Dự thảo Luận án Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây amorphophallus konjac k. koch ở lâm đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết

cứu này, cây nưa A.konjac có hàm lượng glucomannan khá cao, chiếm 50% trọng lượng khô. Điều này có ý nghĩa cho việc phát triển cây nưa A.konjac tại Việt Nam [58]. Trần Thị Ý Nhi và cộng sự cũng đã bước đầu nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của glucomannan trên chuột nhắt trắng. Kết quả nghiên cứu cho thấy glucomannan từ cây A.konjac với liều 6g/kg cân nặng, tại thời điểm sau khi uống glucose 60 phút, có tỷ lệ tăng glucose huyết thấp hơn rõ rệt so với lô chứng. Tuy nhiên cơ chế của việc hạ glucose huyết của glucomannan chưa được làm rõ. TS.Lê Ngọc Hùng và cộng sự đã di thực cây nưa A.konjac từ Hà Giang và trồng thử nghiệm thành công tại Đà Lạt, Lâm Đồng. Cũng trong nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng được quy trình chế biến bột glucomannan tạo ra các thành phẩm bột nưa tinh chế và bột nưa loại gôm. Kết quả nghiên cứu đóng góp không nhỏ trong việc trồng Nưa và chế biến bột nưa trên địa bàn các tỉnh Tây Nguyên đem lại hiệu quả kinh tế cho đồng bào các dân tộc [93]. Như vậy, từ các tài liệu đã công bố cho thấy: 42 - Việc nghiên cứu tách chiết glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam đã được nghiên cứu. Tuy nhiên nghiên cứu mới tập trung phân tích glucomannan từ cây nưa A.konjac trong tự nhiên và di thực, nhân giống trồng trọt mà chưa có nghiên cứu đầy đủ về tách chiết và nghiên cứu cấu trúc và tính chất của glucomannan từ cây nưa A.konjac đã di thực và trồng thử tại Tây Nguyên. - Việc biến tính glucomannan đã có nhiều công bố khá phong phú trên thế giới, tuy nhiên chưa có công trình nào đề cập đến việc thủy phân glucomannan từ cây nưa Konjac tại Việt Nam. Và đặc biệt là việc đánh giá khả năng hạ đường huyết của glucomannan từ cây nưa A.konjac cũng như tìm hiểu cơ chế của việc hạ đường huyết thông qua hoạt hóa emzym AMPK glucomannan thủy phân chưa được nghiên cứu. 43 Chương 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu. 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu được dùng cho nghiên cứu là củ Nưa (thân củ) Amorphophallus Konjac K.Koch di thực từ tỉnh Hà Giang được trồng tại tỉnh Lâm Đồng trong 3 năm. Củ dùng cho nghiên cứu được thu vào tháng 10 năm 2016, đây là thời điểm củ của loài Nưa có hàm lượng glucomannan cao nhất. Mẫu được giám định tên khoa học bởi TS Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, tiêu bản được lưu giữ tại nhà lưới lưu mẫu ở tỉnh Đắc Nông của Trung tâm phát triển công nghệ cao - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Vi khuẩn Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis Trong nghiên cứu này đã sử dụng khuẩn lạc của 2 chủng Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis được cung cấp bởi phòng thí nghiệm nuôi giữ chủng vi sinh vật gốc để sản xuất chế phẩm sinh học AT- BiO của Công ty TNHH Sản xuất & Dịch vụ An Thái. Cả 2 chủng này đều là những vi khuẩn có lợi, an toàn sinh học và nguồn gốc xuất xứ rõ ràng và có bản giải trình tự gen của chủng gốc kèm theo phụ lục của luận án này. Các vi sinh vật hữu ích được mua chủng gốc từ Công ty cổ phần Công nghệ vi sinh và Môi trường. Hồ sơ chủng gốc đã ghi rõ về hoạt tính của 2 chủng vi khuẩn, cụ thể như sau: + Chủng Bacillus subtilis (TB2): Có hoạt tính sản sinh ra enzym thuỷ phân tinh bột, xenlulose, protein, lipit thành đường và các axit amin, tạo ra kháng sinh ức chế vi khuẩn gây bệnh. + Chủng Bacillus licheniformis (TB3): Có hoạt tính sản sinh ra enzym thuỷ phân tinh bột, xenlulose, protein, lipit thành đường và các acid amin, ức chế vi khuẩn gây bệnh trong tự nhiên. - Enzym endo-1,4 β-Mannanase (Bacillus sp.) EC 3.2.1.78Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 của công ty Megazyme. 44 - Tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát của chuột nhắt, CRL-1772) được cung cấp bởi hệ thống chủng chuẩn của Mỹ (American Type Culture Collection – ATCC) được lưu giữ trong nitơ lỏng. - Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) huyết thanh ngựa (HS) huyết thanh thai bò (FBS) của hãng Invitrogen-Đức. - Các kháng thể: anti-rabbit IgG HRP-linked antibody, anti-mouse IgG HRP- linked antibody kháng thể kháng AMPK-Thr172, kháng thể kháng AMPK tổng của hãng Cell Signaling Technologies (USA) kháng thể kháng -Actin của hãng Santa Cruz Biotechnology (USA). - Metanol, etanol, n-hexan, HCl, CH3COOH, KI, NaOH, KOH, NaHCO3, KNaC4H4O6.4H2O, 3,5-dinitro salicylic ... là hóa chất tinh khiết của hãng Merck. Một số loại hóa chất khác là hóa chất tinh khiết phân tích của Trung Quốc, sử dụng ngay không qua tinh chế. - Động vật: chuột nhắt trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 20- 30g, do học viện Quân y cung cấp. Động vật thí nghiệm sau khi mua về được nuôi 5 ngày trước khi thí nghiệm, được ăn viên thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội cung cấp, uống nước tự do. Hàng ngày chuột được nuôi bằng thức ăn tổng hợp. Chế độ quang kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối. 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu - Dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu gồm: cân phân tích, nhiệt kế, dụng cụ chứa tế bào (chai nuôi cấy đĩa petri đĩa 6 giếng đĩa 96 giếng), Màng nitrocellulose, cốc thủy tinh, bình tam giác và các dụng cụ khác. - Các thiết bị phân tích chính được sử dụng trong quá trình nghiên cứu gồm: +Tủ ấm lắc, bể ổn nhiệt, máy đo pH, tủ sấy, máy khuấy từ có gia nhiệt, máy ly tâm, tủ mát, tủ lạnh (4oC và -20oC), dụng cụ đếm tế bào, kính hiển vi soi ngược, nồi hấp khử trùng, máy điện di và chuyển màng bio-rad. + Phổ hồng ngoại: được ghi trên quang phổ kế hồng ngoại biến đổi Fouriern FTIR IMPACT trong vùng 400 - 4000 cm-1 tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa 45 học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu được sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60oC và ép viên với KBr. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được ghi trên máy Bruker ADVANCE- 500MHz ở nhiệt độ 80oC trong dung môi D2O – 1%CF3COOD tại Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; + Máy ly tâm Anke TGL-16G, tốc độ 16.000 vòng/phút, Trung Quốc + Thiết bị đông khô ALPHA 1-4LD - Đức, Phòng Polyme Thiên nhiên, Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. + Máy đo độ nhớt KU3 Brookfield, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. + Giản đồ nhiễu xạ tia X: được ghi trên máy nhiễu xạ Rơnghen SIEM NS D5000 tại Viện Khoa học Vật liệu – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với điều kiện đo: ống đồng: CuKα (α=0,15406nm), U=35KV, I = 35 mA, góc quét (ω-2θ) từ 5o50o; + Giản đồ phân tích nhiệt (ThermoGravimetric Analysis - TGA và Differential Scanning Calorimetry - DSC): được ghi trên máy Hãng Setaram (Pháp), Labsys Evo S60/58988 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mẫu đều được tiến hành phân tích trong môi trường khí quyển nitơ, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút từ nhiệt độ phòng đến 700oC. 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Tách, tinh chế và xác định cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây A.konjac 2.2.1.1. Tách glucomannan từ cây A.konjac K.Koch - Xác định hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac: Củ Nưa được rửa sạch đất cát, gọt sạch vỏ. Cân một lượng củ nưa (mtươi), thái lát dày khoảng 2÷3 mm, sấy ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50÷60oC đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng sau khi sấy khô (mkhô). Hàm lượng nước trong củ nưa được xác định theo công thức: 46 %H2O = mtươi−m ô mtươi × 100% (2.1) - Quy trình tách glucomannan theo phương pháp cải tiến hai giai đoạn được thực hiện theo sơ đồ 2.1. Thái lát Củ Amophophalus Konjac tươi Lát Amophophalus Konjac tươi Hỗn dich bột glucomannan trong etanol Bột KGM ướt Rửa sạch, bỏ vỏ Nhúng vào dd NaHSO3 0,25‰ Ly tâm, thu tủa Sấy khô, nghiền, sàng lọc Thổi, tách Bổ sung etanol tỉ lệ etanol/H2O 1/1,5 Bột KGM tinh chế Xay nghiền trong 20 phút Sơ đồ 2.1. Quy trình tách glucomannan từ củ A.konjac Quá trình tách glucomannan được thực hiện như sau: Bột KGM khô Thêm etanol 40%, 65oC Khuấy đều, ly tâm thu tủa 47 Bước 1: Củ nưa Konjac được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, thái lát nhỏ, nhúng vào dung dịch NaHSO3 0,25 ‰. Bước 2: Thêm dung dịch etanol/nước tỷ lệ 1:1,5 với tỷ lệ củ/dung môi là 1:2. Thời gian xay nghiền 20 phút. Bước 3: Ly tâm thu tủa (dạng sệt). Bước 4: Sấy khô hỗn hợp sản phẩm thu được bột konjac glucomannan (KGM). Bước 5: Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan bột KGM vào dung dịch etanol 40% gia nhiệt, khuấy đều, ly tâm thu tủa, bỏ phần dịch lọc. Lặp lại quá trình 3 lần thu được KGM tinh chế [59]. 2.2.1.2. Xác định hàm lượng glucomannan trong bột konjac glucomannan Hàm lượng glucomannan trong bột Konjac glucomannan được xác định bằng phương pháp 3,5-đinitrosalicylic axit (DNS). Nguyên tắc của phương pháp: Khi đun sôi hỗn hợp glucomannan và 3,5- đinitro salicylic axit, glucomannan sẽ bị thủy phân tạo thành D-mannose và D- glucose và bị khử thành hợp chất amino có màu nâu đỏ (màu đỏ cam). Hàm lượng glucomannan có trong mẫu sẽ được xác định thông qua tương quan giữa cường độ màu đo được bằng phương pháp quang phổ kế. a. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử : - Dung dịch A: hòa tan 6,9g phenol (1,07 g/cm3) trong 15,2 ml NaOH (10%), nâng thể tích lên thành 69 ml. Thêm 69 ml NaHSO3 vào dung dịch. - Dung dịch B: cho vào 300 ml NaOH (10%) 225 g Kali Natri tactrat (KNaC4H4O6.4H2O). Sau đó cho hỗn hợp dung dịch vào 880 ml 3,5-đinitro salicylic axit 1% (w/w). 48 Trộn dung dịch A và B, giữ mẫu trong bình màu nâu ở nhiệt độ thường để sử dụng trong 7÷10 ngày. - Pha các dung dịch: axit sulfuric (30 mol/l), NaOH (60 mol/l) - Dung dịch đệm axit focmic-NaOH (0,1 mol/l): nhỏ 1 ml axit focmic vào bình tam giác 250 ml, thêm tiếp 60 ml nước cất. Cân 0,25g NaOH đã hòa tan vào bình tam giác và pha loãng dung dịch lên thành 250ml. - Dung dịch chuẩn glucose (1,0 mg/ml): cân chính xác 0,1 g glucose tinh khiết bằng cân phân tích và hòa tan trong 100 ml nước cất. b. Xác định hàm lượng glucomannan - Xây dựng đường chuẩn glucose: lần lượt lấy 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2 ml dung dịch glucose chuẩn và 2 ml nước cất vào 6 bình tam giác 25 ml. Thêm 1,5ml 3,5- đinitrossalicylic axit vào dung dịch trên, khuấy và đun cách thủy dung dịch trong 5 phút trước khi làm lạnh. Thêm nước cất đến một thể tích nhất định và lắc dung dịch đến đồng nhất. Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm, sử dụng nước cất làm mẫu trắng. Ghi lại cường độ hấp thụ của dung dịch glucose tại các nồng độ khác nhau. Vẽ đường cong tiêu chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ glucose (trục X) vào cường độ hấp phụ (trục Y) hoặc thiết lập phương trình hồi quy với độ hấp thụ Y và nồng độ glucose X. - Chiết glucomannan: cân một lượng chính xác khoảng 0,1900÷0,20000g bột KGM vào bình chứa sẵn 50 ml dung dịch đệm axit focmic-NaOH, khuấy đều. Để dung dịch khuấy-trương ở nhiệt độ phòng qua đêm. Thêm dung dịch đệm fomiat đến thể tích 100ml. Khuấy dung dịch đến đồng nhất và ly tâm ở nhiệt độ 4000 vòng/phút trong 20 phút. Phần nổi lên trên là dịch chiết glucomannan. - Thủy phân konjac glucomannan: lấy 5ml dịch chiết glucomannan cho vào bình tam giác 25ml, thêm chính xác 2,5ml sulfuaric axit (3mol/lit) vào dung dịch, khuấy mạnh sau đó đun cách thủy trong 1,5 giờ, thêm 2,5 ml NaOH (6mol/lit), khuấy đều thu được dịch glucomannan thủy phân. - Xác định hàm lượng glucomannan: lấy 2 bình tam giác 25ml, cho vào mỗi bình 1,5ml 3,5-đinitro salicylic axit. Bình 1 thêm 2ml dịch chiết glucomannan; bình 2 thêm 2ml dịch glucomannan thủy phân. Đun cách thủy cả 2 bình trong 5 phút, để nguội, thêm nước cất đến thể tích 25ml. Đo màu bằng máy quang phổ kế tại bước 49 sóng 550 nm với mẫu trắng là nước cất và đặt về 0. Hàm lượng glucose tương ứng với cường độ màu có thể tính toán được dựa trên đường chuẩn hoặc được tính toán theo phương trình hồi quy sau: m ToT G )5(5000 (%)   (2.2) Trong đó: G% là hàm lượng glucomannan trong mẫu khô ε là tỷ lệ giữa khối lượng phân tử của glucose và manose chưa thủy phân và khối lượng phân tử của glucose và manose của gluocomanan thủy phân ε0,9 T là nồng độ (mg/ml) glucose trong mẫu glucomannan thủy phân To là nồng độ (mg/ml) glucose trong dịch chiết glucomannan m là khối lượng mẫu ban đầu. 2.2.1.3. Xác định cấu trúc và đặc trưng của glucomannan Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan tinh chế được xác định thông qua các phương pháp phổ: IR, NMR, TGA và X-Ray. - Xác định tỷ lệ mắt xích mannose/glucose: Tỷ lệ đơn vị cấu trúc manose/glucose được xác định dựa vào giá trị tích phân trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, theo công thức sau: Glu  H1 ManH1 Man/Glu I I R (2.3) Trong đó: RMan/Glu là tỷ lệ glucose/mannose IH1-Glu là giá trị tích phân proton H1 của glucose. IH1 -Man là giá trị tích phân proton H1 của mannose. - Xác định độ axetyl hóa Độ axetyl hóa DA được xác định dựa vào giá trị tích phân trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, theo công thức sau: 50 %100 3 1 3   H CH I I DA (2.4) Trong đó: ICH3 là giá trị tích phân của proton của nhóm CH3 IH1 là giá trị tích phân của proton liên kết với C1. - Xác định độ hòa tan: Tính tan của KGM được tính toán như tài liệu [34], cụ thể: Phân tán 0,1 gam sản phẩm trong 24,90 g đá bào trong bồn nước đá, khuấy trong 1 giờ (toàn bộ đá bào tan hết). Sau đó ly tâm dung dịch 4000 vòng/phút trong 20 phút. Lấy 10 gam dung dịch phía trên, sấy khô ở 105oC đến khối lượng không đổi nhận được m gam. Độ tan (S) của LKGM được tính theo công thức: 100 5,2 (%)  W m S (2.5) Trong đó: S là độ tan (%); m là khối lượng chất tan nhận được sau khi sấy khô 10 gam dung dịch ở nhiệt độ 105oC, W là tổng khối lượng mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. - Xác định hàm lượng tro tổng số và hàm lượng một số kim loại nặng: + Xác định hàm lượng tro: Rửa sạch cốc nung bằng nước, sấy trong tủ sấy ở 105oC trong 30 phút nung trong lò nung ở 525 ± 25oC trong 30 phút. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác đến 0,001g được khối lượng chén sứ (C). Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi. Cân chính xác 1,5 ÷ 2g mẫu thực vật đã sấy khô ở 105oC trong 1÷2 giờ, cân xác định tổng khối lượng mẫu và chén trước nung, đặt chén sứ có mẫu vào lò nung. Tăng dần nhiệt độ lò nung đến 500÷520oC và giữ trong khoảng 4÷5 giờ (cho đến khi khối lượng không đổi). Lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm, để nguội. Cân tổng khối lượng mẫu phân tích và chén sứ sau khi nung. Phần trăm khối lượng tro trong mẫu khô được tính theo công thức: X % = B−C A−C 100 (2.6) A là khối lượng mẫu và chén sứ trước khi nung (g) 51 B là khối lượng mẫu và chén sứ sau khi nung C là khối lượng chén sứ (g) + Xác định hàm lượng ion kim loại nặng: Sau khi tro hóa mẫu được chuyển sang cốc 50 ml. Thêm 10ml HNO3 1 :1. Đưa vào lò phá mẫu vi sóng, định mức 25 ml và đo trên máy AAS. - Xác định khối lượng phân tử: Sử dụng phương pháp đo áp suất thẩm thấu để xác định khối lượng phân tử trung bình của glucomannan. Theo định luật Vant-Hoff, áp suất thẩm thấu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ mol của chất tan và nhiệt độ tuyệt đối của dung dịch theo phương trình: Π.V=nRT = (g/M)RT Π= (g/V)(RT)/M M = (RTC)/Π Trong đó: g: khối lượng của chất hòa tan (g) R: Hằng số M: khối lượng phân tử của chất (g/mol) T: Nhiệt độ tuyệt đối C: nồng độ của dung dịch Π: Áp suất thẩm thấu. Định luật này áp dụng cho các dung dịch vô cùng loãng, khi đó khoảng cách giữa các chất tan đủ lớn để lực tương tác giữa chúng là không đáng kể. Cách tiến hành: Hòa tan hoàn toàn glucomannan trong nước để thu được các dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,025; 0,05; 0,1; 0,3; 0,4 và 0,5g/100ml. Tiến hành đo áp suất thẩm thấu trên thiết bị đo OSMOMAT 090. Khối lượng phân tử của mẫu phân tích được xác định theo công thức[95]: 52   d C KT M C n     lim 0 )(848 (2.7) Trong đó: Mn : Khối lượng phân tử trung bình số 848: Hằng số T: Nhiệt độ tuyệt đối (K) C: Nồng độ của mẫu (g/100ml) CC  lim 0 : giá trị ngoại suy của đồ thị phụ thuộc /C khi C0 d: Khối lượng riêng của dung dịch. 2.2.2. Thủy phân glucomannan 2.2.2.1. Thủy phân bằng axit - Lấy vào mỗi cốc một thể tích chính xác dung dịch hỗn hợp axit CH3COOH và axit HCl. Cân 10g glucomannan, phân tán vào dung dịch hỗn hợp axit, khuấy dung dịch đến đồng nhất đối với cả 2 phương pháp thủy phân bằng axit và bằng axit kết hợp sóng siêu âm. - Tiến hành siêu âm mẫu ở nhiệt độ thường trong khoảng 30 phút sau đó khuấy từ có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân kết hợp sử dụng sóng siêu âm với cường độ 20Hz và chỉ khuấy từ có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân bằng axit. Tiến hành phản ứng tại các nồng độ xác định ở một nhiệt độ, thời gian nhất định. Đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm nghiên cứu. - Kết thúc phản ứng, rửa hỗn hợp bằng etanol, sấy khô hỗn hợp phản ứng ở 60oC đến khối lượng không đổi nhận được sản phẩm glucomannan thủy phân. Phương pháp thủy phân bằng axit kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm LKGM-1. Phương pháp thủy phân bằng axit thu được sản phẩm LKGM-2. - Các điều kiện phản ứng được khảo sát, cụ thể: + Ảnh hưởng của nồng độ axit: Axit CH3COOH được sử dụng để bảo vệ nhóm axetyl trong phân tử glucomannan, qua khảo sát sơ bộ chúng tôi sử dụng nồng độ CH3COOH thích hợp là 10%. Các thí nghiệm khảo sát được thực hiện ở 53 cùng điều kiện: nhiệt độ 50oC, thời gian phản ứng 2 giờ, tỉ lệ glucomannan/dung dịch axit là 1/10 (g/ml). Nồng độ axit HCl được thay đổi 0,05M; 0,1M; 0,15M, 0,2M, 0,25M. + Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân, chúng tôi tiến hành phản ứng ở cùng điều kiện: thời gian phản ứng 2 giờ, tỉ lệ glucomannan/dung dịch axit là 1/10. Nồng độ axit HCl đã xác định, nhiệt độ phản ứng thay đổi: 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC. + Ảnh hưởng của thời gian phản ứng: Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân glucomannan. Phản ứng được thực hiện ở cùng điều kiện: tỉ lệ glucomannan/dung dịch axit là 1/10 (g/ml). Nồng độ axit CH3COOH 10%, nồng độ axit HCl, nhiệt độ đã xác định. Thời gian phản ứng thay đổi: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ. + Ảnh hưởng của tỷ lệ glucomannan/dd axit: Để xác định tỉ lệ rắn/lỏng thích hợp, các thí nghiệm được thực hiện ở cùng điều kiện: Nồng độ axit CH3COOH 10%, nồng độ axit HCl, nhiệt độ, thời gian phản ứng đã xác định. Tỉ lệ rắn/lỏng được thay đổi: 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (g/ml). Hiệu suất thu hồi sản phẩm được tính theo công thức: 100(%)  b a Y (2.9) Trong đó: a là khối lượng sản phẩm nhận được khi kết thúc phản ứng b là khối lượng glucomannan ban đầu - Giá trị DA, tỷ lệ M/G, khối lượng phân tử, độ hòa tan của sản phẩm thủy phân được thực hiện tương tự như mô tả ở mục 2.2.1.3. 2.2.2.2. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym a. Định tính xác định khả năng thủy phân glucomannan của các enzym từ vi khuẩn. Glucomannan là một polysacarit có các liên kết β-(14) glycosid. Liên kết này bị phân cắt bởi enzym β-mannanase. Vì vậy chúng tôi lựa chọn 2 loại vi khuẩn 54 có sản sinh enzym β-mannanase là Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis để định tính khả năng thủy phân glucomannan. - Chuẩn bị dịch chiết enzym từ vi khuẩn: + Vi khuẩn được cấy ria trên đĩa thạch qua đêm trên môi trường tương ứng để thu khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ. Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn vào 2ml môi trường nuôi cấy dạng lỏng (LB) đã khử trùng (môi trường Luria Betani broth- LB broth), nuôi cấy lắc 37oC, 6h 8h. + Pha thành dung dịch đạt nồng độ tương đương 108 CFU/ml. Nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn có pH = 5 (pH tối ưu với từng loại vi khuẩn). Đặt trong tủ ấm lắc ổn nhiệtở 35oC, trong 24 giờ. Sau đó ly tâm bỏ cặn tế bào, thu dịch chứa enzym. - Tiến hành phản ứng thủy phân glucomannan bằng enzym từ các vi khuẩn. + Lấy 20ml H2O vào mỗi đĩa petri thủy tinh, đánh số thứ tự tương ứng, thêm vào mỗi đĩa petri 1g glucomannan, khuấy dung dịch đến đồng nhất, đông đặc lại trong đĩa. + Khoan tạo một lỗ tròn bán kính 0,5 cm ở hỗn hợp phản ứng đã đông đặc tại vị trí chính giữa đĩa thủy tinh. Nhỏ dịch chiết enzym vào lỗ khoan rồi ủ hỗn hợp trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC. + Sau thời gian 4 giờ, đo kích thước lỗ thạch bị hóa lỏng. Sau khi định tính xác định được loại enzym có khả năng thủy phân glucomannan, chúng tôi sử dụng enzym thương mại endo-1,4 β-Mannanase (Bacillus sp.) EC 3.2.1.78 Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 của công ty Megazyme đã được tiêu chuẩn hóa trong các thực nghiệm tiếp theo. b. Khảo sát điều kiện phản ứng tối ưu bằng phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm. Phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác enzym bị chi phối đồng thời bởi các yếu tố trạng thái như: độ pH, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ enzym/cơ chất. Để tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm có khối lượng phân tử thấp, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khảo sát đồng thời theo quy hoạch thực nghiệm 55 mô hình toán học Box Behken 4 yếu tố 3 mức độ. Trên cơ sở những thí nghiệm sơ bộ chúng tôi đã chọn ra được 4 yếu tố ảnh hưởng chính (đầu vào, các biến số) là nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ enzym/ cơ chất như được đưa ra ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng Các mức Các yếu tố -1 0 +1 Nhiệt độ (X1, oC) 30 40 50 Thời gian (X2, h) 4 6 8 pH (X3) 5 7 9 Tỉ lệ %E/S (w/w), X4 0,1 0,4 0,7 Thiết kế thực nghiệm theo mô hình ma trận bậc hai của Box Behnken (Bảng 2.2) cụ thể như sau: - Chuẩn bị 27 bình phản ứng 500ml đánh số thứ tự. - Lần lượt lấy vào mỗi bình 300ml H2O vào mỗi bình, pH của dung dịch điều chỉnh pH 5÷9 bằng dung dịch HCl hoặc NaOH theo kế hoạch. - Thêm vào các dung dịch lượng enzym tương ứng (w/w) từ 0,1%÷0,7% theo đúng kế hoạch. - Phân tán vào mỗi bình chính xác 10g glucomannan, lắc và khuấy dung dịch đến đồng nhất. - Ủ hỗn hợp trong tủ ấm trong các khoảng thời gian 48 giờ. Tiến hành phản ứng tại nhiệt độ 3050oC theo kế hoạch. - Đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm nghiên cứu. - Kết thúc phản ứng, thêm dư dung môi etanol tuyệt đối vào hỗn hợp, loại bỏ dung dịch, sấy khô ở nhiệt độ 50oC đến khối lượng không đổi nhận được sản phẩm glucomannan thủy phân, ký hiệu là LKGM-E. 56 Bảng 2.2. Ma trận kế hoạch bậc 2 Box – Behnken cho trường hợp k = 4 Stt x1 x2 x3 x4 1 - - 0 0 2 + - 0 0 3 - + 0 0 4 + + 0 0 5 0 0 - - 6 0 0 + - 7 0 0 - + 8 0 0 + + 9 - 0 0 - 10 + 0 0 - 11 - 0 0 + 12 + 0 0 + 13 0 - - 0 14 0 + - 0 15 0 - + 0 16 0 + + 0 17 - 0 - 0 18 + 0 - 0 19 - 0 + 0 20 + 0 + 0 21 0 - 0 - 22 0 + 0 - 23 0 - 0 + 24 0 + 0 + 25 0 0 0 0 26 0 0 0 0 27 0 0 0 0 57 Xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert 11 (DX11). Phương trình hồi quy mô tả kết quả thực nghiệm theo kế hoạch bậc 2 Box – Behnken có dạng:        3 1 4 1 24 1 4 10 i ij j X i X ij b i Xi i ii b i X i bbY - Giá trị DA, tỷ lệ M/G, khối lượng phân tử, độ hòa tan của sản phẩm thủy phân LKGM-E được thực hiện tương tự như mô tả ở mục 2.2.1.3. 2.2.3. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của LKGM-E trên in vitro * Phương pháp đánh giá Đánh giá khả năng hoạt hóa AMPK của mẫu thử thông qua đánh giá mức độ biểu hiện của AMPK đã phosphoryl hóa ở phân tử threonin 172 (kí hiệu là p- AMPK). Phương pháp được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của các enzym này dùng kỹ thuật lai Western blot. Thí nghiệm được thực hiện tại bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội. * Các bước tiến hành - Nuôi cấy tế bào và ủ với mẫu thử: Hoạt hoá tế bào C2C12 và nuôi cấy trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% FBS, penicillin 100UI/ml; streptomycin 0,1mg/ml ở 37oC trong môi trường không khí có 5% CO2. Thúc đẩy sự biệt hoá tế bào bằng môi trường DMEM có chứa 5% huyết thanh ngựa (HS); - Ủ tế bào đã biệt hóa với mẫu thử, chuẩn bị protein để điện di; Ủ tế bào đã biệt hóa với mẫu thử (đã được hòa tan trong dung dịch DMSO) ở nồng độ 100 g/ml môi trường trong 1 giờ. Các giếng tế bào sau khi đã biệt hóa được chia thành các lô mỗi lô gồm 3 giếng: + Lô 1: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 6,25 μg/mL. + Lô 2: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 12,5 μg/mL. + Lô 3: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 25 μg/mL + Lô 4: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 50 μg/mL + Lô 5: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 100 μg/mL. + Lô 6(lô chứng dương): Ủ với Aicar (pha trong DMSO) 58 + Lô 7 (lô chứng): chỉ bổ sung DMSO. - Điện di protein: Phá vỡ màng tế bào để thu protein tổng số. Biến tính protein bằng dung dịch tải mẫu SDS ở 100oC trong 5 phút. Để phát hiện các protein p-AMPK và β-actin (protein đối chứng) trong dung dịch protein toàn phần, tiến hành điện di để tách rời các protein có trọng lượng khác nhau trên bản gel acrylamit 8%, và đệm tải mẫu được dùng là đệm sodium dodecyl sulfat(SDS). Sự phân tách này dựa trên điểm đẳng điện (pI), khối lượng phân tử, điện tích của các protein khác nhau sẽ dịch chuyển về các hướng khác nhau và tốc độ khác nhau. Định lượng protein toàn phần bằng phương pháp Bradford, cân bằng nồng độ protein bằng dung dịch đệm ly giải để lượng protein toàn phần trong các mẫu là như nhau. - Phát hiện protein và phân tích kết quả: * Nguyên tắc phát hiện protein bằng phương pháp Western blot: Nhận biết AMPK đã hoạ