Hệ thống protein dung hợp với GST (họ Vector pGex)

HỆ THỐNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI GST (HỌ VECTOR pGEX) Đặc điểm của họ vector pGEX: Có chứa promoter tac điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu được cảm ứng bằng IPTG hoặc các chất có cấu trúc tương tự. Vùng gen lacIq là dạng đột biến của gen lacI tạo ra lượng lớn repressor của lac operon (lacO) trong tế bào chủ E.coli. Điểm khởi đầu sao chép Ori: là vị trí DNA polymerase của tế bào vi khuẩn gắn vào và bắt đầu quá trình sao chép plasmid. Gen kháng Ampicillin làm nhân tố sàng lọc các tế bào không có plasmid trong quá trình biến nạp khi trải lên môi trường chọn lọc có ampicillin. Việc tách rửa cho phép thu nhận protein dung hợp ra khỏi cột ái lực trong điều kiện ôn hoà để đảm bảo tính kháng nguyên và hoạt tính chức năng của protein. Có vị trí nhận biết cho enzyme protease PreScission™, thrombin, or factor Xa để cắt protein mục tiêu ra khỏi sản phẩm protein dung hợp. Có vị trí kết thúc phiên mã nằm sau vùng MCS. Hệ thống pGEX có tất cả 13 vectors. Trong đó có 9 vectors là có vùng MCS mở rộng giúp dễ dàng trong việc dòng hoá, chứa 6 vị trí nhận biết cho enzyme cắt giới hạn: pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, and pGEX-6P- mã hoá cho trình tự nhận biết vị trí cắt đặc hiệu của protease PreScission™ giữa domain GST và MCS. pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, and pGEX-4T-3 bắt nguồn từ pGEX-2T và chứa vị trí nhận biết cho thrombin. pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, and pGEX5X-3 là các dẫn xuất của pGEX-3X và có vị trí nhận biết cho factor Xa. Đặc tính của các vector pGEX: Cảm ứng: promoter tac được cảm ứng bởi IPTG (1-5 mM). Biểu hiện: protein được biểu hiện là protein dung hợp với protein GST (26 kDa). Gen GST chứa 1 codon khởi đầu ATG và vị trí kết hợp với ribosome, và chịu sự kiểm soát của promoter tac. Mỗi ORF đều có codon kết thúc quá trình dịch mã. Protein dung hợp được tinh sạch bởi kit tinh sạch protein dung hợp với GST. Vị trí cắt của protease PreScission™: pGEX-6P-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi enzyme cắt PreScission™. Bởi vì PreScission™ đã được xử lý với tag GST. Tag GST sẽ được loại bỏ đồng thời với protein GST ra khỏi protein dung hợp. Vị trí cắt của enzyme thrombin: pGEX-1λT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi thrombin. Vị trí cắt cho fator Xa: pGEX-3X, pGEX-5X-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi factor Xa. Đánh dấu trực tiếp trong điều kiện in vitro: pGEX-2TK cho phép đánh dấu P32 protein dung hợp trong điều kiện in vitro bởi tiểu phần xúc tác protein kinase phụ thuộc cAMP. Tế bào chủ: E.coli. plasmid mang gen ức chế lacIq. Marker chọn lọc: plasmid chứa gen kháng ampicillin 100 µg/ml. II.1. pGEX-2T: Vùng gen GST: promoter tac:-10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết ribosome: 244; codon khởi đầu ATG: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. MCS:930-945. Vùng gen cho beta-lactamase: Promoter: -10: 1309-1314; -35: 1286-1291; codon khởi đầu (ATG): 1356; codon kết thúc (TAA): 2214. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3297; codon kết thúc (TGA): 4377. Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2974; vùng cấn thiết cho sao chép: 2281-2977. Trình tự primer: 5’ pGEX trình tự primer kết hợp ở nucleotide 869-891; 3’ pGEX trình tự primer kết hợpơơ3 nucleotides 1020-998. II.2. pGEX-2TK: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome cho GST:244; codon khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935; Vùng mã hoá cho vị trí cắt kinase: 936-950. Vùng MCS: 951-966. Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1330-1335; -35: 1307-1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon Stop (TGA): 4398. Vùng sao chép plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2995; vùng cần thiết cho sao chép: 2302-2998. Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1041-1019. II.3. pGEX-3X: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết với ribosome cho GST: 244; codon khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt của Factor Xa: 921-932. Vùng MCS: 934-949. Vùng gen Beta-lactamase: Promoter: -10: 1313-1318; -35: 1290-1295; codon khởi đầu (ATG): 1360; codon kết thúc (TAA): 2218. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3301; codon kết thúc (TGA): 4381. Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2978; vùng cần thiết cho sao chép: 2285-2981. Trình tự primers: trình tự Primer 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự Primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1024-1002. II.4. pGEX-1λT: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. Vùng MCS: 930-944. Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1308-1313; -35: 1285-1290; codon khởi đầu (ATG): 1355; codon kết thúc (TAA): 2213. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3296; codon kết thúc (TGA): 4376. Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2973; vùng cần thiết cho sao chép: 2280-2976. Trình tự primers: trình tự primers 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1019-997. II.5. pGEX-4T-1: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; Vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. Vùng MCS: 930-966. Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1330-1335; -35: 1307-1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon kết thúc (TGA): 4398. Vùng sao chép plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2995; vùng cần thiết cho sao chép: 2302-2998. Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1041-1019. II.6. pGEX-4T-2: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. Vùng MCS: 930-967. Vùng gen Beta-lactamase: promoter: -10: 1331-1336; -35: 1308-1313; codon khởi đầu (ATG): 1378; codon kết thúc (TAA): 2236. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3319; codon kết thúc (TGA): 4399. Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép 2996; vùng cần thiết cho sao chép: 2303-2999. Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp bổ sung ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp bổ sung ở vị trí 1042-1020. II.7. pGEX-4T-3: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. Vùng MCS: 930-965. Vùng gen Beta-lactamase: Promoter: -10: 1329-1334; -35: 1306-1311; codon khởi đầu (ATG): 1376; codon kết thúc (TAA): 2234. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3317; codon kết thúc (TGA): 4397. Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 2994; vùng cần thiết cho sao chép:2301-2997. Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1040-1018. II.8. pGEX-5X-1: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vịt rí cắt của factor Xa: 921-932. Vùng MCS: 934-969. Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1333-1338; -35: 1310-1315; codon khởi đầu (ATG): 1380; codon kết thúc (TAA): 2238. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3321; codon kết thúc (TGA): 4401. Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 2998; vùng cần thiết sao chép: 2305-3001. Trình tự primers: 5’ pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; 3’ pGEX bắt cặp ở vị trí 1044-1022. II.9. pGEX-5X-2: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt factor Xa: 921-932. Vùng MCS: 934-970. Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1334-1339; -35: 1311-1316; codon khởi đầu (ATG): 1381; codon kết thúc (TAA): 2239. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3322; codon kết thúc (TGA): 4402. Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 2999; vùng cần thiết cho sao chép: 2306-3002. Trình tự primers: 5' pGEX bắt ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1045-1023. II.10. pGEX-5X-3: Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt của factor Xa: 921-932. Vùng MCS: 934-971. Vùng gen beta-lactamase: Promoter: -10: 1335-1340; -35: 1312-1317; codon khởi đầu (ATG): 1382; codon kết thúc (TAA): 2240. Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3323; codon kết thúc (TGA): 4403. Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 3000; vùng cần thiết cho sao chép: 2307-3003. Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1046-1024. Hình 1: Sơ đồ vectors dung hợp GST cho thấy các ORFs và những đặc điểm chính. mặc dù những codon stop trong tất cả 3 ORFs không được mô tả trong bản đồ nhưng tất cả 13 vectors đều có các codon stop trong tất cả 3 ORFs về phía thượng nguồn vị trí MCS. Phương pháp phát hiện protein dung hợp với GST: III.1. Phát hiện protein dung hợp với GST nhờ hoạt tính enzyme: Sản phẩm protein dung hợp với GST từ vector pGEX được phát hiện dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất không màu CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzen) và tạo ra sản phẩm có màu, có phổ hấp thu cực đại ở bước sóng 340 nm (1). Hình 2: Phương pháp phát hiện protein dung hợp với GST bằng hoạt tính enzyme (1). III.2. Phương pháp lai miễn dịch: Protein dung hợp được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu kháng nguyên đã được đánh dấu. Sau khi protein dung hợp được phân đoạn bằng điện di trên gel polyacrylamid, các vạch protein được chuyển thẩm lên màng lai. Sau đó màng lai đựơc ủ với kháng thể thứ nhất (kháng thể kháng GST-anti GST IgG), bắt đặc hiệu với protein dung hợp. Kháng thể kháng GST là một kháng thể đa dòng được tinh sạch từ huyết thanh của dê mà được gây miễn dịch với GST của Schistosoma japonicum. Sau đó màng lai được ủ với kháng thể thứ hai đã được đánh dấu (kháng thể thứ hai gắn đặc hiệu với đoạn Fc của kháng thể thứ nhất). Nếu kháng thể thứ hai được đánh dấu bằng horse-radish peroxidase thì sự phát hiện dựa vào phản ứng xúc của enzyme peroxidase trên cơ chất H2O2 và luminol làm phát ra ánh sáng, có phổ hấp thu ở bước sóng 428 nm và đựơc ghi nhận lại trên phim (1). Hình 3: Phương pháp lai miễn dịch (1). Tinh chế protein dung hợp với GST: Protein dung hợp với GST từ dịch ly giải của tế bào vi khuẩn dể dàng được tinh chế nhờ ái lực cao giữa glutathione với GST. Sử dụng glutathione được gắn kết với giá thể Sepharose trong cột săc ký, khi cho hổn hợp protein qua cột, protein dung hợp với GST sẽ gắn với glutathione và được giữ lại trong cột. Các protein khác không gắn và sẽ được rửa trôi qua cột. Protein dung hợp sau đó được dung ly ra khỏi cột ở điều kiện trung tính và không biến tính bằng chất khử glutathione (1). Protein mục tiêu được cắt khỏi GST của protein dung hợp nhờ hoạt tính của protease (PreScission, thrombin hoặc factor Xa) có khả năng nhận biết vị trí cắt đặc hiệu trên protein dung hợp. Phản ứng cắt này có thể được thực hiện khi protein dung hợp đang được giữ lại trên cột. Protein mục tiêu đã tách khỏi GST được dung ly bằng dung dịch rửa cột. Tuy nhiên, trong trường hợp ứng dụng cần có chức năng của GST trong protein dung hợp thì sản phẩm protein dung hợp chỉ cần được tinh chế ở dạng protein dung hợp với GST. Hình 4: Phương pháp tách chiết protein dung hợp với GST. Tài liệu tham khảo: Stan Metzenberg, Fusion proteins and display libraries (Biology 470 – Biotechnology). California State University Northridge. GE healthcare. pGEX Vectors (GST Gene Fusion System). GE healthcare. Protein Handling and Detection Techniques. (