Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của lá cây bình bát nước annona glabra l

-Yuh Yang, Jung-Yaw Lin, Kuo- Hsiung Lee và Yang-Chang Wu đã phân lập được 13 hợp chất gây ức chế nhẹ các hoạt động nhân bản của tế bào HIV và gây ức chế hoạt động của virut HIV [28] R1 R3 R2 Bảng 1.1 Mười hai hợp chất được nhóm tác giả Fang-Rong Chang phân lập Kí hiệu R1 R2 R3 Tên gọi (33) CHO OAc COOCH3 methyl-16β-acetoxy-19-al -ent-kauran-17-oate (34) CH2OAc COOH H 16α-hydro-19-acetoxy-ent-kauran -17-oic acide (35) COOH =CH2 ent-kaur-16-en-19-oic acide (36) COOH CH2OH OH 16α, 17-dihydroxy-ent-kauran-19 -oic acide (37) COOH OH CH2OAc 16β-hydroxy-17-acetoxy-ent -kauran-19-oic acide (38) CH3 H COOH 16β-hydro-ent-kauran-17-oic acide (39) CH3 COOH H 16α -hydro-ent-kauran-17-oic acide (40) CH2OH =CH2 ent-kaur-16-en-19-ol (41) CHO COOH H 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic acide (42) CHO COOCH3 H methyl-16α-hydro-19-al-ent -kauran-17-oate (43) CHO OH CH2OAc 16β-hydroxyl-17-acetoxy -ent-kauran-19-al (44) OH COOH H 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acide CH2OH CH2OH Ent-kaur-15-ene-17,19-diol (45) Năm 1997, nhóm tác giả Teresa Gallardo, Raul Aragon, Jose R. Tormo, M. Amparo Blazquez, M. Carmen Zafra- Polo và Diego Cortes đã phân lập các hợp chất có tính kháng khuẩn, kháng vi sinh vật. OH3C (CH2)5 O (CH2)9CH3 O OH OH OH OH Gigantertrocin–A (46) O (CH2)5 (CH2)3 O (CH2)10CH3 OH R1 OH3C OH R2 R1=R2= OH: Annonacin (47) R1=H, R2=OH: Corossolin (49) R1=OH, R2=O: Annonacinone (48) R1=H, R2=O: Corossolone (50) OH3C (CH2)7 O (CH2)9CH3 O OH OH OH OH Glabranin (51) OH3C (CH2)7 O (CH2)7CH3 O OH OH OH OH Muricatertrocin–B (52) OH3C (CH2)5 O (CH2)11CH3 O OH OH OH OH Gigantertronenin (53) O(CH2)9 O O (CH2)9CH3 H3C O OH OH OH HO Laherradurin (54) O (CH2)7 O O (CH2)9CH3 H3C O OH OH OH HO Itrabin (55) O (CH2)7 O O (CH2)9CH3 H3C O OH OH OH * Erythro: molvizarin (56)Threo: parviflorin (57) Năm 1997, nhóm tác giả Li Chao-Ming, Tan Ning-Hua, Mu Qing, Zheng Hui-Lan, Hao Xiao-Jiang, Liang Hui-Ling, Zhou Jun đã tổng hợp được 2 hợp chất cyclopeptieds mới là glabrin A (58) và glabrin B (59) từ hạt của Annona Glabra.[13] Glabrin A (58) Glabrin B (59) NH N H HN HNN H N O O O O O Gly Leu VAl OTyr Pro Ne OH N NH N H N H HN HN H NNH O O O O O O O O Val Ala Val Tyr Gly Thr Pro OMet OH S O Năm 1997, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlinphân lập được 4 hợp chất là glabracins A (60) và glabracins B (61), bullatanocin (62)và javoricin (63)có hoạt tính chống ung thư mạnh. (CH2)7 O O (CH2)5 O OH OHOH OH O 1 3 34 24 18 11 23 A Glabracin A (60) (A= erythro) Glabracin B (61) (A= threo) CH3(CH2)6 O O (CH2)7 O O OH OH OH OH Bullatanocin (62) CH3(CH2)9 O (CH2)7 O OH OH OH OH O 20 15 12 4 1 37 Javoricin (63) Cũng cùng năm đó, nhóm tác giảXiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin đã phân lập được 2 hợp chất glacins A (64) và glacins B (65).[32] Glacins A (64) H3C (CH2)7 O (CH2)3 O O OH OHOH (CH2)5 OH H3C (CH2)9 O O O OH OHOH (CH2)5 OH Glacins B (65) Năm 1998, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin cũng đã phân lập ra 2 hợp chất có hoạt tính chống ung thư vú ( MCF-7) và ung thư tụy (Paca-2). Đó là annoglacin A (66) và annoglacin B (67). Hai hợp chất này có hoạt tính mạnh hơn nhiều lần so với adriamycin.[15] H3C (CH2)9 O (CH2)3 O O OH OHOH (CH2)5 OH Annoglacin A (66) H3C (CH2)9 O (CH2)3 O O OH OHOH (CH2)5 OH Annoglacin B (67) Cũng cùng năm đó, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin cũng đã phân lập ra 2 hợp chất có hoạt tính sinh hoc cao từ lá của Annona glabra. Đó là annoglaxin (68) và 27- hydroxybullatanocin (69). Trong đó hợp chất (69) có hoạt tính chống lại ung thư thận ( A-498), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC-3) và ung thư tụy (Paca-2 ); mạnh hơn chất đối chứng dương adriamycin ít nhất 100 000 lần.[30] Annoglaxin (68) O O O O OH OHOH O O OOHOH OH O OH 27- hydroxybullatanocin (69) Cuối năm 1998, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin cũng đã phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính cao từ lá của cây Annona Glabra L. Đó là 6-OH Desacetyluvaricin (70) và 6-OH-4-Deoxysquamotacin (71).[31] 6-OH Desacetyluvaricin (70) 6-OH-4-Deoxysquamotacin (71) Năm 1999, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin đã phân lập được hợp chất blumenol A (72) từ lá của cây Annona Glabra L. Blumenol A (72) Cũng vào năm này, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin đã phân lập được hợp chất pondaplin (73).[29] O O O O OOHOH O OH O O OOHOH O OH C3H7 OH OH O Pondaplin (73) Năm 2000, nhóm tác giả Chang Fang-Rong, Chung-Yi Chen, Tian-Jye Hsieh, Chun-Ping Cho, and Yang-Chang Wu đã phân lập được 6 hợp chất mới, đó là : [8] Bảng 1.2 Sáu hợp chất được nhóm tác giả Chang Fang-Rong phân lập. Kí hiệu R1 R2 R3 Tên gọi (74) COOH COOCH3 OOCH3 Annoglabasin C (75) CHO COOCH3 OOCH3 Annoglabasin D (76) CH2OH COOH H Annoglabasin E (77) OH COOCH3 OOCH3 Annoglabasin F (78) COOH CH3 OCH3 16R-methoxy-ent-kauran- 19oic acid (79) COOCH3 COOCH3 H 16R-hydro-ent-kauran- 17,19-dimethylester Cũng cùng năm năm đó, nhóm tác giả Chang Fang-Rong, Chung-Yi Chen, Tian-Jye Hsieh, Chun-Ping Cho, and Yang-Chang Wu đã phân lập được thêm 17 hợp chất từ trái và vỏ của Annona Glabra L.[6] R1 R2 R3 H H NO O O O N O O O Annobraine (80) Liriodenine (81) N H3CO HO OCH3 OH H N H3CO H3CO OCH3 OH Cl Kikemanine (82) Dehydrocorydalmine (83) N H3CO H3CO O Lysicamine (84) NH H3CO HO O O H NH H3CO H3CO H O N R1 R2 O R3H R1 R2 R3 Nornucif erine (85) OCH3 OCH3 H Anonaine (86) H-OCH2O- N-formylanonaine (87) -OCH2O- CHO (+)-Nordomesticine (88) (+)-Stepharine (89) 1-aza-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-9,10 N-trans- feruloyl-tyramine (91) anthracenedi-one (90) R = H, b-sitosterol (92) R = H; *22,23 =, stigmasterol (93) R = Glu; b-sitosterol-D-glucoside (94) R = Glu; *22,23 =, stigmasteryl-D-glucoside (95) OO H HO H HO H H OHH O C O (CH2)14CH3 6-O-palmitoyl-β-sitosteryl-D-glucoside (96) Năm 2003, nhóm tác giả Yang Nian Yun, Tian Li Juan, Meng Zheng Mu, Han Ying đã phân lập 2 hợp chất annonebinide A (97) và samoquasine A (98) từ vỏ Annona glabra L.[26] HO H3CO H N OH O N H O O O RO * 22 23 HO O CH2 OH NH N O Annonebinide A (97) Samoquasine A (98) Năm 2004, nhóm tác giả Ching-Hsiein Chen, Tian-Jye Hsieh, Tsan-Zon Liu, Chi-Liang Chern, Pei-Ying Hsieh và Chung-Yi Chen đã phân lập ra 2 hợp chất annoglabayin (99) và annomontacin (100).[7] Annoglabayin (99) Annomontacin (100) Năm 2004, nhóm tác giả Tian-Jye Hsieh, Yang-Chang Wu, Su-Ching Chen, Ching-Shan Huang và Chung-Yi Chen đã phân lập được hợp chất annonglabasin G (101). H H H H H H H3C (CH2)11 O (CH2)6 (CH2)5 O OOHOH OH OH Annonglabasin G (101) Năm 2010,hai nhà hóa học Sheng-Fa Tsai and Shoei-Sheng Lee đã phân lập được bốn hợp chất mới từ thân cây Annona Glabra L đó là : (7S,14S)-(-)-N-methyl- 10-O-demethylxylopinine (102), S-(-)-7,8-didehydro-10-O- demethylxylopininium (103), S-(-)-7,8-didehydrocorydalminium (104) và 5-O- methylmarcanine D (105).Trong đó, hợp chất (103) và (104) là những hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên.[23] H CH2OOCH3 H CHO H N+ H3CO H3CO OH OCH3 H .TFA H S-(-)-7,8-didehydro-10-O- demethylxylopininium (103) N+ H3CO H3CO OH H H .TFA OCH3 S-(-)-7,8-didehydrocorydalminium (104) N+ H3CO H3CO OH OCH3 H .TFA (7S,14S)-(-)-N-methyl-10-O-demethylxylopinine (102) CH3 N H O O O OCH3 CH3 5-O- methylmarcanine D (105) 1.2.2. Công dụng và dược tính Quả giống quả bình bát nhưng nhỏ hơn, có mùi thơm nhưng nếu không quen sẽ khó ăn. Quả chín có thể ăn cùng với đường như một loại nước giải khát. Quả bình bát nước có tính ức chế các vi khuẩn Staphylococcus hemolyticus (chuỗi cầu khuẩn tan huyết), Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudommonas aerogennes. Hạt và vỏ cây dã ra có tác dụng làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lị và làm thuốc sát trùng. Dịch của lá cây dùng để trừ chấy rận. Ở Cu Ba, gỗ cây bình bát nước nhẹ nên được dùng làm giữ lưới đánh cá nổi trên mặt nước. Ở Trung Quốc, toàn cây dùng làm thuốc trị ung bướu; lá được dùng để trị viêm khí quản mãn tính. 1.3. SƠ LƯỢC VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA[34,35,36] Trong cơ thể con người, thường xuyên diễn ra nhiều sinh hoạt hoặc xây dựng hoặc huỷ hoại. Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào nhưng đồng thời cũng lại làm hại tế bào. Có những phân tử gây ra tổn thương thì cũng có những chất đề kháng lại hành động phá phách này. Gốc tự do, oxy hóa và chất chống oxy hóa là một ví dụ. Những phân tử này ảnh hưởng đến cơ thể con người rất nhiều. Chất ôxy hoá còn gọi là gốc tự do, đó là những phân tử hay hợp tử chất có chứa điện tử độc thân không ghép đôi. Chính do chứa điện độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn mang tính "huỷ hoại", sẵn sàng thực hiện tính ôxy hoá, cướp điện tử của chất mà nó tiếp xúc và làm chất bị nó ôxy hoá bị huỷ hoại nặng nề.Trong cơ thể, phản ứng của chất ôxy hoá của gốc tự do gây huỷ hoại tế bào (đặc biệt ở màng tế bào hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào) phá huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá. Oxy hóa là quá trình chuyển electron từ nguyên tử này sang nguyên tử khác, oxy hóa rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất. Tuy nhiên, khi electron ở trạng thái độc thân, chúng sẽ tạo ra các gốc tự do được gọi là những loại oxy hoạt động (reactive oxygen species) như: superoxide (O2.), peroxyl (ROO.), alkoxyl (RO.), hydroxyl (HO.) và nitric oxide (NO.). Gốc tự do RO. và HO.nhanh chóng tấn công vào các phân tử lipid trong màng tế bào, protein trong các mô hay các enzyme, cacbohydrate và AND gây hư hại màng tế bào, AND, biến tính protein. Quá trình này được xem là nguyên nhân của sự lão hóa và nhiều bệnh tật khác như tim mạch, suy giảm trí nhớ, ung thư, huyết áp,. Trong cơ thể, bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa “ nội sinh” để cân bằng lại, vô hiệu hóa các gốc tự do. Hệ thống các chất chống ôxy hoá nội sinh gồm các enzym như glutathione peroxidase, superroxid, dismutase... đặc biệt là vitaminC, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A) xúc tác các phản ứng khử để vô hiệu hoá gốc tự do (còn gọi là "bẫy" gốc tự do) giúp cơ thể khoẻ mạnh. Nhưng do các yếu tố bên ngoài tác động vào làm cho các gốc tự do sinh ra quá nhiều và hệ thống chất ôxy hoá nội sinh không đủ sức cân bằng, cơ thể sẽ sinh ra rối loạn bệnh lý, có thể gây ung thư. Nguyên nhân gây ra ung thư đã được làm sáng tỏ là một quá trình nhiều bước, trong đó giai đoạn xúc tiến có liên hệ chặt chẽ đến sự hư hại mô bị viêm và mô bị oxi hóa. Bằng thực nghiệm đã chứng minh được các gốc tự do có liên quan đến sự xúc tiến khối u trong da chuột và các mô khác. Khi các chất hoạt hóa khối u được áp dụng cục bộ vào da chuột đã sinh ra H2O2 trong biểu bì, điều này tương quan với khả năng xúc tiến khối u của các chất này. Do đó các chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh có khả năng ngăn chặn sự gây ung thư, đặc biệt ở giai đoạn xúc tiến. Do vậy, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxi hóa ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực Y-dược nhằm phát hiện những chất chống oxi hóa mang lại những tác dụng tốt có lợi cho sức khỏe con người, trong đó chất chống oxi hóa có nguồn gốc thiên nhiên được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính ít độc, dễ hấp phụ đối với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ. Chương 2. PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1 . THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1. Thiết bị  Tủ sấy hiệu Memmert.  Bếp cách thủy hiệu Julabo 461 Water Bath.  Máy cô quay chân không hiệu Buchi-111.  Đèn UV ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm hiệu UVITEC.  Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT. 2.1.2. Dụng cụ  Máy sấy.  Máy đánh siêu âm.  Máy hút chân không.  Cột sắc ký đường kính 2-5.5 cm.  Máy cô quay chân không Buchi-111.  Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT.  Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S.  Đèn UV soi tử ngoại bước sóng 254-365 nm hiệu UVITEC.  Các dụng cụ thông thường dùng để ly trích như: bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm, bình cô quay, ống đong 2.1.3. Hóa chất  Silica gel dùng cho pha thường của Scharlau, Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm), silica gel pha đảo ODS (0,040-0,063 mm), Sephadex LH-20 và sắc ký điều chế kết hợp sắc ký lớp mỏng.  Dung môi dùng cho sắc ký cột pha thường, pha đảo, sắc ký lớp mỏng gồm: - Ete dầu - Etyl acetate - Chlorofom - Hexan - Methanol - EthanolA cetone  Thuốc thử hiện hình các cấu tử hóa học trên sắc ký lớp mỏng: dung dịch H2SO4/EtOH (10%), FeCl3/EtOH. 2.1.4. Nguyên liệu Mẫu lá cây Bình bát được thu hái tại quận 8, Bình Chánh, TP.Hồ Chí Minh. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân lập các chất. Sử dụng phương pháp ngâm dầm với ethanol để chiết xuất cao ethanol thô. Các cao phân đoạn được điều chế bằng phương pháp trích pha rắn cao ethanol ban đầu với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: hexan, chloroform, ethyl acetate và methanol. Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, sắc ký bản điều chế kết hợp sắc ký lớp mỏng để phân lập các chất tinh khiết từ cao etyl acetate. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng. 2.2.1. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Với chất chuẩn nội là TMS. 2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa Hiện nay có rất nhiều phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa như : oxygen radical absorbant capacity (ORAC), total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH),. Tuy nhiên ở đây tôi chọn thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH tại phòng phân tích môi trường, Viện công nghệ Hóa Học; vì những ưu điểm sau : • Phương pháp đơn giản • Thời gian tiến hành nhanh chóng • Phạm vi thử nghiệm được với nhiều tác nhân kháng oxy hóa khác nhau. Nguyên tắc Tên khoa học: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dimer hóa như một số gốc tự do khác. Hoạt tính kháng oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 515 nm. DPPH Cơ chế Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử hydrogen, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng như sau: + RH + R. Điều kiện tiến hành phản ứng Dung môi phản ứng : Kết quả của nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng EtOH và MeOH là hai dung môi tối ưu nhất. Độ hấp thu : Đỉnh hấp thu cực dại nằm ở bước sóng 515-520 nm. Thời gian đo độ hấp thu : Thời gian phụ thuộc vào hàm lượng mẫu đem phản ứng. Tuy nhiên, ta nên để mẫu phản ứng 30 phút trước khi đo là tối ưu nhất. N N NO2 O2N O2N N N NO2 O2N O2N N H N NO2 O2N O2N 2.3. THỰC NGHIỆM. 2.3.1. Điều chế cao thô Lá cây Bình bát được phơi khô, sấy và nghiền nhỏ thành bột mịn (5kg). Nguyên liêu bột mịn được tận trích với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao ethanol thô (500 g). Cao thô được hòa tan vào một lượng tối thiểu ethanol rồi tẩm silica gel vào, đuổi khô dung môi trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 40°C cho đến khi thu được bột tơi. Sau đó trích pha rắn cao ethanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol, thu được các cao tương ứng. Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 1. Sơ đồ 1 Quy trình chiết. Bột cây khô 5 kg - Tận trích với EtOH 96%. - Lọc, cô quay thu hồi dung môi. Cao thô Ethanol 500,0g - Trích pha rắn với các dung môi: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol. - Cô quay thu hồi dung môi. Cao Hexan 100,0 g Cao Ethyl acetate 30 g Cao Chloroform 30,7 g Cao Methanol 310,0 g 2.3.2 Cô lập và tinh chế các hợp chất Trong khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát cao etyl acetate. Đầu tiên, cao etyl acetate (30g) được SKC silica gel pha thường với dung môi rửa giải là ete dầu, EtOAc và hỗn hợp của chúng ( với độ phân cực tăng dần từ 0- 100%), các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom thành 7 phân đoạn và mã hóa thành A1-17. Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Kết quả sắc kí cột cao EtOAc Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng (g) Kết quả SKLM Ghi chú 1 A1 3.55g Nhiều vết Không khảo sát 2 A2 8,81g Nhiều vết Không khảo sát 3 A3 2,34g Nhiều vết Không khảo sát 4 A4 3,05g Nhiều vết Không khảo sát 5 A5 2,55g Nhiều vết Không khảo sát 6 A6 3,36g Rõ vết Khảo sát 7 A7 1,58g Nhiều vết Không khảo sát Khảo sát phân đoạn A7 (3,36g). Cao phân đoạn A11 có màu đen, dạng dầu; tan tốt trong MeOH nên ta tiến hành SKC sephadex LH 20 nhiều lần với dung môi MeOH . Mẫu tách tốt với hạt sephadex LH 20. Trên cột mẫu tách thành ba lớp, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 4 phân đoạn ( A11.1-A11.4). Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.2. Bảng 2.2 Kết quả SKC trên phân đoạn A11 Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng (mg) Kết quả SKLM Ghi chú 1 A6.1 977mg Nhiều vết Không khảo sát 2 A6.2 989mg Rõ vết Khảo sát 3 A6.3 650mg Nhiều vết Không khảo sát 4 A6.4 500mg Rõ vết Khảo sát Khảo sát phân đoạn A6.4. Phân đoạn A6.4 tiếp tục được SKC sephadex LH 20 với dung môi MeOH thu được hợp chất kí hiệu AGAΙ (m=200mg) Khảo sát phân đoạn A6.2 Phân đoạn được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3:MeOH ( tỉ lệ 100% CHCl3 , 100:1 , 80:1, 70:1, 50:1 và 100% MeOH) thu được 3 phân đoạn (A6.2.1-3). Phân đoạn A6.2.2 được SKC silicagel pha thường với hệ dung môi H:Ac (tỉ lệ 25:1, 15:1, 10:1,7:1) thu được 2 phân đoạn A6.2.2.1 và A6.2.2.2. Phân đoạn A6.2.2.2 được SKC silica gel pha đảo với hệ dung môi MeOH: H2O ( với độ phân cực giảm dần từ 50% MeOH đến 100% MeOH ) sau đó giải ly SKLM thu được hợp chất AGAΙΙ (m=70 mg). 2.3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất. Sơ đồ 2 Quy trình phân lập các chất. Bột cây khô 5 kg - Tận trích với EtOH 96%. - Lọc, cô quay thu hồi dung môi. Cao thô Ethanol 500,0g - Trích pha rắn với các dung môi: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol. - Cô quay thu hồi dung môi. Cao Hexan 100,0 g Cao Ethyl acetate 30 g Cao Chloroform 30,7 g Cao Methanol 310,0 g Phân đoạn A1 m=3,55g Phân đoạn A2 m= 8,81g Phân đoạn A3 m= 2,34g Phân đoạn A4 m= 3,05g Phân đoạn A6 m= 3,36g Phân đoạn A7 m= 1,58g AGAΙ m=200mg SKC silica gel pha thường với hệ dung môi Ether dầu : EtAc Phân đoạn A5 m= 2,55g AGAΙΙ m=70mg 2.4 Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm. 2.4.1 Hợp chất AGAΙ Hợp chất AGAΙ thu được ở dạng bột màu vàng Nhiệt độ nóng chảy : 316OC Sắc kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi Ether dầu : EtOAc = 1:3 , hiện bằng thuốc thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng , có Rf = 0,66. Phổ 1H-NMR (500 MHz, Acetone d6), δ (ppm), J (Hz): 6,2 ( 1H; d; 2Hz; H-6); 6,5 (1H; d; 2Hz; H-8); 6,99 (1H; d; 8,5Hz; H- 5’); 7,69 ( 1H; dd;8 Hz;2Hz;H-6’); 7,8 (1H; d; 2 Hz; H- 2’) ; 12,1 (1H, s, 5-OH). Phổ 13C-NMR (500 MHz, Acetone d6), δ (ppm) : 94,4 (C-8); 99,1 (C-6); 104 (C-10); 115,7 (C-2’); 116,1 (C-5’); 121,4 (C-6’); 123,7 (C-1’); 136,7 (C-3); 145,8 ( C- 3’); 146,9 (C-2); 148,3 (C-4’); 157,7 (C- 9); 162,2 (C-5); 165,0 (C-7); 176,5 (C-4). Hình 2.1 Sắc kí lớp mỏng hợp chất AGAΙ Hình 2.2 Hợp chất AGAΙ 2.4.2 Hợp chất AGAΙΙ Hợp chất AGAΙ thu được ở dạng bột màu trắng. Sắc kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi CHCl3 : MeOH = 10:1 , hiện bằng thuốc thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng nâu , có Rf = 0,52. Phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine d5), δ (ppm), J (Hz) : 0,85 (6H; t; H-24’, H- 16); 1,22- 1,3 (62H; m; H-6-15, H-3’-23’); 3,98 (1H; t;8Hz; 7,5Hz ; H-2’’); 4,1 (3H; m, H-3’’, H-4’’, H-5’’); 4,3 (2H; m; H-6’’); 4,5 (2H; m; H-3;H-2’); 4,68( 1H; m; H-1); 4,9 (1H; d; 7,5Hz; H-1’’); 5,4 -5,5 (2H,m, H-4; H-5); 8,5 (1H; d, >N-H). Phổ 13C-NMR (500 MHz, Pyridine d5), δ (ppm) : 14,2 ( C-16; C-24’); 51,7 ( C- 2); 62,6 ( C-6’’); 71,5 ( C-4’’); 72,4-72,5 ( C-3; C-2’); 75,1 (C-2’’); 78,4-78,5 ( C- 3’’;C-5’’); 105,5 ( C-1’’); 130,6-130,8 ( C-4; C-5 ), 175,6 ( >C=O). 2.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa. Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong MeOH. Hợp chất AGAΙ được tiến hành nghiên cứu ở 5 nồng độ : 24 µg/ml, 20 µg/ml, 15µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml. (các mẫu pha trong MeOH) Lấy 0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch DPPH. Thêm MeOH vừa đủ 10 ml ( hệ số pha loãng là 20). Hỗn hợp sau khi pha đuợc để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Sau đó đo quang ở buớc sóng = 515 nm. Mỗi mẫu được đo 3 lần. Kết quả đo được ghi trong bảng 2.3. Nồng độ mẫu µg/ml Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình 0,25 0,417 0,366 0,416 0.3997 0,5 0,264 0,256 0,265 0.2617 0,75 0,181 0,184 0,197 0,1873 1 0,097 0,115 0.061 0,091 1.2 0,078 0.101 0.063 0,0807 0 0,49 0,49 Bảng 2.3 Kết quả đo quang ở bước sóng 515 nm. Hình 2.3. Mẫu thử sau khi cho phản ứng với DPPH. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ CHUNG Sử dụng sắc ký cột với các chất nhồi cột là silica gel pha thường, gel sephadex LH-20 kết hợp với sắc ký bản mỏng, từ cao EtOAc lá bình bát nước chúng tôi đã phân lập được hợp chất Quercetin và JCer-3. Tiến hành phân tích hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH của hợp chất AGAΙ , chúng tôi đã tìm được IC50 là 0,5245µg/ml. 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT AGAΙ Hợp chất AGAΙ thu được ở dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 316oC, sắc kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi Ether dầu : EtOAc = 1:3 , hiện bằng thuốc thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng , có Rf = 0,66 ; cho dương tính với thuốc thử FeCl3/ EtOH , chứng tỏ đây là một dẫn xuất phenolic. Phổ 1H-NMR (500 MHz, Acetone d6) ( phụ lục 1) xuất hiện các tín hiệu của proton ở vùng thơm δH [6,2 ( 1H; d; 2Hz); 6,5 (1H; d; 2Hz); 6,99 (1H; d; 8,5Hz); 7,69 (1H; dd; 8 Hz); 7,8 ( 1H; d; 2 Hz) ] và một tín hiệu proton –OH kiềm nối δH 12,1 (1H; s). Phổ 13C-NMR (500 MHz, Acetone d6) (phụ lục 2) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 3) cho biết hợp chất AGAΙ có 15 carbon bao gồm 5 nhóm (>CH- ) và 10 carbon tứ cấp (>CC=O) gắn với vòng thơm có δC (176,5 ). Từ các số liệu trên cho ta dự đoán hợp chất AGAΙ là một flavon. 7 6 5 10 9 8 4 3 2 O O 1' 6' 5' 4' 3' 2' A B Khung flavon. Biện luận vòng A Vì carbon của nhóm carbonyl có δC (176,5 ; C-4) nên C-3 gắn với nhóm (-OH) và có một nhóm thế hidroxi (-OH) ở C-5 vì có tín hiệu proton của nhóm –OH kiềm nối δH 12,1 ( 1H; s). Trên phổ HSQC có các tương quan sau : [δH 6,2 ( 1H; d; 2Hz); δC (99,1)] ; [δH 6,5 (1H; d; 2Hz); δC (94,4) ]; [δH 6,99 (1H; d; 8,5Hz;); δC (116,1)] ; [δH 7,69 ( 1H; dd; 8 Hz; 2Hz); δC (121,4)]; [δH 7,81 ( 1H; d; 2 Hz; ); δC (115,7)]. Trên phổ HMBC, hai proton δH ( 6,2 ;1H; d; 2Hz) và δH (6,5;1H; d; 2Hz) lần lượt tương quan với δC (94,4) và δC (99,1) mà không có tương quan với các carbon gắn với các proton còn lại; nên hai proton này sẽ ở vị trí H-6 và H-8. Mặt khác, δC (99,1) tương quan với δH ( 12,1) nên δC (99,1) là C-6 và δH ( 6,2) là H-6; suy ra [δC (94,4) : C-8 ; δH ( 6,5) : H-8 ]. Trên phổ HMBC, H-8 tương quan với δC (157,7) không tương quan với δC (162,2) còn H-6 tương quan với δC (162,2) không tương quan với δC (157,7) nên δC (157,7) là C-9 và δC (162,2) là C-5. Trên phổ HMBC, ta thấy C-5, C-6 và δC (104,1) cùng tương quan với δH (12,1) nên δC (104,1) là C-10. Bên cạnh đó, H-6 và H-8 cùng tương quan với δC (165,0) nên ắt hẳn đây là C-7. Hình 3.1 Các tương quan HMBC trong vòng A Biện luận vòng B O OO OH H H H HO 8 56 7 9 10 4 3A Từ phổ 1H-NMR và phổ HMBC ta có thể thấy rằng H-5’; H-6’ ; H-2’ lần lượt là các proton sau δH [6,99 (1H; d; 8,5Hz); 7,69 ( 1H; dd; 8 Hz; 2Hz); 7,8 ( 1H; d; 2 Hz)]. Từ đó, C-5’; C-6’ ; C-2’ lần lượt là các carbon sau δC [ 116,1; 121,4; 115,7 ]. Trên phổ HMBC, H-2’ và H-6’ cùng tương quan với carbon δC (146,9) mà H- 5’ không tương quan nên ắt hản đó là C-2. Mặt khác, H-2’ và H-5’ cùng tương quan với carbon δC (145,8) nhưng H-6’ không tương quan nên đó chính là C-3’. Phổ HMBC, ta thấy carbon có độ chuyển dịch δC (136,7) không có tương quan với proton nào hết nên đó chính là C-3. Các carbon δC [(123,7); (148,3)] lần lượt là C- 1