyên liệu (mg%) a: Lượng dung dịch I2 0,01 N dùng để chuẩn độ (ml) V: Thể tích mẫu pha loãng (ml) 0,00088: Lượng Vitamin C tương đương với 1ml I2 0,01N v: Lượng dung dịch đem chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 6. Xác định hàm lượng muối [6] Nguyên tắc: phương pháp dựa trên phản ứng sau: AgNO3 + NaCl = AgCl + NaNO3 Khi phản ứng kết thúc thì lượng AgNO3 dư sẽ phản ứng với kali cromat và cho kết tủa màu đỏ gạch. Nhờ đó ta nhận biết được điểm tương đương rõ nét hơn. 2AgNO3 + K2CrO4 = Ag2CrO4 + AgNO3 a . k .V X = x 100 v . g a . 0,00088 . V. 100 X = x 1000 v . g Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 30 Tiến hành : Cân 5 - 10g mẫu, nghiền kỹ bằng cối sứ, định mức lên 100ml bằng nước cất nóng, lắc đều và đem lọc. Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình tam giác, thêm vài giọt kali cromat10% sau đó đem chuẩn độ bằng AgNO3 0,1N đến khi dung dịch có màu đỏ gạch. Tính kết quả: X: Hàm lượng muối ăn (%) A: Thể tích AgNO3 dùng chuẩn độ (ml) 0,00584: Lượng muối ăn ứng với 1ml AgNO3 0,1N V: Dung tích bình định mức (ml) v: Thể tích dung dịch đem chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 7. Xác định axit lactic - Phân tích định tính: Lấy vào ống nghiệm 5 - 7ml dịch cần nghiên cứu, thêm 1ml H2SO4 10% và vài giọt KMnO4 2%. Trên miệng ống đặt một miếng giấy lọc có tẩm dung dịch AgNO3 pha trong NH4OH (1 - 2ml dung dịch AgNO3 10%, thêm vài giọt NH4OH). Đun sôi ống nghiệm. Giấy lọc sẽ đen nếu trong dịch nghiên cứu có axit lactic. - Phân tích định lượng:  Phương pháp chuẩn độ: Trong trường hợp không yêu cầu độ chính xác cao có thể định lượng axit lactic bằng cách dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ, chất chỉ thị là phenolphtalein.  Phương pháp đường chuẩn: Dùng nước dưa muối sau 2 ngày để pha loãng axit lactic tinh khiết 86% thành các nồng độ từ 1 đến 5%. Sử dụng NaOH 0,1N chuẩn 10ml axit lactic ở các nồng độ trên và vẽ thành đồ thị quan hệ giữa số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn 10ml axit lactic có nồng độ khác nhau. Khi chuẩn axit lactic trong dưa, từ số ml NaOH chuẩn 10ml nước dưa, dựa vào đồ thị và phương trình hồi qui ta suy ra số g axit lactic có trong dưa. Đồ thị được trình bày ở phần phụ lục. a . 0,00584 . V X = x 100 v . g Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 31 PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thích hợp sử dụng cho quá trình lên men lactic các sản phẩm rau quả Như đã nói ở phần tổng quan, các sản phẩm muối chua hiện nay ở nước ta chủ yếu được làm theo phương pháp thủ công, lên men tự nhiên, cho chất lượng không đồng đều, thời gian lên men dài, thời gian bảo quản lại ngắn. Trong khi đó trên thế giới, đặc biệt là một số nước châu Á các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở quy mô công nghiệp. Trong quá trình sản xuất, để tăng chất lượng sản phẩm người ta đã sử dụng chủng vi sinh vật lên men lactic thuần khiết. Sản phẩm không những có chất lượng tốt, ổn định mà còn có thể bảo quản trong thời gian dài. Do vậy, một trong các mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là tìm ra chủng vi khuẩn lactic thuần khiết, thích hợp cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả. 3.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, hoá sinh của các chủng vi khuẩn phân lập Sử dụng môi trường MRS thạch để phân lập vi khuẩn lactic có trong mẫu nước dưa muối chua tự nhiên sau 48 giờ. Từ các khuẩn lạc riêng rẽ, chúng tôi đã phân lập được một số chủng vi khuẩn sau đó chọn ra hai chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt nhất để tiếp tục nghiên cứu, ký hiệu là chủng TL5 và TL6. Xác định một số đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh của hai chủng này và so sánh với chủng Lactobacillus lactis, kết quả thu được trình bày ở các bảng 1, 2 và 3. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 32 Bảng 1 : Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu Đặc điểm TL5 TL6 Lb.lactis Đặc điểm khuẩn lạc Tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, khô, mép răng cưa Tròn, trắng sữa, bề mặt nhẵn bóng Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, Hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp tế bào Hình cầu, xếp đơn, đôi hoặc chuỗi Hình cầu, xếp đơn đôi Hình que mảnh, xếp đơn đôi Sinh trưởng trên môi trường MRS lỏng Sinh trưởng tốt, có cặn, không đục Sinh trưởng tốt, đục, có cặn Sinh