Khóa luận Đánh giá hiệu quả diệt khuẩn của bình sữa nano bạc đối với các loại vi khuẩn: Vi khuẩn hiếu khí, Coliform, Escheria coli trong sữa bò tươi

lâu ngày sữa sẽ bị nhầy, vì vậy bảo quản sữa phải ở dưới 00C. Khâu khử trùng sữa cần được làm theo quy định. Thực hiện được như tránh được sự lây nhiễm vi sinh vật vào sữa và không làm tăng số lượng vi khuẩn trong sữa. 2.5.2. Một số vi khuẩn thường gặp trong sữa Bình thường trong sữa chứa 100 – 300 vi khuẩn/lít sữa, lượng vi khuẩn này không ngừng tăng lên trong quá trình vắt và chế biến sữa, tốc độ tăng của vi khuẩn phụ thuộc nhiều vào thành phần vi khuẩn ban đầu..Trong sữa có chứa một số vi sinh vật, bao gồm nấm men, nấm mốc. Trong số này vi khuẩn chiếm phần lớn, có tới vài chục loài như: vi khuẩn Lactic, vi khuẩn Butiric, propionic, vi khuẩn gây thối, nhóm trực khuẩn đường ruột... Hệ vi sinh vật trong sữa được người ta chia làm 3 nhóm: vi sinh vật bình thường, vi sinh vật không bình thường, vi sinh vật gây bệnh. sau đây là một số vi khuẩn thường gặp trong sữa: 2.5.2.1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 3: Khuẩn lạc vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus được Robet Kock (`1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus thuộc họ Micrococcaceae. Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, bắt màu gram dương, trên tiêu bản xem trực tiếp các vi khuẩn đứng lẫn với các tế bào mủ, tập hợp thành hình chùm nho, cũng có khi cầu khuẩn đừng riêng rẽ. Đưỡng kính trung bình 0.8-1µ. Vi khuẩn không có giáp mô, không hình thành nha bào(Nguyễn Vĩnh Phước 1976). Tụ cầu sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ phù hợp 32oc – 37oc, PH khoảng 7.2 -7.6. Các thực phẩm giàu đạm, đường bột là môi trường tốt cho tụ cầu phát triển và tích lũy độc tố. Staphylococcus areus sản sinh 6 độc tố ruột (Enterotoxin): A, B, C1, C2, D và E, chúng khác nhau về độc tính. Độc tố ruột của tụ cầu la loại protein đơn giản, khối lượng phân tử khoảng 26.000 – 30.000 Dalton. Phần lớn ngộ độc thực phẩm là do type A và D. Nguồn nhiễm tụ cầu cho thực phẩm đa phần là do người và động vật. Tụ cầu rải kháp nơi trong tự nhiên: Đất, nước, không khí, da, niêm mạc mũi họng của người bình thường, sữa của bò viêm vú.... Điều này làm thức ăn rất dễ nhiễm bởi vi khuẩn này. Mặt khác công nhân khi tham gia chế biến thực phẩm, giết mổ, vắt sữa... khi mắc bệnh ở đường hô hấp trên, đau răng hay bị viêm da do vi trùng gây mủ chính là nguồn gây nhiễm cho thực phẩm. Trong các loại thực phẩm, thông thường nhất là sữa và các sản phẩm từ sữa như kem sữa, bánh sữa, các đồ ngọt khác, kem đá là những thức ăn thuận lợi cho tụ trùng phát triển, ngoài ra thịt cá cũng là môi trường thuận lợi cho tụ cầu phát triển sinh độc tố và gây bệnh. Theo Nguyễn Ngọc Nhiên và Cù Hữu Phú (1977), nguyên nhân chính gây viêm vú bò do Staphylococcus aureus và tỉ lệ đã phân lập được Staphylococus aureus chiếm 33.74% các mẫu sữa kiểm tra. Bệnh viêm vú ở bò đã gây nhiều thiệt hại về kinh tế do sữa bị hủy bỏ vì sự có mặt của Staphylococcus aureus. Sự có mặt của Staphylococus aureus trong thực phẩm chỉ ra rằng có sự nhiễm khuẩn từ da, miệng mũi và tay chân của công nhân làm công tác thu gom, vắt sữa hoăc phân phối sữa. Số lượng vi khuẩn này trong thực phẩm phản ánh tình trạng vệ sinh, nhiệt độ của quá trình sử lý không đạt yêu cấu. Tuy nhiên sự có mặt của Staphylococus aureus trong thực phẩm không phải là bằng chứng của các vụ ngộ độc mà phải phát hiện ra khả năng sinh ra độc tố của những vi khuẩn này (Andrew. w,1992). 2.5.2.2. Coliform và Escherichia coli Hình 4: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường MacConkey Hình 5: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB Coliforms bao gồm ca vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có hình gậy, bắt màu gram âm, không sinh nha bào và có đặc tính lên men đường Lactose trong môi trường lỏng BLGB (Brilliant Green Lactose Bile) ở nhiệt độ 35oc trong vòng 48 giờ.Nhóm vi khuẩn Colifrom có nhiều nguồn gốc khác nhau: - Từ phân(nhóm Feacal Colifrom) - Từ đất (nhóm Aerobacter) - Từ cây cối (nhóm Intermediate). Chúng được phân biệt theo các đặc tính sinh hóa. Việc xác định chỉ số Colifrom có thể cho đánh giá sơ bộ tình trạng, mức độ vệ sinh của sản phẩm kiểm tra.Nhóm Colifrom được các nhà khoa học trên thế giới công nhận là một chỉ tiêu vệ sinh của nước so với các vi khuẩn gây bệnh khác. Nhóm Colifrom bao gồm các loài: E.coli, Citrobacter, Enterobacter, klebsiella, Serati ... có nguồn gốc thiên nhiên. E.coli là vi khuẩn đường ruột chủ yếu ở bộ phận ruột già của người và gia súc. Sự có mặt của E.coli trong nước chứng tỏ nguồn nước bị nhiễm bẩn từ phân (Vệ sinh dịch tễ, tập 1). Dựa vào triệu chứng và tính chất gây bệnh của E.coli người ta chia thành 5 nhóm: - EaggE (Entero aggregative Ecoli = E.coli tập kết ở ruột) - EEHC (Enterohemorrhagic E.coli = E.coli gây xuất huyết ở ruột) - EIEC (Entero invasive E.coli = E.coli gây bệnh đường ruột) - EPEC (Entero pathogenic E.coli = E.coli gây bệnh đường ruột) - ETEC (Entero toxingenic E.coli = E.co li sinh độc tố ruột). Triệu chứng người ngộ độc bởi E.coli: Người bị ngộ độc đau bụng dữ dội, rất ít nôn mửa, đi phân loãng khoảng 1-15 lần/ngày, nhiệt độ cơ thể bình thường hoặc tăng nhẹ. Bệnh kéo dài 1-3 ngày rồi khỏi. Trường hợp nặng cơ thể sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, bệnh khỏi sau 10 ngày. Người già và trẻ em dễ nguy hiểm đến tính mạng, tỷ lệ tử vong lên tớ 3-5% (WHO – Fact sheet No 125 – July 1996). Do vậy, kiểm tra vi khuẩn E.coli là việc làm bắt buộc với thực phẩm tươi sống có nguồn gốc động vật và là chỉ tiêu đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm. 3 / Vi khuẩn Salmonella. Là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4-0,6 x 1-3 µm không hình thành nha bào và giáp mô. Đa số các loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh (trừ Salmonella galinarum – pullorum). Vi khuẩn Salmonella bắt màu Gram âm. Hình 6: Vi khuẩn Salmonella Khi nhộm vi khuẩn bắt màu toàn thân hoặc đậm hai đầu. Salmonella vừa hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, nhiệt độ nuôi cấy 37oc, ở PH =7,6. Salmonella có hàng ngàn serotype nhưng chỉ có một lượng rất ít các sẻotype có khả năng gây bệnh cho người và động vật. Sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm thể hiện sự không an toàn đối với sức khỏe con người.Cho đến nay, nhười ta đã phát hiện được 2.324 serotype Salmonella và xếp chúng thành 66 nhóm căn cứ vào kháng nguyên O và H do Kaufman White thiết lập. Các nhóm đặc biệt có khả năng gây bệnh là: A, B, C1, C2, D1, E1 trong đó phải kể đến các serotype Salmonella typhi và Salmonella paratyphy A, B. Con người rất nhạy cảm với Salmonella. Thời kỳ ủ bệnh thường từ 12 -24 giờ, nhưng có thể kéo dài vài ngày. Khi phát hiện bệnh, dấu hiệu đầu tiên là buồn nôn, nhức đầu, choáng váng, khó chịu, sốt, đau bụng. Sau đó xuất hiện nôn mửa và tiêu chảy nhiều lần, phân toàn nước, đôi khi có lẫn máu đó là triệu chứng viêm ruột cấp tính. Đại đa số bệnh nhân trở lại bình thường sau 1-2 ngày và không để lại di chứng. Ngoài ra cá biệt có bệnh nhân biểu hiện giống bệnh thương hàn, cảm cúm nghĩa là sốt rất cao 390 - 40oC, mệt mỏi toàn thân, đau ở vùng thắt lưng và cơ bắp. Các triệu chứng rối loạn tiêu hóa biểu hiện rất nhẹ hoặc không có, vì vậy rất dễ chuẩn đoán nhầm. Bệnh thương hàn ở người gây ra chủ yếu do ăn thực phảm chưa nấu kỹ, xuất hiện các triệu chứng như đau bụng, nôn mửa, ỉa chảy và có thể gây viêm dạ dày sau khi ăn thực phẩm nhiễm Salmonella từ 12h – 24h. Thực phẩm bị nhiễm Salmonella thì tính chất của thực phẩm không bị thay đổi rõ rệt, do đó để phòng chống bệnh do Salmonella người ta khuyến cáo không nên sử dụng thịt sống, thịt tái, sữa tươi chưa được sử lý kỹ hay thức ăn chín sử lý nhiệt không đúng cách. Do Salmonella có đặc tính gây bệnh nguy hiểm nên TCVN 5153-90 quy định không có mặt của vi khuẩn này trong 25 gam mẫu thực phẩm được kiểm tra. 2.5.2.4. Vi khuẩn Clostridium perfingens Clostridium pefringens (Cl.perfringens) còn có tên là Clostridium welchii được Oen và Natan phân lập năm 1982 trong tổ chức xác người chết. Vi khuẩn Cl. perfingens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridia là vi khuẩn yếm khí sinh nha bào và sinh H2S. Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, phân, không khí...) do đó rất dễ nhiễm vào thức ăn gây ngộ độc. Cloctridium perfingens là loại trực khuẩn thẳng, hai đầu hơi tròn, kích thước 0,8 -1,5 x 3 - 8µm. . Vi khuẩn không có lông, không di động, hình thành giáp mô trong cơ thể bệnh, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoăc kiềm. Hình 7: Vi khuẩn Clostridium perfingens Nha bào to hơn chiều ngang thân vi khuẩn.và thường nằm ở giữa hoặc nằm gần một đầu của vi khuẩn. Vi khuẩn bắt màu gram dương, trong canh khuẩn nuôi cấy lâu thể bắt màu Gram âm (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997). Độc tố của Clostridium perfingens gây ngộ độc với người thuộc ngoại độc tố. Trong 6 type Clostridium perfingens chỉ có hai type có khả năng gây ngộ độc thực phẩm cho người đó là A và C. Ở những type có khả năng sinh độc tố người ta quan tâm đến tác động của độc tố α. Người bị ngộ độc thực phẩm nhiễm Clostridium perfingens type A, bệnh xuất hiện với triệu chứng viêm ruột, dạ dày, đau bụng, ỉa chảy, phân lỏng toàn nước có khi lẫn máu, thỉnh thoảng có trường hợp nôn mửa, cá biệt có nhức đầu, sốt. Thời gian mắc bệnh ngắn, thường vài ngày là khỏi. Bệnh diễn ra hầu hết ở thể cấp tính, bệnh súc chết sau 24 - 48 giờ sau khi có triệu chứng tiêu chảy phân có máu, con vật biểu hiện đau đớn, vật vã. Bệnh tích điển hình: ruột non xuất huyết nặng có khi xuất hiện cả ở ruột già, dịch ruột màu đỏ thẫm, thành ruột phù nặng, phổi xung huyết, tim rải rác các châm xuất huyết, gan, lách xung huyết. Cl. Perfingens có sẵn trong đường tiêu hóa hoặc từ ngoài vào, gặp điều kiện thuận lợi chúng tăng nhanh về số lượng và sinh nhiều độc tố, độc tố xuyên qua thành mạch vào máu gây trúng độc toàn thân và giết chết con vật. Chúng sinh độc tố thần kinh gây bại liệt và co giật, độc tố dung huyết gây hoại tử và chết. 2.5.2.5. Vi khuẩn Streptococcus Vi khuẩn Streptococcus là vi khuẩn hình cầu, bắt màu gram dương, đường kính từ 0,6 - 1µm, thường xếp thành chuỗi dài hoặc ngắn, nhưng cũng cũng có thể có dạng song cầu tùy thuộc loài. Không hình thành nha bào, một số giáp mô, cũng có ít loài có tiên mao. Hình 8: Vi khuẩn Streptococcus Streptococcus là những vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, phát triển tốt ở môi trường thạch máu, môi trường có huyết thanh nhưng đòi hỏi chất dinh dưỡng nghiêm ngặt, phát triển rất kém trên môi trường thạch thường, không phát triển ở môi trường có thêm 6,5% NaCl. Phản ứng catalase âm tính, lên men glucose. Có loại tạo vòng dung huyết đặc hữu xung quanh khuẩn lạc khi phát triển trên môi trường thạch máu. Tính dung huyết khác nhau tùy từng chủng. Trong các khuẩn lạc gây viêm vú ở bò sữa, liên cầu khuẩn Streptococcus chiếm 86%, trong đó chủ yếu la Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae và Streptococcus uberis (Phạm Bảo Ngọc, 2002). Streptococcus dysgalactiaelae nguyên nhân chính gây viêm vú ở thời kỳ cạn sữa. Streptococcus uberis cư trú ở họng, da, âm đạo chúng gây viêm vú dạng cấp tính và có thể gây viêm vú thờ kỳ cạn sữa. Streptococus agalactiae gây viêm vú dạng cấp tính, mạn tính với triệu chứng lâm sàng rất rõ ràng, vi khuẩn này cư trú ở trong ống sữa và trên bề mặt ống dẫn sữa, chúng phát triển nhanh làm tăng số lượng bạch cầu, gây tắc ống dẫn sữa làm sưng vú và tách biệt các nang sữa. Bệnh lây lan chủ yếu qua người vắt sữa, dụng cụ vắt sữa và ruồi. Vắt sữa không hoàn chỉnh có thể làm tăng mức độ trầm trọng của bệnh viêm vú do Steptococcus trong đàn bò. Ngoài ra, khi xác định vi khuẩn trong sữa tươi thấy tồn tại Streptococcus pyogenes với tỷ lệ 33,33% ở các mẫu sữa thu gom. Qua đó ta thấy tỷ lệ nhiễm Streptococus trong sữa là khá cao, do đó cần có quy dịnh vệ sinh trong khâu thu gom, bảo quản... để hạn chế ô nhiễm sữa. Đảm bảo nguồn sữa sạch, an toàn vệ sinh cho người tiêu dùng là việc hết sức cần thiết. Ngoài những vi khuẩn nêu trên trong sữa còn có nhiều vi khuẩn có mặt thường xuyên trong sưã như: vi khuẩn Lactic, các vi khuẩn sinh hương, các liên cầu lactic (Streptococcus lactic), các trực khuẩn Lactic (Lactobacillus)... 2.5.3. Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường. Trong môi trường dinh dưỡng mỗi loài vi sinh vật đều phát triển theo các giai đoạn nhất định, có tính quy luật rõ rệt. Nghiên cứu quá trình này sẽ giúp ta có đủ cơ sở khoa học để điều khiển quá trình này theo hướng ta mong muốn. Có thể chia quá trình phát triển của vi sinh vật trong môi trường làm các giai đoạn hay các pha như sau: 2.5.3.1. Pha tiềm phát Vi sinh vật mới được cấy vào môi trường chưa tăng về mặt số lượng. Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng này gồm hai loại : - Nguyên nhân bên trong là điều kiện của bản thân loại vi sinh vật được cấy vào trong môi trường. Nếu giống ở dạng bào tử thì bào tử cần một thời gian thấm nước trương lên, các hệ enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động, bào tử nảy mầm và sinh trưởng. Nếu giống còn non sẽ tiếp tục sinh trưởng đến khi đạt kích thước tối đa và đến tuổi sinh lý trưởng thành. Còn tế bào đã trưởng thành cũng không thể sinh sản ngay được mà còn phải có thời gian làm quen với môi trường đồng thời tiến hành tích lũy năng lượng chuẩn bị cho giai đoạn sinh sản. Đặc điểm của từng loại vi sinh vật, khả năng thích nghi của chúng cũng là những yếu tố quan trọng. - Nguyên nhân bên ngoài là điều kiện môi trường gồm có chất dinh dưỡng, độ pH môi trường, độ ẩm, nhiệt độ, thể oxy hóa – khử ... Những yếu tố của môi trường bên ngoài như nhiệt độ, độ ẩm, pH môi trường, đặc biệt là chất dinh dưỡng có ảnh hưởng rất nhiều đến pha tiềm phát. Nếu môi trường nôi cấy cũ thì thời gian làm quen với môi trường được rút ngắn – pha tiềm phát ngắn. Ngoài ra, vấn đề chủng loại vi sinh vật cũng liên quan đến thời gian của pha tiềm phát. Có loại vi khuẩn trong điều kiện thuận lợi, pha này chỉ kéo dài trong vài phút đến vài chục phút, ở loại khác thì hàng giờ. 2.5.3.2. Pha logarit (pha chỉ số) Trong pha này số lượng vi sinh vật tăng lên với tốc độ rất nhanh vì sau khi làm quen với môi trường và sinh trưởng mạnh vi sinh vật bắt đầu tiến hành sinh sản với tốc độ khá cao. Thời gian sinh sản của thế hệ phụ thuộc vào loài vi sinh vật. Vi sinh vật sinh sản theo cấp số nhân, nên số lượng tăng ngày càng nhanh. Thời gian tăng gấp đôi lượng tế bào gọi là thời gian thế hệ. Số lượng ban đầu càng lớn thì tốc độ phát triển trong pha này ngày càng nhanh và thời gian tăng đến số lượng cực đại càng ngắn. Một tế bào vi khuẩn chỉ sau 48 giờ đã sinh được 171 thế hệ. Trong pha này vi sinh vật đã thích nghi với môi trường bên ngoài, quá trình trao đổi chất tiến hành rất nhanh. Đặc tính sinh hóa đặc trưng cho loài vi sinh vật thường biểu hiện rõ rệt trong pha này. Sau một thời gian nuôi cấy, ở cuối pha logarit điều kiện sinh trưởng trong môi trường thay đổi nhiều, chất dự trữ trong môi trường cạn dần, một số sản phẩm của sự trao đổi chất có tính độc tích tụ lại, pH môi trường thay đổi. Các chất khử hydro bị hao phí. Sự chuyển hóa năng lượng bị chậm lại. Những cá thể bắt đầu gây trở ngại cho nhau. Tốc độ sinh sản giảm, số tế bào chết xuất hiện. Sự tăng tổng số tế bào sống chậm lại và dẫn tới các tế bào mới hình thành bằng số lượng tế bào chết. Sinh trưởng và phát triển bước vào pha cân bằng. 2.5.3.3. Pha cân bằng Tiếp theo pha sinh trưởng logarit là pha cân bằng. Trong pha này tổng số tế bào gần như không thay đổi. Hiện tượng này không có ý nghĩa là vi sinh vật ngừng sinh sản, mà thực ra vi sinh vật sản sinh tiếp tục, nhưng trong một đơn vị thời gian số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi. Có thể nói đây là trạng thái cân bằng động. Chính trong pha này số lượng tế bào chứa trong một đơn vị thể tích cũng đạt tới mức tối đa. Số lượng tối đa của vi sinh vật trong môi trường là đặc trưng quan trọng của mỗi loài vi sinh vật. Nó phụ thuộc nhiều vào môi trường ngoài. Trong pha này chất dinh dưỡng trong môi trường giảm nhiều. Điều này dẫn đến kết quả là số tế bào sinh sản giảm, tế bào chết ngày càng tăng. Đặc biệt trong các quá trình lên men ở pha này vi sinh vật tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường nuôi cấy. 2.5.3.4. Pha suy vong Trong pha này tổng số tế bào giảm dần, số vi sinh vật chết tăng nhanh hơn số vi sinh vật sinh ra. Điều này xảy ra là do điều kiện sống tạo nên, chủ yếu là các chất dinh dưỡng đã cạn kiệt trong môi trường nuôi cấy. 2.5.4 . Sự thay đổi hệ vi sinh vật của sữa trong quá trình bảo quản. Bảng 2 Sự biến đổi tổn số vi sinh vật trong sữa phụ thuộc vào mức độ nhiễm ban đầu, nhiệt độ và thời gian bảo quản. Mẫu Điều kiện vệ sinh Nhiệt độ bảo quản (oC) Tổng số vi sinh vật (1000 tế bào/ml) Ban đầu Sau 24h Sau 48h 1 Tốt 4,5 10,0 15,5 4 4 4 4 14 1600 4,6 128 33.000 2 Bình thường 4,5 10,0 15,5 39 39 39 88 180 4500 122 832 99100 3 Kém 4,5 10,0 15,5 136 136 136 282 1200 24700 540 13.700 640.000 Nguồn: giáo trình công nghệ chế biến sữa và sản phẩm từ sữa Trong quá trình bảo quản sữa từ sau khi vắt đến khi sử dụng hoặc chế biến, hệ vi sinh vật thay đổi về số lượng, thành phần các nhóm trong đó. Sự thay đổi này phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian bảo quản và thành phần ban đầu của hệ vi sinh vật. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy: Trong 12h đầu, trong sữa có nhiều loại vi khuẩn, trong đó vi khuẩn gây thối và vi khuẩn gây kiềm hóa chiếm ưu thế. Sau 24 h nhóm vi khuẩn trên sẽ bị vi khuẩn lên men(vi khuẩn Lactic) sữa chua kiềm chế. Sau 72 h cầu khuẩn Lactic bị nhóm vi khuẩn hình que chụi acid kiềm chế. Sau cùng là các nấm men, nấm mốc xuất hiện gây hư hỏng thực phẩm. Quá trình thay đổi này có thể chia thành các pha sau: - Pha 1:Pha ức chế vi khuẩn: Trong sữa tươi có một khoảng thời gian vi khuẩn không phát triển, thậm chí đôi khi còn giảm về số lượng. Trong sữa tim thấy hai chất có tác dụng ức chế vi khuẩn là lactenin-1 và lactanin-2. Dần dần độ axit tăng làm giảm độ tươi của sữa và vi khuẩn phát triển. - Pha2: pha phát triển hỗn hợp. Sau khi các chất ức chế hết tác dụng, hệ vi sinh vạt trong sữa phát triển. Cuối pha này (độ axit tăng đáng kể), các vi khuẩn lactic sinh sản mạnh mẽ. - Pha 3: pha phát triển của vi khuẩn Lactic. Ở pha này các vi khuẩn lactic chiếm ưu thế trong sữa, axit lactic và các sản phảm lên mem được tạo thành. Lúc đầu nhóm cầu khuẩn phát triển, sau bị chết dần do chính các sản phẩm do chúng tao thành và nhường chỗ cho trực khuẩn chịu axit. - Pha 4: pha phát triển của nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn lactic phát triển làm cho độ axit trong sữa được nâng cao chính vì thế làm kìm hãm sự phát triển của nhiều vi khuẩn hoặc giết chết chúng, cũng vì thế mà các vi khuẩn này dần dần cũng bị chết để cho các vi sinh vật có khả năng phát triển ở môi trường có độ axit cao, như nấm men và nấm mốc. Nấm men và nấm mốc phát triển làm giảm chua cho sữa, chuyển môi trường dần dần từ axit sang kiềm, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối phát triển. Ở pha cuối này sữa vị biến chất và hư hỏng. Như vậy trong sữa tươi mới vắt ra, có một khoảng thời gian vi khuẩn không phát triển, thậm chí có thể giảm và được gọi là giai đoạn tự kháng. Biện pháp hữu hiệu để đảm bảo độ tươi của sữa là phải làm lạnh càng sớm càng tốt vì nhiệt độ bảo quản thấp có thể kéo dài giai đoạn tự kháng này. Song khi sữa đã qua giai đoạn này thì nhiệt độ thấp cũng không thể làm số lượng vi sinh vật giảm xuống, bảo quản bằng phương pháp: Phương pháp Nanosilver đảm bảo số lượng vi sinh vật giảm xuống và không vượt quá giới hạn cho phép, đây chính là một ưu điểm của sản phẩm này. Phần III ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG - Sữa bò tươi. - Bình sữa Nanosilver. 3.2. NỘI DUNG - Tìm hiểu chung về vi khuẩn trong sữa bò tươi. - Kiểm tra sự thay đổi về số lượng vi khuẩn hiếu khí, Colifrom, E.coli, theo thời gian trong sữa bò tươi được bảo quản bằng bình Nanosilver, bảo quản lạnh, không bảo quản. Thí nghiệm được tiến hành tại: Phòng thí nghiệm bộ môn thú y cộng đồng, khoa thú y, trường Đại Học Nông nghiệp Hà Nội. 3.3. NGUYÊN LIỆU. 3.3.1. Mẫu sữa. - Mẫu sữa chưa sử lý tại nông hộ. - Mẫu sữa chưa sử lý tại các cơ sở thu gom. 3.3.2. Các loại môi trường sử dụng. - Môi trường thạch: MacConkey, Brilliant green agar, PCA, EMB, TSI, Endo. - Thuốc thử: dung dịch Kowacs, dung dịch nước pepton, Indol. 3.3.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất trong thí nghiệm. - Máy móc phòng thí nghiệm: Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, nồi hấp khử trùng, buồng cấy vô trùng, cân, bếp từ... - Dụng cụ: Đĩa lồng, ống nghiệm, pipet, đèn cồn.... - Hóa chất: Cồn, nước cất, nước sinh lý... - Các dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn: Que cấy, đèn cồn, lam kính, giá đựng ông nghiệm... 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để thực hiện nội dung nghiên cứu đề tài, chúng tôi áp dụng phương pháp thực nghiệm và thống kê sinh học. 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. Mẫu sữa tươi được lấy và bảo quản ở nhiệt độ thấp trong bình đá và đưa ngay về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu sẽ được chia ra làm 2 lô khác nhau: Lô đối chứng gồm: Sữa 1: Không được bảo quản (đựng trong bình nhựa sạch) Sữa 2: Được bảo quản lạnh 40C (trong tủ lạnh). Lô thí nghiệm: Sữa 3: Sữa được bảo quản bằng bình Nanosilver. Sữa khi mới lấy về phòng thí nghiệm sẽ được kiểm tra các chi tiêu ban đầu như: tổng số vi khuẩn hiếu khí, Colifrom, E.coli. Sau 5h; 10h; 24h lấy sữa 1, 2, 3 ở 2 lô trên để tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu : Tổng số vi khuẩn hiếu khí, Colifrom, E.coli. Kết quả thí nghiệm được thống kê ghi lại. 3.4.2. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu sữa. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng mẫu trên môi trường thạch PCA, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 370C/24-48h. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml sữa được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa thạch nuôi cấy ở đậm độ pha loãng khác nhau. 3.4.2.1. Nguyên liệu. - Mẫu sữa. - Ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, micropipet. - Nước muối sinh lý, thạch PCA đã đổ vào các đĩa lồng. 3.4.2.2.Tiến hành. - Pha loãng mẫu theo cơ số 10 thành các nồng độ :10-1, 10-2,10-3 ... tới đậm độ không còn khả năng dương tính. - Lấy 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa thạch theo phương pháp cấy láng. Để ở tủ ấm 370C/24h – 48h. Phương pháp cấy láng : Dùng pipet trộn đều mẫu đã pha loãng. Hút 0,1 ml dung dịch mẫu bằng micropipet, nhỏ đều mẫu trên mặt thạch, dùng đũa thủy tinh hoặc đáy ống nghiệm vô trùng láng đều mẫu trên mặt thạch. Kết quả được đọc sau 24h. Xử lý kết quả: Chọn những đĩa có từ 15 -300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Nếu chênh lệch các giá trị của hai đậm độ trên nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.Số lượng vi sinh vật trong 1 ml sữa được tính theo công thức: N = C (n1+ 0,1 .n2). d Trong đó: + N : là số vi khuẩn trong 1ml sữa + C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn + n1, n2 : Số đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn. + d : Hệ số pha loãng của đậm độ thứ nhất. Nếu chênh lệch giữa các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, thì lấy đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả. Nếu đậm độ pha loãng ban đầu ít hơn 15 khuẩn lạc. Tính kết quả theo trung bình cộng của khuẩn lạc đếm được ở cả hai đĩa tính ra cho 1 ml sản phẩm. Kết quả biểu diễn dưới dạng thạp phân giữa 1,0 - 9,9 nhân với 10n. 3.4.3. Phương pháp xác định Coliform. 3.4.3.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Trên môi trường Endo có chứa Natri sulfit và fucsin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliform lên men đường lactose tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucsin – sulfit và giải phóng fucsin. Fucsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. 3.4.3.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:        - Đĩa petri                              - Dụng cụ đồng nhất mẫu        - Ống nghiệm                        - Pipet        - Tủ sấy                                 - Cồn 700        - Tủ hấp                                - Tủ ấm        - Tủ lạnh                                - Kéo, kẹp         Tất cả các dụng cụ phải khử trùng trước khi tiến hành thí nghiệm. Môi trường đã được pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. 3.4.3.3. Tiến hành Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng: Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,… - Cấy mẫu: Cấy 0.1 ml mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa petri đã có chứa môi trường thạch MacConkey, mỗi độ pha loãng làm  đĩa lặp lại trên 2 đĩa. Tráng đều mẫu trên mặt thạch.   - Nuôi ủ: Đưa đĩa đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 48h – 72h. Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim. 3.4.3.4. Kết quả Đếm các khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ trong các đĩa petri có trong khoảng 15 –150 khuẩn lạc Số lượng Coliforms có trong 1g mẫu được tính theo công thức: N = C (n1+ 0,1 .n2). d Trong đó:  C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa                 n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1