Đồ án Quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm tươi

ulose. Hình 2: 1) chitin; 2) chitosan; 3) xenlulose I.5: Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của chitin I.5.1: Cấu trúc hóa học của chitin: Chitin I có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin [3]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N – acetyl – D – glucosmin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm – CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm – NHCOCH3, thì các cầu trúc α, β, γ – chitin được mô tả như sau: Hình 3: sắp xếp các mạch trong phân tử chitin α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuậ lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ – chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β – chitin) và hai song song một ngược chiều (γ – chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β – chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nhiều nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N – acetyl – β – D – glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β – 1,4 – glucozit. Công thức cấu tạo của chitin: Tên gọi: poly(1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose; poly(1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose. Công thức phân tử: [C8H13O5N]n. Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n. I.5.2: Tính chất hóa lý của chitin [4] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu… nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8% [5], tan trong hexafluoro – isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafuoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [6]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1. Chitin tồn tại với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 – 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan: Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra chitosan – chất có nhiều ứng dụng như: ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm (màng bao gói, bảo quản thực phẩm), là chất trung gian điều chế ra glucosamine có nhiều tác dụng trong y học. Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamine: Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra Glucosamine là một loại thuốc có tác dụng chống thoái hóa khớp. Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. I.6: Phương pháp thu nhận chitin I.6.1: Phương pháp hóa học chitin Phế liệu tôm tươi Khử protein bằng NaOH 4%, T = 300 0C , = 24 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Kiểm tra hàm lượng protein Rửa trung tính Khử khoáng bằng HCl 4%, 24 giờ, 3000C Kiểm tra hàm lượng protein Cao hơn 5% Cao hơn 5% Chitin có thể được sản xuất theo phương pháp hóa học như sau: Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng độ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác. Nồng độ NaOH thường dùng được sử dụng trong khoảng 1 – 10 % và ở nhiệt độ 50 – 100 0C. Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH. Quá trình khử khoáng cũng diễn ra với thời gian dài, nồng độ axit cao, nhiệt độ cao. Như vậy phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến chất lượng chitin, không tận thu được các thành phần có giá trị khác (chất màu, protein làm thức ăn cho gia súc…) và như thế không giảm được giá thành sản phẩm, không nâng cao được hiệu quả cho việc sản xuất chitin. I.6.2: Phương pháp cơ học Nguyên lý: sử dụng các lực cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ tôm. Quá trình được tiến hành như sau: đầu tôm còn tươi đem rửa sạch, sau đó ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu protein đem sấy khô và bảo quản. hiệu quả thu hồi protein của phương pháp này không cao. Tuy nhiên, quá trình này đã loại bỏ được một phần protein tự do trong đầu tôm vì vậy giảm thiểu được hóa chất sử dụng cho các công đoạn tiếp theo. I.6.3: Phương pháp hóa lý Áp dụng phương pháp này nhằm thu hồi protein từ dịch thủy phân của công nghệ sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dung axit để điều chỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein, sau đó dùng các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein. Dịch protein Kết tủa protein Lắng, gạn Kết tủa protein Lọc thu protein Lọc thu protein Phơi sấy Bột protein Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ làm, có thể thu hồi với hiệu suất cao. Cho phép thu được hầu hết các protein hòa tan do đó có thể ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thủy sản. I.6.4: Phương pháp sinh học Trong phương pháp sinh học chỉ khác ở công đoạn khử protein và deacetyl không sử dụng hóa chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzym để loại bỏ protein một cách triệt để. Sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất. Việc sử dụng phương phap sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm có thể cao, tùy thuộc vào loại enzym sử dụng. Việc loại bỏ hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hóa học nhưng rất khó đạt được bằng phương pháp sinh học. Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một trong những khó khăn trong phương pháp hóa học để sản xuất chitin là thể tích chất thải lớn và trong đó có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý với khối lượng lớn. Những chất này do công đoạn khử khoáng và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học có thể gây nên sự thủy phân polymer, biến đổi tính chất vật lý và gây ô nhiễm môi trường. Ngược lại, trong phương pháp sinh học khối lượng chất thải không lớn, protein sau thủy phân có thể thu hồi làm thức ăn gia súc và bên cạnh đó có thể thu hồi các chất màu. Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý môi trường. Vì vây, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng nhất hơn về các đặc tính lý hóa thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý êm dịu hơn như viêc sử dụng enzym. Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzym proteaza và vi khuẩn có khả năng tạo proteaza để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hóa học. Hall và De Silva (1994) đã đề xuất phương pháp khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic như một phương pháp bảo quản phế liệu. Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới. Ủ chua là một quá trình đơn giản của việc bản quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và đã được ứng dụng cho bản quản cá trong nhiều năm (Hall và De Silva, 1994). Quy trình sản xuất chitin theo phương pháp sinh học của Nguyễn Thị Vân An: Vỏ tôm Xay Khử Protein Khử khoáng Sấy khô Chitinn Nhận xét: chitin thu được có hàm lượng protein và khoáng rất thấp, sản phẩm chitin có màu sắc đẹp. Điều này có thể giải thích do trong quá trình khử protein bằng nước ép vỏ dứa thì đồng thời xảy ra quá trình khử khoáng nên liên kết giữa các muối Canxi và chitin bị cắt đứt càng tạo điều kiện cho quá trình khử khoáng và khử protein diễn ra một cách triệt để hơn. I.7: Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin trên thế giới và ở Việt Nam I.7.1: Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin trên thế giới Trước đây, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ) khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [7]. Gần đây xuất hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào việc sản xuất bột đầu tôm bằng phương pháp sử dụng enzym proteaza (Synowwiecki và Al – Khateeb, 2003; Mizani, 2005; Helenice Duarteda Holanda and Netto F.M, 2006) [9]. Quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng phương pháp enzym cho kết quả khả quan. Thủy phân đầu tôm bằng chế phẩm alcalaza thu được dịch thủy phân có nhiều các axit amin không thay thế rất thích hợp cho thức ăn gia súc (Mizani, 2005) [11] và tăng khả năng thu hồi protein trong dịch thủy phân và có thể dùng làm thức ăn cho cá [12], [13]. Mizani và Aminari đã chỉ ra rằng dùng enzym proteaza có thể tăng khả năng thu hồi protein từ 37% lên 45,7% [14]. Dịch thủy phân thu được bằng phương pháp sinh học có chứa các peptit có hoạt tính sinh học có thể dùng trong sinh học [12]. Thời gian thủy phân bằng enzym ngắn hơn phương pháp lên men. Enzym proteaza thường được dùng là papain, bromelain, pancreatin, chế phẩm alcalaza. Ưu điểm của phương pháp này là ngoài dịch thủy phân có thể thu hồi đồng thời chất sắc tố astaxanthin và chitin. Các nhận xét được trình bày dưới đây về các quy trình sản xuất chitin của tác giả Trần Thị Luyến. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman Vỏ tôm hùm Ngâm HCl 2M, nhiệt độ phòng, = 5 giờ, w/v = 1/ 10 Rửa trung tính, sấy khô, nghiền mịn Ngâm HCl 2M, nhiệt độ phòng, = 48 giờ, w/v = 1/ 2,5 Ly tâm Rửa trung tính Ngâm NaOH 1M, T =100 0C, = 42 giờ, w/v = 1/ 2,5 Ly tâm Rửa trung tính Ngâm NaOH 1M, T =100 0C, = 12 giờ, w/v = 1/ 2,5 Ly tâm Rửa sạch bằng ly tâm Sấy khô Chitin dạng bột màu kem Nhận xét: Quy trình này gồm nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65 giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất I.7.2: Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin ở Việt Nam Việc nghiên cứu, sản xuất chitin- chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay, Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam; Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản – viện nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản 2. Vỏ tôm khô Ngâm HCl 6N, nhiệt độ phòng, = 48 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Ngâm NaOH 8%, T = 100 0C, = 48 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Tẩy màu chitin Quy trình của GVC Đỗ Minh Phụng-Đại học Nha Trang (1980) Nhận xét: Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp. Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó dễ ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm, thời gian xử lý dài. b. Quy trình sử dụng enzym papain để sản xuất chitosan của PGS – TS Trần Thị Luyến ĐHTS Nha Trang. Vỏ tôm Ngâm HCl 10%, nhiệt độ phòng, 5 giờ, w/v = 1/10 Rửa trung tính Khử protein Rửa sạch Làm khô chitin Ngâm HCl 10%, nhiệt độ phòng, 5 giờ, w/v = 1/10 Vỏ tôm Nhận xét: Quy trình Papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Đặc biệt độ deacety, độ tan và hiệu suất quy trình có ưu thế hơn hẳn. Để nâng cao chất lượng chitosan có thể sử sụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng. Điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên cần nghiên cứu quá trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này. Cần tiếp tục sản xuất và chiết rút enzyme deacetylase để thay thế hoàn tất cho NaOH đặc trong công đoạn deacetyl. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1: Nguyên liệu nghiên cứu II.1.1: Nguyên liệu chính II.1.1.1: Phế liệu tôm: Phế liệu tôm sử dụng trong nghiên cứu là phế liệu tôm Sú. Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius. Thành phần hóa học: Protein: 51,42 % so với chất khô tổng số. Chất khoáng tổng số: 23,26 % so với chất khô tổng số. Thu mua tại Công ty cổ phần chế biến và xuất khẩu thủy sản Phú Minh Hưng – Thị trấn Quảng Yên, huyện Quảng Yên, tỉnh Quảng Ninh. II.1.1.2: Enzym ancalaza: Sử dụng ancalaza của hãng Novo Đan Mạch. Hoạt lực enzym: 638 U/ml. II.1.1.3: Natrihydroxit: Sử dụng natrihydroxit dạng tinh thể. Công thức phân tử: NaOH M = 40.00 II.1.2: Hóa chất phụ: Các hóa chất phụ chủ yếu dùng cho quá trình phân tích gồm: Muối đồng sulfate (CuSO4. 5H2O) BSA ( Bovine Standard Albumin) Natri – Kali tartrat ( KNaC4H4O6. 4H2O) Tất cả các hóa chất trên được sử dụng ở dạng chế phẩm thương mại. II.2: Phương pháp nghiên cứu: II.2.1: Phương pháp nghiên cứu: Sản xuất chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp sinh học và sinh học kết hợp hóa học theo quy trình công nghệ như sau: Phế liệu tôm xay Khử protein lần 1 Khử khoáng.. Khử protein lần 2 bằng enzym alcalaza Sấy khô chitin Khử protein lần 2 bằng NaOH 1% Sấy khô chitin Quá trình khử protein: Tiến hành thí nghiệm để tìm ra những điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein dưới ảnh hưởng của các yếu tố: Nhiệt độ: 50 0C – 65 0C. pH: 8 – 9. Lượng enzym: 1 – 2 ml. Thời gian thủy phân : 90 – 240 phút. Quá trình khử khoáng ( sử dụng axit lactic): Tiến hành khử khoáng với axit lactic nồng độ 75 g/l, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 tiếng. II.3: Phương pháp phân tích: II.3.1: Xác định độ ẩm (hàm ẩm) Độ ẩm của nguyên liệu, chitin được xác định bằng phương pháp sấy mẫu ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi. II.3.2: Xác hàm lượng tro: Cân 2g mẫu đã xác định độ ẩm vào chén sứ đã được sấy ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi sau đó tiến hành nung ở nhiệt độ 6000C trong vòng 4h. Làm nguội trong bình hút ẩm. Hàm lượng tro được tính theo công thức: Trong đó: W1 : Khối lượng của cốc sau khi sấy ở 105oC trong 2 giờ W2 : Khối lượng của cốc và mẫu sau khi sấy ở 105oC trong 24 giờ W3 : Khối lượng của cốc và mẫu sau khi nung ở 600oC trong 4 giờ II.3.3: Xác định hàm lượng protein (phương pháp Biuret) - Chuẩn bị thuốc thử Hoà tan 1,5 g CuSO4 và 6 g Natri – Kali tartrat và khuấy thật kĩ (trong 500 ml nước cất) Thêm 300 ml NaOH 10% vào dung dịch, khuấy đều. Định mức thành 1 lít bằng nước cất để được dung dịch có nồng độ protein hoà tan là 10 mg/ml (0,1 g/ 10 ml nước cất) Xây dựng đường chuẩn bằng những dung dịch có nồng độ protein hoà tan từ 0 – 0,8 mg/ml Thêm 4 ml thuốc thử Buire vào mỗi ống nghiệm, lắc đều và để yên trong 30 phút. -Phương pháp tách chiết protein bằng NaOH Cân 1 g mẫu và cho vào ống ly tâm. Thêm 10 ml NaOH 3% vào ống và để qua đệm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, đun nóng ống lên 90oC trong 1 giờ. Làm lạnh hỗn hợp xuống nhiệt độ phòng và lọc hỗn hợp. Nồng độ protein được phân tích ở phần vừa được lọc ra. Nước lọc được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phúttrong 15 phút để chắc chắn rằng nước lọc đã được loại bỏ hoàn toàn các hạt nhỏ. Dịch protein thuỷ phân sau khi lọc (dịch trong) được pha loãng đến khoảng nồng độ của đường chuẩn đã được xây dựng. Sau khi pha loãng, 1 ml dịch thuỷ phân được trộn lẫn hoàn toàn và 4 ml thuốc thử Buiret và nồng độ của dung dịch được đo bằng độ hấp thụ ở 570 nm II.3.4: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Sử dụng quy hoạch bậc hai trực giao để lập ma trận thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm theo ma trận đó và đưa ra kết quả ưu hóa theo mô hình tối ưu. II.3.5: Xử lý số liệu Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Design-Expert 7.1, để phân tích ác hệ số hồi quy, bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa thuật toán hàm mong đợi. Các bước thực hiện bài toán quy hoạch: Chọn các yếu tố ảnh hưởng Chọn hàm mục tiêu Y Chọn miền khảo sát Tiến hành tối ưu hóa CHƯƠNG III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN III.1: Kết quả nghiên cứu về nguyên liệu: Kết quả nghiên cứu thành phần chính của nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1 như sau: Bảng 3.1: Kết quả thành phần hóa học của đầu tôm nguyên liệu STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả 1 Độ ẩm (%) 77,80 2 Hàm lượng tro tổng số (%) 23,26 3 Hàm lượng protrin (%) 51,42 Bảng 3.2: Kết quả tham khảo thành phần hóa học của đầu tôm nguyên liệu STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả 1 Độ ẩm (%) 77,5 ± 1,2 2 Hàm lượng tro tổng số (%) 24,6 ± 0,8 3 Hàm lượng protein (%) 47,4 ± 1,8 Như vậy: kết quả nghiên cứu tho thấy độ ẩm và thành phần khoáng tương đối gần nhau. Hàm lượng protein của tôm nguyên liệu cao hơn so với kết quả tham khảo (51,42 >47,4 ± 1,8). Điều này được giải thích như sau: Do kĩ thuật bóc vỏ nên trên đầu tôm còn sót lại thịt tôm Do trong phế liệu tôm còn có những con tôm bị ươn, hỏng không được sử dụng để chế biến thực phẩm Do tỷ lệ giữa các thành phần trong vỏ tôm không ổn định, chúng thay đổi theo mùa vụ, theo giống, theo giống, loài và đặc điểm sinh thái, sinh lý III.2: Kết quả nghiên cứu quá trình sản xuất chitin: III.2.1. Giai đoạn khử protein lần 1: Chitin là một polysaccarit cao phân tử, trong vỏ tôm nó liên kếtvới protein bằng liên kết cộng hóa trị mạnh (Brine, 1991; Roberts, 1992 ; Chang, 1997) . Quá trình khử protein trong vỏ tôm thực chất là quá trình thủy phân protein. Trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình này diễn ra dưới tác dụng của NaOH. Nghiên cứu của Percot và cộng sự (2003) đã chỉ rõ khi khử protein chỉ bằng NaOH năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu khá lớn vì vậy cần sử dụng NaOH có nồng độ cao, trong thời gian dài, dẫn đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng của protein tách ra. Trong nghiên cứu này, em sử dụng Enzym alcalaza là một proteza kiềm. Alcalaza sẽ xúc xúc tác cho phản ứng phân cắt các liên kết peptit trong phân tử protein tạo thành các axit amin hòa tan trong nước và các axit amin này sẽ được tách ra khỏi vỏ tôm trong quá trình rửa trung tính sau thủy phân. Do đó mà làm giảm lượng protein trong vỏ tôm. Bên cạnh đó có thể tận dụng dịch thủy phân protein làm thức ăn cho gia súc. III.2.1.1: Lựa chọn các yếu tố và miền khảo sát: Căn cứ vào đặc tính của enzym alcalaza, lựa chọn miền khảo sát như sau: - Nhiệt độ thủy phân : từ 50 – 65 0C. - pH của dịch thủy phân: từ 8 – 9. - Thời gian thủy phân: từ 90 – 240 phút. - Lượng enzym thủy phân: từ 1 – 2 ml. Bảng 3.3: Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố khảo sát Yếu tố Ký hiệu Đơn vị Mức - a -1 0 +1 +a pH A 7,79289 8 8,5 9 9,20711 Nhiệt độ B 0C 46,8934 50 57,5 65 68,1066 Lượng enzym C ml 0,792893 1 1,5 2 2,20711 Thời gian D phút 58,934 90 165 240 271,066 III.2.1.2. Thiết lập mô hình Kết quả thực nghiệm khử protein theo quy hoạch trực giao bậc hai, bốn yếu tố được liệt kê trong bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein còn lại Std A: pH B: nhiệt độ (0C) C: lượng Enzym (ml) D: thời gian (phút) Hàm lượng Protein còn lại (% chất khô) 1 8.00 50.00 1.00 90.00 21.28 8 9.00 50.00 1.00 90.00 16.86 3 8.00 65.00 1.00 90.00 15.29 4 9.00 65.00 1.00 90.00 17.98 5 8.00 50.00 2.00 90.00 17.78 6 9.00 50.00 2.00 90.00 13.70 7 8.00 65.00 2.00 90.00 16.12 8 9.00 65.00 2.00 90.00 16.39 9 8.00 50.00 1.00 240.00 20.48 10 9.00 50.00 1.00 240.00 17.29 11 8.00 65.00 1.00 240.00 14.62 12 9.00 65.00 1.00 240.00 18.60 13 8.00 50.00 2.00 240.00 14.54 14 9.00 50.00 2.00 240.00 11.85 15 8.00 65.00 2.00 240.00 13.10 16 9.00 65.00 2.00 240.00 14.70 17 8.50 57.50 1.50 165.00 14.00 18 8.50 57.50 1.50 165.00 13.22 19 8.50 57.50 1.50 165.00 13.34 Khả năng khử protein được đánh giá bằng hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân và rửa trung tính. Hàm lượng protein còn lại càng thấp, khả năng khử càng cao. Lần lượt xét ảnh hưởng của từng yếu tố (khi giữ nguyên các yếu tố khác ở những giá trị xác định). III.2.1.2.a.Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử protein được thể hiện ở hình 3.3: Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH thủy phân đến hiệu quả của quá trình khử protein Dựa vào bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 50 – 60 0C. Nếu tăng nhiệt độ lên cao, ví dụ 65 0C sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme alcalaza vì độ bền và hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào độ bền nhiệt của protein enzyme, enzyme sẽ giảm dần hoạt tính, và nếu tăng quá cao, enzym sẽ bị vô hoạt. Cụ thể khi so sánh thí nghiệm số 14 và 16 ta thấy: ở cùng điều kiện pH = 9, thời gian thủy phân là 240 phút , hàm lượng enzym cho vào là 2 ml thì hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân ở 65 0C là 14,7 %, trong khi ở nhiệt độ 50 0C là 11,85 %. III.2.1.2.b.Ảnh hưởng của pH dung dịch thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng của pH đến khả năng khử protein được thể hiện ở hình 3.4: Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH dung dịch thủy phân và lượng enzym tới quá trình khử protein Hình 3.4 và bảng 3.3 cho thấy alcalaza là một proteaza kiềm. Và pH thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 8,5 – 9. Ở cùng điều kiện nhiệt độ 50 0C, thời gian 240 phút, lượng enzym là 1 ml, khi pH tăng thì khả năng khử protein tăng thể hiện ở thí nghiệm số 9 và số 10, khi pH = 8 hàm lượng protein còn lại là 20,48% nhưng khi tăng pH lên 9 thì hàm lượng protein giảm còn 17,29%. III.2.1.2.c. Ảnh hưởng của lượng enzym tới quá trình khử protein: Ảnh hưởng của lượng enzym tới quá trình thủy phân protein được thể hiện trên hình 3.5: Hình 3.5: Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ và lượng enzym đến hiệu quả của quá trình khử protein. Bảng 3.3 và hình 3.5 cho thấy khi nồng độ enzym càng tăng thì hiệu quả khử protein càng tăng. Qua nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy rằng quá trình tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm giải phóng ra enzym tự do thường trải qua 3 giai đoạn như ở sơ đồ dưới đây [10]: E + S ES P + E Giai đoạn thứ nhất: enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hởi năng lượng hoạt hóa thấp. Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. Giai đoạn thứ ba: tạo ra sản phẩm còn enzym được giải phóng ra dưới dạng tự do. Như vậy, với ưu điểm tạo ra enzym ở dạng tự do ở giai đoạn thứ ba sẽ quay vòng trở lại tiếp tục tham gia phản ứng thủy phân. Hơn nữa, cùng với lượng cơ chất không đổi khi hàm lượng enzym tăng sẽ tăng cường xúc tác cho phản ưng thủy phân đạt hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nếu lượng enzym cho vào quá cao sẽ gây lãng phí. Và cần lưu ý rằng, nếu phản ứng ở nhiệt độ cao và thời gian dài thì sẽ làm giảm hoạt lực của enzym, làm giảm khả năng xúc tác của enzym. Cụ thể khi so sánh kết quả thí nghiệm số 2 và số 6: ở cùng điều kiện nhiệt độ 50 0C, pH = 9.0 , thời gian thủy phân là 90 phút, khi lượng enzym là 1 ml thì hàm lượng protein còn lại là 16,86 % nhưng khi tăng hàm lượng enzym lên 2 ml thì hàm lượng protein còn lại giảm đáng kể chỉ còn 13,7 %. Như vậy hàm lượng protein còn lại giảm 18,74 %. III.2.1.2.d.Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein được thể hiện trong hình 3.6. Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian và lượng enzym đến quá trình khử protein Bảng 3.3 và hình 3.6 cho thấy, thời gian thủy phân càng lâu thì hiệu quả thủy phân càng tốt, hàm lượng protein còn lại càng thấp. Điều này được giải thích như sau: ban đầu, enzyme tiếp xúc với protein ở lớp ngoài của vỏ tôm, sau khi thủy phân protein ở lớp ngoài, các liên kết peptit bị cắt đứt, tạo các axit amin hòa tan vào dung dịch phản ứng do đó t