Khóa luận Khai thác dữ liệu ESTs (Expressed Sequence TAGs) ở chi cam chanh (Citrus) cho việc phát triển marker phân tử SSR (Simple Sequence Repeats)

ấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể đƣợc 10 nhận biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là lý tƣởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn. Microsatellite có đƣợc tính hay thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể đƣợc giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trƣợt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu đƣợc sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhƣng một vài đột biến có thể không đƣợc sửa chữa. Kích thƣớc của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng nhƣ là tính thƣờng xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tƣơng tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể đƣợc khuếch đại. 2.3.2.2 Khuếch đại của microsatellites Microsatellites có thể đƣợc khuếch đại để nhận biết bằng việc sử dụng PCR, sử dụng mẫu của những vùng lân cận (primer). DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao, tách ra làm hai dãy, cho phép sự bắt cặp của primer và sự kéo dài của trình tự nucleotide dọc theo chuỗi đối diện ở nhiệt độ thấp. Kết quả của quá trình này là có đủ hàm lƣợng DNA để có thể nhìn thấy đƣợc trên gel agarose hay arcrylamide, một số lƣợng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại kết hợp với chu trình nhiệt cách hợp lí để tạo ra sự tăng lên theo số mủ trong đoạn đƣợc sao chép. Với sự phong phú của kỹ thuật microsatellite, primer liên kết với vị trí microsatelltes thì đơn giản và đƣợc sử dụng nhanh chóng, tuy nhiên sự phát triển của những primers nhƣ vậy thƣờng là một quá trình tốn kém và đơn điệu. 11 2.3.2.3 Những giới hạn của microsatellite Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt là trong nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng không phải là không có hạn chế. Microsatellite đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng có thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền đƣợc khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố „alleles không giá trị‟ (null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Null alleles có thể đóng góp vào một vài hiện tƣợng. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp nghèo nàn của primer, đặc biệt ở vùng 3‟ nơi mà sự kéo dài bắt đầu, sự khuếch đại ƣu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử đƣợc ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị). Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù đƣợc khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hƣởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần đƣợc xem xét để không đƣa ra giá trị sai của alleles không giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thƣớc alleles cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lƣợng hoặc sự cố trong vùng exon của genes dƣới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhƣng số vị trí khuếch đại thành công trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hƣởng xấu trong trƣờng hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể đƣợc dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thƣớc, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thƣớc, khi 12 mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thƣớc, sự ép buộc này đã đƣợc xác định nhƣng giá trị khẳng định là chƣa chuyên biệt. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thƣờng xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó. 2.3.3 Các loại microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có : Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). 2.3.4 Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) . Hình 2.3 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 13 Quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp. Sự trƣợt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.4 Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 2.3.5 Vai trò của microsatellite Rất nhiều microsatellite đã đƣợc tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng, mặc dù ngƣời ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite đƣợc dùng nhƣ một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ 14 cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite đƣợc tìm thấy khắp nơi ở phần trƣớc vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã đƣợc tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lƣợng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trƣờng hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này đƣợc giải phóng thì gen đƣợc khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động nhƣ một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hƣởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hƣởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hƣởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Nhƣ một trình tự mang mã, microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hƣởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv.,1990,1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt 15 động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv., 1997, 1998). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa 2.4 Phƣơng pháp phân lập microsatellite truyền thống Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dòng dƣơng tính có thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đoán trƣớc và primers đƣợc thu nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa.Vị trí microsatellite đƣợc trải xuyên suốt genome và có thể đƣợc thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR. Primer microsatellite đặc trƣng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. Một qui trình phân lập 1 SSR mất khoảng 3 tuần trong đó giai đọan thiết kế mồi và kiểm tra mòi vừa thiết kế cho SSR mất khỏang hơn 2 tuần. Đồng thời phải tốn một chi phí khá lớn để mua các hóa chất và máy móc cần thiết để tiến hành thí nghiệm ( cần khoảng 200 USD tiền hóa chất để xác định đƣợc 1SSR) nhƣng rủi ro thu đƣợc SSR là khá lớn 16 Hình 2.5: Phƣơng pháp phân lập microsatellite truyền thống 2.5 Phƣơng pháp phân lập microsatellite sử dụng SSR đƣợc phân lập theo phƣơng pháp truyền thống từ thƣ viện cDNA hay thƣ viện Genomic rất tốn kém, do phải sàng lọc từ các mẫu dò một cách mò mẫm. 17 Trong khi đó, phƣơng pháp mới dùng để phân lập SSR từ nguồn dữ liệu ESTs có chi phí thấp và tƣơng đối dễ thực hiện, do trình tự ESTs luôn sẵn có. Hiện nay, có rất nhiều phần mềm để phân lập SSR từ ESTs, ví dụ nhƣ: 1.MIcroSAtellite (MISA) [] 2.Sputnik [ /sputnik/index.html] 3.CUGIssr [] 4.SSRSEARCH [ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/software/scripts/ssr.pl] 5.SSRFinder [ SSRFINDER/ssrfinder_1_0.tar.gz] Công cụ đƣợc tìm kiếm trình tự SSR đƣợc tham khảo và tải về từ địa chỉ của tác giả Steven Schroeder viết với mục đích là: tìm kiếm, tách các trình tự SSR và những vùng kế bên trong một trình tự chính để phục vụ cho những nghiên cứu về sau. So sánh hiệu quả của 2 phƣơng pháp phân lập Phƣơng pháp truyền thống Phƣơng pháp sử dụng Chỉ xác định đƣợc 1 hoặc vài SSR trong 1 lần thí nghiệm Tiền hóa chất, nhân công và thiết bị khá nhiều Thời gian để tiến hành 1 qui trình phân lập , thiết kế mồi cho1 SSR khá lâu (khoảng 3 tuần) Không xác định đƣợc chính xác các SSRs có thể có trong gene Độ chính xác không cao do có thể bị nhiễm trong quá trình làm Có thể xác định đƣợc nhiều SSR 1 lúc Chi phí cho quá trình phân lập khá thấp vì không phải tốn tiền hóa chất và máy móc thiết bị nhiều Thời gian tiến hành phân lập và thiết kế mồi nhanh (1 phút) Xác định chính xác các SSRs có thể có trong 1 gen Độ chính xác cao do cơ sở dữ liệu đã đƣợc phân tích và công bố rộng rãi 18 2.6 Ứng dụng Thiết kế bản đồ gen trong di truyền Đa dạng hóa vật liệu di truyền Nghiên cứu quần thể Chẩn đoán và xác định các bệnh ở ngƣời Sử dụng cho việc bảo tồn hệ sinh vật trong thiên nhiên 2.7 Cơ sở dữ liệu sinh học Dữ liệu sinh học đang đƣợc thu nhận với tốc độ rất nhanh. Đến tháng 8 năm 2000, ngân hàng dữ liệu GENEBANK đã có 8.214.000 mục liên quan đến các trình tự sinh học DNA và cơ sở dữ liệu SWISS-PROT có 88.166 mục liên quan đến các trình tự protein. Trung bình những sơ sở dữ liệu đang tăng gấp đôi kích thƣớc sau mỗi chu kỳ 15 tháng. Ngoài ra sự ra đời của vô số dự án nghiên cứu gen, xác định cấu trúc protein đƣợc mã hóa trong bộ gen... đã tạo ra một lƣợng lớn thông tin sinh học và thông tin này ngày càng đa dạng và phong phú. Do dữ liệu sinh học tăng trƣởng mạnh mẽ nên công cụ tin học đã trở thành một phƣơng tiện không thể thiếu trong phân tích xử lý dữ liệu sinh học. Công nghệ thông tin có thể quản lý nguồn dữ liệu khổng lồ, phân tích các dữ liệu đa dạng và luôn biến đổi trong thế giới tự nhiên. Ngành Sinh Tin học đƣợc xem là lĩnh vực nghiên cứu liên ngành nhằm kết hợp các kỹ thuật xử lý, tính toán và tổ chức thông tin bằng thiết bị tin học với các kỹ thuật, công cụ phổ biến trong ngành sinh học phân tử. Sinh tin học hiện đang là ngành nghiên cứu khoa học khá mới tại Việt Nam , ra đời với mục tiêu xây dựng các công cụ để tính toán , mô phỏng và đƣa ra những chƣơng trình máy tính phục vụ nghiên cứu sinh học . Có thể tiến hành phân lập SSR từ bất cứ đọan gen mong muốn nào trên NCBI và các cơ sở dữ liệu sinh học lớn khác Nếu không có cơ sở dữ liệu EST thì không thể tiến hành phân lập SSR 19 Một số cơ sở dữ liệu lớn, trực tuyến đã đƣợc xây dựng để cung cấp thông tin cho các nhà nghiên cứu sinh học nhƣ NCBI, EBI, SIB, DDBJ,… 2.7.1 NCBI 2.7.1.1 Vài nét về NCBI Hình 2.6 Tƣơng quan giữa NCBI (National Library of Medicine và NIH) NCBI là chữ viết tắt của “Center for Bioinformatic Information”. Đây là trung tâm quốc gia về Công nghệ sinh học, thuộc viện sức khỏe quốc gia của Hoa kỳ (NIH – National Insitute of Health). NCBI chính thức đƣợc thành lập vào ngày 4/10/1988. Đến năm 1991, NCBI đảm nhiệm việc quản lý cơ sở dữ liệu trình tự DNA và từ đó NCBI còn đƣợc gọi là GenBank. NCBI là nơi cung cấp, trao đổi thông tin về sinh học phân tử của Mỹ, thông qua những cơ sở dữ liệu trực tuyến. Ngoài ra, NCBI còn tham gia những nghiên cứu về “sinh học tính toán” (computation biology), phát triển những công cụ phân tích dữ liệu bộ gene, protein,… 3.1.1.2 Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI Nucleotide (GenBank): là cơ sở dữ liệu về trình tự nucleotide. Protein: là cơ sở dữ liệu về trình tự amino acid. Genome: trình tự toàn bộ genome của một số sinh vật. Structure: hay còn có tên gọi là MMDB (Molecular Modeling Database) chứa cấu trúc ba chiều của những đại phân tử bao gồm cả protein lẫn những chuỗi nucleotide.. DDBJ của Nhật Bản, EMBL của Châu Âu, NCBI của Hoa Kỳ là ba cơ sở dữ liệu về trình tự nucleotide lớn, mang tính toàn cầu và ba cơ sở dữ liệu này có hợp tác, trao đổi qua lại dữ liệu lẫn nhau. Từ đó, càng làm cho cơ sở dữ liệu về các trình tự nucleotide ngày càng trở nên phong phú NLM NCBI NIH 20 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Các chƣơng trình và ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng 3.1.1 Hệ điều hành Microsoft Windows XP Server Pack 2. Xây dựng CSDL trình tự SSRs của chi cam chanh (Citrus) trên hệ điều hành này. 3.1.2 Các chƣơng trình phân tích trình tự 3.1.2.1 Chƣơng trình Perl ssrfinder_1_0 Đây là một chƣơng trình của tác giả Steven Schroeder thuộc trƣờng Đại học Missouri – Michigan. Chƣơng trình gồm 6 Perl scripts có chức năng xác định SSR và thiết kế primer thích hợp cho mỗi SSR tìm đƣợc - 1_ssr_repeat_finder.pl: tìm SSR, lấy ra trình tự SSR và vùng flanking cho những phân tích sau. - 2_ssr_primer_designer.pl: thiết kế primer mà mục tiêu là khuếch đại vùng trình tự chứa SSR. - 3_ssr_primer_rep_check.pl: sàng lọc lại các primer đã thiết kế để loại bỏ những primer có chứa trình tự lặp lại - 4_ssr_primer_blast.pl: so sánh các primer đã thiết kế với cơ sở dữ liệu primer - 5_ssr_order_filter.pl: tạo 1 file chỉ chứa SSR mà có primer duy nhất - 6_ssr_primer_formatter.pl: tạo 1 file chỉ chứa SSR có primer duy nhất – file này đƣợc tạo đơn giản chỉ chứa những thông tin cần thiết cho việc chọn lựa primer. 21 Yêu cầu: vì chƣơng trình này đƣợc viết cho hệ điều hành Unix hay Linux nên cần phải thực hiện sửa đổi một số lệnh lập trình cơ bản để có thể chạy trên môi trƣờng Window. Chƣơng trình cần sự kết hợp với 3 phần mềm khác là Primer3, blastall và formatdb để thực thi. Ba phần mềm này có thể tải hoàn toàn miễn phí (có phiên bản dành cho Window) từ trang Primer3 và trang Blast của NCBI Các thông số của chƣơng trình thiết kế primer đều đƣợc mặc định nhƣ sau TARGET= m, n với m là vị trí bắt đầu có microsatllite và n là chiều dài microsatellite (mục tiêu) PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=80-160 80-240 80-300 (kích thƣớc sản phẩm) PRIMER_OPT_SIZE=24 (kích thƣớc tối ƣu của primer) PRIMER_MIN_SIZE=20 (kích thƣớc tối thiểu của primer) PRIMER_MAX_SIZE=28 (kích thƣớc tối đa của primer) PRIMER_OPT_TM=63 (nhiệt độ nóng chảy tối ƣu của primer) PRIMER_MIN_TM=60 (nhiệt độ nóng chảy tối thiểu của primer) PRIMER_MAX_TM=65 (nhiệt độ nóng chảy tối đa của primer) PRIMER_MAX_DIFF_TM=1 (độ chênh lệch nhiệt độ nóng chảy tối đa) Với các thông số mặc định trên chƣơng trình hoàn toàn có thể sử dụng cho mục tiêu của đề tài. Hiện nay, có rất nhiều phần mềm để phân lập SSR từ ESTs, ví dụ nhƣ: 1.MIcroSAtellite (MISA) [], 2.Sputnik [ /sputnik/index.html], 3.CUGIssr [] 4.SSRSEARCH [ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/software/scripts/ssr.pl] 22 5.SSRFinder [ SSRFINDER/ssrfinder_1_0.tar.gz] Các công cụ này hầu nhƣ dựa trên cùng một thuật toán tìm SSR, tuy nhiên mỗi phần mềm đƣợc viết bằng các ngôn ngữ lập trình khác nhau. Một điểm nổi bật của công cụ SSRFinder (đƣợc viết bằng Perl, có tích hợp Primer3 và ncbi-BLAST) là có tích hợp thêm những Perlscript giúp hỗ trợ việc thiết kế primer cũng nhƣ kiểm tra lại primer, tuy nhiên các Perlscript này đƣợc lập trình dƣới hệ điều hành UNIX nên cần đƣợc chỉnh sữa để có thể sử dụng trên hệ điều hành Windows. Ngoài ra, còn có rất nhiều trang web hỗ trợ việc tìm SSR trên trình tự nhƣ: 1.SSR Server [] 2. SSR Primer Discovery [ binpub/ssrprimer/indexssr.pl] 3. SSRIT [] 3.1.2.2 Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST BLAST là một chƣơng trình tìm kiếm và so sánh trình tự tƣơng đồng đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay. Thuật giải của BLAST xuất phát từ ý tƣởng “liệu trong ngân hàng dữ liệu (bao gồm cả CSDL cục bộ và những CSDL lớn trên thế giới nhƣ GenBank, EMBL,…) có trình tự nào giống hoặc gần giống với trình tự đang quan tâm”. BLAST thực hiện so sánh trình tự nhập vào (có thể DNA hay protein) với những trình tự trong CSDL. Kết quả của BLAST là những số liệu thống kê chính xác về tỉ lệ tƣơng đồng và nguồn gốc các trình tự. Chiến lƣợc tìm kiếm trình tự tƣơng đồng trong BLAST đƣợc thực hiện qua ba bƣớc chính: Đầu tiên BLAST tìm kiếm những đoạn tƣơng đồng HSPs (High Scoring Pair) giữa một trình tự đƣa vào và mỗi trình tự trong CSDL. Công việc tiếp theo là thực hiện đánh giá ý nghĩa thống kê dựa trên bất cứ sự tƣơng đồng nào đƣợc tìm thấy. Sau cùng BLAST đƣa ra một báo cáo kết quả giống nhau thỏa mãn ngƣỡng giá trị mà ngƣời dùng mong muốn. 23 Stand-alone BLAST sử dụng trong khóa luận này có thể tải về từ địa chỉ của trang CSDL NCBI: blast-2.2.14-ia32-win32.exe (ftp://ftp.ncbi.nih.gov.blast/executables/). 3.1.2.3 Hệ quả trị CSDL quan hệ Microsoft ACEESS Microsoft Access là một phần mềm ứng dụng thuộc bộ phần mềm Microsoft Office, đƣợc sử dụng để quản lý dữ liệu (quản lý nhân sự, khách hàng, vật tƣ, kế toán…).Phần mềm này đƣợc bảo vệ và phân phân phối bởi hãng Microsoft Phiên bản Access tùy thuộc vào phiên bản của bộ phần mềm Microsoft Office Để sử dụng phần mềm này chúng ta phải mua bản quyền của Microsoft Mỗi tập tin ACCESS gọi là một cơ sở dữ liệu. Một cơ sở dữ liệu chứa đựng nhiều dữ liệu nằm trong một thành phần chính của một tập tin ACCESS gọi là bảng (TABLE). Các bảng này có mối quan hệ với nhau theo một quy luật nào đó do ngƣời thiết kế tạo nên. 3.1.2.4 Egassembler Là 1 công cụ trực tuyến cung cấp những công cụ sinh học tự động mà ngƣời dùng có thề sử dụng để phân tích làm sạch trình tự, dấu những vùng lập lại, dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors, dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan, sắp gióng cột và assembly các đọan ESTs và đọan genomic. Hệ thống máy chủ chấp nhận nhiều dạng trình tự DNA ở dạng FASTA nhƣ EST, , cDNA, gDNA, GSS Hệ thống gồm 5 công cụ chính:  Làm sạch trình tự  Dấu những vùng lặp lại  Dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors  Dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan  Assembling: sắp gióng cột vá chồng các trình tự lại với nhau tạo thành các Contigs và Singletons 24 Egassembler web có 3 tùy chọn chính, mỗi tùy chọn dành cho những ngƣời dùng khác nhau One-Click Assembly : cho ngƣời dùng mới bắt đầu với sinh tin học, các bƣớc sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt theo mặc định đã cài sẵn, ngƣời dùng có thể lựa chọn thƣ viện dữ liệu để dấu những vùng lặp lại, dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors, dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan.Các quá trình xử lý đƣợc thực hiện lần lƣợt. Step-by-Step Assembly: Ngƣời dùng có thể sử dụng mọi công cụ trong web, và có thể chạy từng mục một với các tùy chọn nâng cao. Kết quả đầu ra ở bƣớc trƣớc sẽ đƣợc sử dụng làm dữ liệu đầu vào cho bƣớc tiếp theo một cách tự động. Ngƣời dùng có thể đi đến bất kỳ bƣớc nào vào bất cứ thời điểm nào với kết quả đã đƣợc lƣu lại từ trƣớc Stand-Alone Processing : Tùy chọn này giống với Step-by-Step Assembly chỉ khác ở chỗ ngƣời dùng không thể sử dụng kết quả đầu ra ở bƣớc trƣớc để làm dữ liệu đầu vào cho các quá trình sử lý khác 3.1.3 Apache web Server . Apache web Server là một trình chủ web đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay trên Internet. Apache có đƣợc một vị trí đáng nể nhƣ thế là nhờ vào việc nó là một chƣơng trình mã nguồn mở và hoàn toàn miễn phí. Hai ƣu điểm này đã giúp Apache đƣợc yêu thích đối với những công việc vừa và lớn của nhiều công ty trên thế giới. Một trong những điểm mạnh của Apache là khả năng nâng cấp trình chủ web thông qua các module. Khi một yêu cầu từ trình tự khách đƣợc gởi đến Apache phải trải qua một loạt nhiều giai đoạn sử lý để cuối cùng trả về kết quả cho ngƣời dùng. Apache có thể đƣợc tải về từ địa chỉ : ( 25 3.4 CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH 1 Thu nhập trình tự 2 Lọai các dữ liệu nhiễu và dƣ 3. Aseembling 4 Tìm SSR 4.1Blastn 4 Tìm SSR 5 Thiết kế và kiểm tra Primer 6. tBLASTx trên cơ sở dữ liệu UniGene 7. 7.Đƣa vào Sơ đồ qui trình phân lập và xác định 8 Tích hợp chức năng SSR của cây cam quýt CSDL dbEST và CoreNucleotide của NCBI ESTs - Citrus ESTs Citrus không thừa, không nhiễu Contigs Singletons ESTs, SSR Citrus CSDL EST-SSr Primer Citrus Cơ sở dữ liệu quan hệ WebSite Cơ sở dữ liệu EST-SSR- Primer Citrus liên quan đến gene kháng bệnh EST-SSR none primer citrus 26 Bƣớc 1. Thu thập trình tự ESTs Citrus từ CSDL dbEST Quá trình thu nhận trình tự nucleotide đƣợc tóm tắt thành sơ đồ sau Bảng 3.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận trình tự chính từ NCBI Từ khóa sử dụng cho tung lòai là Bảng 3.2 : Từ khóa sử dụng để thu nhận trình tự trên NCBI Citrus aurantium "txid43166"[Organism] AND gbdiv_EST[PROP] Citrus clementina "txid85681"[Organism]ANDgbdiv_EST[PROP] Citrus jambhiri "txid64884"[Organism]ANDgbdiv