Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao etyl axetat của lá cây núc nác oroxylum indicum l. họ chùm ớt (bignoniaceae)

học: Oroxylum indicum L., thuộc chi Oroxylum, họ chùm ớt (Bignoniaceae). Tên thông thường: so đo thuyền, lin may, mộc hồ điệp, ngọc hồ điệp, ung ca (Lào-Vientian), k’nốc (Buôn Mê Thuột), vấn cố chỉ, bạch ngọc chỉ, nam hoàng bá, hoàng bá nam, thiêu tầng chỉ, bạch ngọc nhi, thiên trương chỉ (Vân Nam), triểu gian (Quảng Tây). Phân bố: Núc nác mọc hoang và được trồng ở khắp nước ta. Ngoài ra, còn mọc ở Trung Quốc (Phúc Kiến), Quảng Tây, Vân Nam, Quý Châu, Tứ Xuyên, Hải Nam, Quảng Đông), Malaysia, Ấn Độ, Lào, Campuchia. Mô tả cây: Cây cao 7-12m, có thể cao tới 20-25m, thân nhẵn, ít phân nhánh, vỏ cây màu tro xám nhưng khi bẻ có màu vàng nhạt. Hình 1: Cây núc nác. Trang 4 Lá to 2-3 lần kép lông chim. Lá chét hình bầu dục, nguyên, đầu nhọn, dài 7,5 – 15 cm, rộng 5 – 6,5 cm. Hình 2: Lá núc nác. Hoa màu đỏ tím, to mẫm, mọc thành chùm ở đầu cành, dài tới 10cm, 5 nhị trong đó có 1 nhị nhỏ hơn. Quả nang to, dài tới 50-80cm, rộng 5-7cm, trong chứa hạt, bao quanh có một màng mỏng, nóng và trong, hình chữ nhật. Hình 3: Quả núc nác. Thu hái [1] Muốn thu hoạch hạt, đợi tới cuối thu sang đông, hái lấy quả chín, phơi khô, mổ lấy hạt rồi lại phơi khô. Vỏ núc nác có thể thu hoạch gần như quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân hạ. Thường đẽo vỏ trên cây còn sống, ít nơi hạ cây. Vỏ núc nác lấy về dùng tươi hay phơi khô. Không phải chế biến gì khác. Trang 5 Vỏ núc nác màu nâu nhạt, trên có rất nhiều sẹo của cuống lá cũ, và rất nhiều những đám nhỏ nổi lên, mặt trong khi còn tươi có màu vàng nhạt, không mùi, vị đắng, hơi hắc. Hạt núc nác hình bầu dục, rất mỏng, dẹt ba phía, vỏ ngoài phát triển thành màng rất mỏng, trong trông như cánh bướm, màu trắng nâu nhạt, có những đường gân từ hạt tỏa ra. Chiều dài cả hạt và cánh từ 4-7cm, rộng 2,5-4cm. Nếu chỉ kể hạt không thì chỉ dài 1,5-2,5cm, rộng 1-2cm. Khi bóc màng ngoài thấy rễ phôi và lá mầm rất rõ, mỏng như cánh bướm, dòn, không mùi, vị hơi đắng. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH: Hạt dùng chữa ho lâu ngày, ho gà, viêm họng, viêm phế quản, đau gan, đau dạ dày [15,21]. Vỏ núc nác có tác dụng rõ rệt chống dị ứng [5,10,11]. Núc nác tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân bất lợi từ bên ngoài vào cơ thể. Độc tính của vỏ núc nác rất thấp: LD50 của vỏ cây đối với chuột nhắt trắng là 23ml dịch chiết vỏ núc nác trên 1kg thể trọng [1]. Vỏ núc nác chữa đi ngoài, đi lỵ, thuốc bổ chất, chữa dị ứng bệnh ngoài da, còn dùng để nhuộm màu vàng. Vỏ cây có tác dụng chống chất độc trong tôm biển với giá trị LC50 là 10,0μg/ml và 36,0μg/ml, có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) với giá trị MIC tương ứng 4,0mg/ml và 8,0mg/ml [7]. Vỏ và rễ cây có tác dụng chống ung thư [9,14], chống vi trùng, chống viêm, chống oxi hóa [9,15]. Các flavovoid trong vỏ cây và hạt có tác dụng chữa nhiều bệnh như đau dạ dày, tiêu chảy, kiết lỵ, chảy mồ hôi, cầm máu, hạ sốt, thấp khớp, kháng viêm, chống co thắt.[5,7,8,10,11,12]. Trong y học Ấn Độ, lá núc nác được sử dụng để phòng các rối loạn gan. Các dịch trích khác nhau của Oroxylum indicum L. đều có hoạt tính chống độc gan [17] Ở nước ta, Viện Dược liệu thuộc bộ y tế Việt Nam có đưa ra dạng chế phẩm “nunaxin” viên 0,25g từ hỗn hợp các flavonoid (cao núc nác). Nghiên cứu cho thấy[21]: Trang 6 • Chế phẩm có tác dụng chống choáng phản vệ trên thỏ và trên chuột lang nếu được uống trong vòng 7 ngày liền. • Chống viêm dị ứng trên thỏ và trên chuột cống trắng. • Không có biểu hiện độc tính. Viện dược liệu đề nghị dùng chế phẩm “nunaxin” trong các bệnh mề đay sơ phát và mạn tính, vảy nến, hen phế quản trẻ em thể nhẹ và trung bình. Không chỉ định cho các trường hợp dị ứng nặng và cấp diễn [21]. Một số bài thuốc dân gian [21]: Ngoài da lở ngứa, bệnh tổ đĩa ngứa giữa lòng bàn tay, bệnh giang mai lở loét: vỏ núc nác, khúc khắc mỗi vị 30g sắc uống hàng ngày. Chữa đau dạ dày: dùng vỏ núc nác, sấy khô tán thành bột mịn. Ngày uống 3 lần, mỗi lần 2-3g. Chữa kiết lỵ, đau dạ dày ợ hơi, ợ chua: dùng hạt Núc nác phơi khô tán thành bột mịn hoặc sắc uống mỗi ngày 8-10g. Chữa viêm phế quản, ho lâu ngày: Mộc hồ điệp 10g, đường phèn hay kẹo mạch nha 30g, nước 300ml, sắc còn 200ml. Chia 3 lần uống trong ngày. Chữa viêm đường tiết niệu, đái buốt ra máu: Vỏ núc nác, rễ cỏ tranh, mã đề mỗi thứ một nắm, sắc nước uống. Chữa ho lâu ngày: 5-10g hạt núc nác, sắc nước hoặc tán bột uống. Chữa lở do dị ứng sơn: Vỏ núc nác nấu cao, dùng uống và bôi vào chỗ lở. Chữa viêm khí quản cấp tính, ho gà: dùng mộc hồ điệp 4g, an nam tử 12g, cát cánh 6g, cam thảo 4g, tang bạch bì 12g, khoản đông hoa 12g. Sắc lấy nước, thêm 60g đường phèn vào hòa tan, chia uống nhiều lần trong ngày. Chữa sỏi thận, sỏi bàng quang: dùng vỏ núc nác 16g, chi tử (quả dành dành) 20g, mã đề thảo 20g, xương bồ 8g, mộc thông 12g, tỷ giải 30g, quế chi 4g, cam thảo đất 20g; sắc nước, chia 2 lần uống trong ngày vào lúc đói bụng. 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC : Nghiên cứu thành phần hóa học trên cây Oroxylum indicum L. cho thấy vỏ và hạt chứa ancaloit, tanin và một số dẫn xuất flavonoid ở dạng tự do hay heterozit và chất đắng kết tinh là oroxylin. Vỏ chứa tetuin (1), hạt cũng chứa oroxylin và một chất dầu béo chứa 80.40% acid oleic, acid palmitic, acid stearic và acid lignoceric [1]. Trang 7 OOH OHO OO HO HO HO OH Tetuin (1)  Năm 2003, Li-Juan Chen cùng cộng sự [10] đã cô lập từ hạt cây Oroxylum indicum L. được 5 hợp chất flavonoid với độ tinh khiết tương ứng là: Chrysin 98% (2), baicalein 95% (3), baicalein-7-O-diglucoside (Oroxylin B) 90% (4), baicalein-7- O-glucoside 96% (5), chrysin-7-O-diglucoside 85% (6).  Năm 2005, L.J Chen cùng cộng sự [11] cô lập được 4 chất với độ tinh khiết cao hơn: chrysin 98%, baicalein 98%, baicalein-7-O-diglucoside 92%, baicalein-7-O- glucoside 95%. OHO OOH Chrysin (2) OHO OOH HO Baicalein (3) O HO OH O O Baicalein-7-O-diglucoside (4) O HO HO OH OH O HO HO OH O Trang 8 OOH HO OO O OH OH HO HO Baicalein-7-O-glucoside (5) OO OOH OHO OH O OHO OH OH HO HO Chrysin-7-O-diglucoside (6)  Năm 2007, Biswanah Dinda, Bikas Chandra Mohanta, Shio Arima, Nariko Sato và Yoshihiro Harigaya [6] đã cô lập từ vỏ cây các hợp chất: 6-hydroxyluteolin (7) 6-methoxyluteolin (8) 8,8′-bisbaicalein (9) Baicalein-7-O-caffeate (10) OOH HO O OH OH HO 6-hydroxyluteolin (7) OOH HO O OH OH H3CO 6-methoxyluteolin (8) Trang 9 O OH OH OHO OOH HO HO O 8,8′-bisbaicalein (9) OOH HO O HO HO O O Baicalein-7-O-caffeate (10)  Năm 2007 Lê Thị Anh Đào, Lê Thị Thu Hương, Trần Thị Linh Hà [2] cô lập được 3 hợp chất: β-sitosterol (11). Oroxylin A (5,7-dihydroxy-6-metoxyflavone) (12). Isokaemferide (13). HO CH3 CH3 H3C β-sitosterol (11). Trang 10 OHO OOH Oroxylin A (12) MeO O OH HO OH O OMe isokaemferide (13)  Năm 2008, Maitreyi Zaveri cùng cộng sự [12] nghiên cứu và cô lập được trong vỏ rễ có chứa các hợp chất alkaloid, flavonoid, tannin và anthraquinone. Dựa trên kết quả nghiên cứu sắc ký bảng mỏng, bốn hợp chất có hoạt tính sinh học được đề nghị gồm: Chrysin (2), Baicalein (3), Ellagic acid (14), Biochanin-A (15). O O OH OH HO HO O O OCH3 HO OH Ellagic acid (14) Biochanin-A (15) O O  Năm 2010 Hom Nath Luitel cùng cộng sự [7] nghiên cứu thành phần của thân cây núc nác cô lập được 3 flavone: baicalein (3), oroxylin A (12), pinostrobin (16) và 1 sterol: Stigmast-7-en-3-ol (17). OOH O Me O Pinostrobin (16) Trang 11 HO Stigmast-7-en-3-ol (17).  Năm 2010, Saowanee Maungjunburee, Wilawan Mahabusarakam[16] đã cô lập được nhiều hợp chất flavonoid từ vỏ thân: 5,7-dihydroxy-3-methoxyflavone (18) 3,5,7-trihydroxyflavone (19) 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavone (20) 5,7,4’-trihydroxyflavone (21) OHO OH O OMe 5,7-dihydroxy-3-methoxyf lavone (18) OHO OH O OH 3,5,7-trihydroxyf lavone (19) Trang 12 OHO OH O OHO OH O OH OHOH 3,5,7,4'-tetrahydroxyf lavone (20) 5,7,4'-trihydroxyf lavone (21)  Năm 2010, T.Hari Babu cùng cộng sự [18] tiến hành nghiên cứu trên thân cây Oroxylum indicum L. đã cô lập được các chất sau: Dihydro oroxylin A-7-O-methylglucuronide (22). 5-hydroxy-7,2’-dimethoxy-6’-O-α-L-glucopyranosylflavone (23). Dihydroiso-α-lapachone (24) 7-O-methylchrysin (25) 5-hydroxy-4’,7-dimethoxyflavone (26) Dihydro oroxylin A (27). O OOH O MeO O OH HO HO MeOOC Dihydro oroxylin A-7-O-methylglucuronide (22). O MeO O MeO OH O O OH OH OH HO 5-hydroxy-7,2’-dimethoxy-6’-O-α-L-glucopyranosylflavone (23). Trang 13 O O O Dihydroiso-α-lapachone (24) OMeO OH O 7-O-methylchrysin (25) OMeO OH O OMe 5-hydroxy-4',7-dimethoxyf lavone (26) OHO MeO OH O Dihydro oroxylin A (27)  Năm 2011, Ren-yi Yan cùng các cộng sự [15] tiến hành nghiên cứu trên hạt cây Oroxylum indicum cô lập được 22 hợp chất trong đó có 3 hợp chất mới: Chrysin 6-C-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucuronopyranoside (28). Bacalein 7-O-β-D-glucuronopyranosyl-(13)[β-D-glucopyranosyl -(16)]-β-D-glucopyranoside (29). Scutellarein 7-O-β-D-glucopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranoside (30). Scutellarein-7-O-glucopyranoside (31). Chrysin-7-O-glucuronide (32). Baicalin (33). Chrysin-6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside (34). Pinocembrin (35). Pinobanksin (36). 2-Methyl-6-phenyl-4H-pyran-4-one (37). Lupeol (38). 2α-hydroxyllupeol (39). Echinulin (40). Adenosine (41). Trang 14 Dimethyl sulfone (42). O HO HO O OH O O HOOC OH O HO HO HO OH Chrysin 6-C-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucuronopyranoside (28). O HO HO OH HO OH O O O OH O O HO HO HOOC OH O HO O OH Baicalein 7-O-β-D-glucuronopyranosyl-(13)[β-D-glucopyranosyl- (16)]-β-D-glucopyranoside (29) O HO HO OH HO OH O O O OH OH O O HO HO OH Scutellarein-7-O-β-D-glucopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranoside (30) O HO OH O O OH O HO HO OH OH Scutellarein-7-O-glucopyranoside (31) Trang 15 O OH O O Chrysin-7-O-glucuronide (32) O HO HO OH HOOC O HO OH O O O HO HO OH HOOC Baicalin (33). O OOH HO O HO HO HO OH O HO OH OH Chrysin-6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside (34) OHO OOH Pinocembrin (35) OHO OOH Pinobanksin (36) OH Trang 16 O O 2-methyl-6-phenyl-4H-pyran-4-one (37) Me lupeol (38) HO HO HO 2α-hydroxyllupeol (39) N N N O O echinulin (40) Adenosine (41) S O O H3C CH3 dimethyl sulfone (42) O N NH2 N OH OH HO N N Trang 17 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ: 2.1.1. NGUYÊN LIỆU: Mẫu lá cây núc nác thu hái ở Yên Sơn – Tuyên Quang vào tháng 5 năm 2010. 2.1.2. HÓA CHẤT: • Dung môi: etyl axetat, clorofom, metanol. • Silica gel: Silica gel 60, 0.04 – 0.063 mm, Merck dùng cho sắc kí cột. • Sắc kí bảng mỏng loại DC – Alufolien 20 x 20, Kiesel gel 60F254, Merck. • Thuốc thử hiện hình sắc kí bảng mỏng: H2SO4 đặc. 2.1.3. THIẾT BỊ: • Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. • Cột sắc kí. • Máy cô quay chân không Heidolph, máy sấy. • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500, tần số cộng hưởng 500MHz. • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500, tần số cộng hưởng 125MHz. • Tất cả phổ được ghi tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hóa Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, 18 - Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. ĐIỀU CHẾ CAO THÔ: Lá cây núc nác được phơi khô, sấy và nghiền nhỏ thành bột mịn (2,8 kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với etanol 96% bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ thường, lọc và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao etanol thô. Cao thô được hòa tan một lượng tối thiểu etanol, tiếp theo cho vào một lượng nước lớn, sau đó chiết lỏng-lỏng với các dung môi hữu cơ với độ phân cực tăng dần: ete dầu, etyl axetat, metanol thu được các cao tương ứng. (xem sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các cao phân đoạn.) Trang 18 Thu được các cao phân đoạn sau: Bảng 1: Các cao phân đoạn Cao phân đoạn Khối lượng (gam) Dung môi giải ly Sắc kí bảng mỏng Ghi chú Cao ete dầu 35 ED:EA (10:1) Nhiều vết, không tách rõ Chưa khảo sát Cao etyl axetat 87 C Nhiều vết, tách rõ tròn Khảo sát Cao metanol 5 C:M (25:1) Vết dài Chưa khảo sát Ghi chú: ED (ete dầu); EA (etyl axetat). C (clorofom); M (metanol). 2.3. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO ETYL AXETAT: Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 87g của cao etyl axetat , giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 250ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hũ bi. Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 12 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 2. Bảng 2: Sắc ký cột silica gel trên cao etyl axetat. Phân đoạn Khối lượng (gam) Dung môi giải ly Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.1 2,12 ED:EA (50:1) Nhiều vết, vết dài Chưa khảo sát EA.2 1,27 C Một vết tròn, rõ, có nhiều vết dơ Khảo sát thu được OI-1 EA.3 6,11 C:M (100:1) Nhiều vết Chưa khảo sát Trang 19 EA.4 2.64 C:M (50:1) Hai vết tròn, một vết giống EA.2 kèm theo nhiều vết dơ Khảo sát thu được OI-2 EA.5 4,35 C:M (25:1) Nhiều vết, vết kéo dài Chưa khảo sát EA.6 8,29 C:M (15:1) Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát EA.7 2,30 C:M (10:1) Một vết tròn, rõ có đuôi dơ Chưa khảo sát EA.8 1,25 C:M (10:1) Một vết chính rõ, tròn, nhiều vết dơ Chưa khảo sát EA.9 12,24 C:M (9:1) Nhiều vết Chưa khảo sát EA.10 8,56 C:M (4:1) Nhiều vết Chưa khảo sát EA.11 4,50 C:M (1:1) Nhiều vết Chưa khảo sát EA.12 10,04 C:M (1:1) Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát 2.3.1 SẮC KÍ CỘT CHO PHÂN ĐOẠN EA.2: Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.2 (1,27g) trong bảng 2, giải ly bằng hỗn hợp dung môi C:M (50:1). Kết quả được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 3. Bảng 3: Sắc kí cột trên phân đoạn EA.2 Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.2.1 C : M (50:1) 0,15 Vết mờ Chưa khảo sát EA.2.2 C : M 0,90 Vết màu vàng Khảo sát Trang 20 (50:1) cam, còn vết dơ mờ EA.2.3 C : M (50:1) 0,09 Vết mờ Chưa khảo sát  Sắc kí cột cho phân đoạn EA.2.2: Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.2.2 (0,90g) trong bảng 3, giải ly bằng hỗn hợp dung môi C:M (50:1). Kết quả được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 4. Bảng 4: Sắc kí cột trên phân đoạn EA.2.2 Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.2.2.1 C : M (50:1) 0,06 Vết mờ Chưa khảo sát EA.2.2.2 C : M (50:1) 0,40 Vết màu vàng cam, tròn, rõ, còn vết dơ rất mờ Khảo sát EA.2.2.3 C : M (50:1) 0,09 Vết mờ Chưa khảo sát Phần cao thu được từ phân đoạn EA 2.2.2 của bảng 4 được rửa nhiều lần bằng clorofom. Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel, giải ly nhiều lần bằng hệ dung môi C:M (50:1). Kết quả thu được tinh thể màu vàng nhạt (30mg). Kiểm tra bằng sắc kí bảng mỏng với hệ dung môi C : M (100:1) cho một vết rõ, tròn, màu vàng, Rf = 0,54. Hợp chất này được kí hiệu là OI-1. 2.3.2. SẮC KÌ CỘT CHO PHÂN ĐOẠN EA.4: Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.4 (2,64g) trong bảng 2, giải ly bằng hỗn hợp dung môi C:M (50:1). Kết quả được 4 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 5. Bảng 5: Sắc kí cột trên phân đoạn EA.4 Trang 21 Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.4.1 C : M (50:1) 1,00 Vết mờ Chưa khảo sát EA.4.2 C : M (50:1) 1,20 Vết màu vàng cam, còn vết dơ Khảo sát EA.4.3 C : M (50:1) 0,08 Vết mờ Chưa khảo sát EA.4.4 C:M (50:1) 0,05 Vết mờ Chưa khảo sát Sắc kí cột cho phân đoạn EA.4.2: Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.4.2 (1,20g) trong bảng 5, giải ly bằng hỗn hợp dung môi C:M (25:1). Kết quả được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 6. Bảng 6: Sắc ký cột trên phân đoạn EA.4.2 Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú EA.4.2.1 C:M (25:1) 0,09 Vết mờ Chưa khảo sát EA.4.2.2 C:M (25:1) 0,80 Vết màu vàng, rõ, tròn. Khảo sát EA.4.2.3 C:M (25:1) 0,09 Vết mờ Chưa khảo sát Phần cao thu được từ phân đoạn EA.4.2.2 của bảng 6 được rửa nhiều lần bằng clorofom. Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi C:M (25:1). Kết quả thu được tinh thể máu vàng nhạt (40mg). Kiểm tra bằng sắc kí bảng mỏng với hệ dung môi C : M (50:1) cho một vết rõ, tròn, màu vàng, Rf = 0,40. Hợp chất này được kí hiệu là OI-2. Trang 22 Trang 23 Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các cao phân đoạn Cặn metanol (5g) Chiết lỏng lỏng Mẫu tươi Sấy khô ở 50oC, nghiền nhỏ Bột khô Ngâm chiết bằng etanol 960. Lọc. Dịch chiết Cất cô quay Cao tổng (134g) Cặn chiết ete dầu hỏa (35g) Cặn chiết etyl axetat (87g) Cặn còn lại Tách chất Xác định cấu trúc Trang 24 Sơ đồ 2: Sơ đồ cô lập OI-1 từ phân đoạn EA.2 Sắc kí cột silica gel. Giải ly C:M. Sắc kí cột silica gel. Giải ly C:M. Phân đoạn EA.2.2.1 0,06g Phân đoạn EA.2.2.2 0,4g Phân đoạn EA.2.2.3 0,09g Rửa nhiều lần bằng clorofom. Sắc ký cột silica gel. Giải ly C:M Phân đoạn EA.2 1,27g OI-1 30mg Phân đoạn EA.2.1 0,15g Phân đoạn EA.2.2 0,90g Phân đoạn EA.2.3 0,09g Sơ đồ 3: Sơ đồ cô lập OI-2 từ phân đoạn EA.4 Sắc kí cột silica gel. Giải ly C:M. Sắc kí cột silica gel. Giải ly C:M. Phân đoạn EA.4.2.1 0,09g Phân đoạn EA.4.2.2 0,8g Phân đoạn EA.4.2.3 0,09g Rửa nhiều lần bằng clorofom. Sắc ký cột silica gel. Giải ly C:M Phân đoạn EA.4 2,64g OI-2 40mg Phân đoạn EA.4.1 1,00g Phân đoạn EA.4.2 1,20g Phân đoạn EA.4.4 0,05g Phân đoạn EA.4.3 0,08g CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT OI-1: Hợp chất OI-1 (30mg) thu được từ phân đoạn EA.2 của lá cây Oroxylum indicum L. có tinh thể màu vàng nhạt. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 Hz), δ (ppm), J (Hz) (phụ lục 1): 4,05 (3H, s); 6,62 (1H, s, H8); 6,64 (1H, s); 6,66 (1H, s, H3); 7,51-7,55 (3H, m, H3′, H4′, H5′); 7,87-7,89 (2H, m, H2′, H6′); 12,99 (1H, s). Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δ (ppm) (phụ lục 2): 93,5 (C8), 105,3 (C3), 105,9 (C10), 126,3 (C2′; C6′); 129,1 (C3′, C5′); 130,4 (C6); 131,3 (C1′); 131,9 (C4′); 152,1 (C5); 153,3 (C9); 155,2 (C7); 164,1 (C2); 183,0 (C4). Phổ DEPT, HSQC, HMBC (phụ lục 3,4,5). BIỆN LUẬN CẤU TRÚC: Phổ 1H-NMR (500 MHz): xuất hiện tín hiệu của 3 proton nhóm methoxy δH [4,05 (3H, s)], 2 tín hiệu multiplet có δH [7,54 (3H, m)]; δH [7,88 (2H, m)], 4 tín hiệu singlet. (Phụ lục 1.2) Phổ 13C-NMR (125 MHz) kết hợp với phổ DEPT cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 16 carbon gồm 1 carbon loại CH3 δC 60,9; 7 carbon loại CH δC [93,5; 105,23; 126,3; 129,1; 131,9], trong đó có 2 tín hiệu cao gấp đôi so với các tín hiệu còn lại, 8 carbon tứ cấp δC [105,9; 130,4; 131,3; 152,1; 153,3; 155,2; 164,1; 183,0] trong đó δC 183,0 đặc trưng của nhóm >C=O. Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC cho phép dự đoán OI-1 là một flavonoid có khung flavon. O O A B 3 2 5' 1 6' 1' 2' 3' 4' 8 7 6 5 10 4 9 Carbon của nhóm >C=O có δC 183,0 là C4. Hai tín hiệu dạng multiplet ở vùng thơm có độ dịch chuyển hóa học tại 7.54 và 7.88 ppm với cường độ lần lượt 3H và 2H được quy kết cho các proton H3',4',5' và H2',6' trên vòng B không mang nhóm thế. Phổ HSQC cho thấy H2′, H6′ (δH 7,88) tương quan với carbon CH (δC 126,3) là C2′, C6′. H3′, H5′ (δH 7,54) tương quan với carbon CH (δC 129,1) là C3′, C5′. H4′ tương quan với carbon CH (δC 131,9) là C4′. (Phụ lục 4.2) Phổ HMBC cho thấy H3′, H4′, H5′ tương quan với carbon δC [126,3 (C2′, C6′); 129,1 (C3′, C5′); 131,9 (C4′); 131,3] vậy δC 131,3 là C1′. H2′, H6′ tương quan với carbon δC [131,3 (C1′) ; 131,9 (C4′); 164,1] vậy δC 164,1 là của carbon C2. Từ phổ HMBC thấy proton có δH 6,66 tương quan với carbon δC [131,3 (C1′); 105,9; 164,1 (C2); 183,0 (C4)], kết hợp phổ HSQC proton có δH 6,66 tương quan với carbon tại δC 105,3 vậy proton có δH 6,66 là H3, δC 105,3 là C3 và δC 105,9 là C10. Proton có δH [12,99 (1H, s)] là hydrogen nội phân tử tạo ra giữa nhóm –OH tại C5 với nhóm >C=O tại C4. Ở phổ HMBC proton có δH 12,99 có tương quan với carbon tại δC [105,9 (C10); 130,4; 152,1]. Mặt khác proton của nhóm methoxy tương quan với carbon δC 130,4 nên carbon có δC 152,1 là C5, δC 130,4 là C6. (Phụ lục 5.2) Từ phổ HMBC thấy proton có δH 6,62 tương quan với carbon tại δC [105,9 (C10); 130,4 (C6); 153,3; 155,2], không có tương quan với C5 (152,1) kết hợp với phổ HSQC thấy proton δH 6,62 tương quan với carbon δC 93,5 nên proton tại δH 6,62 là H8 và carbon δC 93,5 là C8. Trên phổ HMBC proton có δH 6,64 tương quan với carbon tại δc [93,5 (C8); 130,4 (C6); 155,2], trên phổ HSQC không có tương quan giữa proton tại δH 6,64 và carbon nào hết nên proton này nối với oxy và liên kết với C7 có δC 155,2. Vậy δC 153,3 là của C9. Từ các phân tích nêu trên và kết hợp với tài liệu tham khảo xác định OI-1 là oroxylin A. OO OO H 1 2 3410 5 7 9 1' 4'H H H H H H 2' 3' 5' 6' H H O 8 6 H H H Tương quan giữa proton với carbon trong phổ HMBC OHO OOH 1 2 3410 5 7 9 1' 4'2' 3' 5' 6' 8 H3CO 6 Oroxylin A Bảng 7: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất OI-1 Vị trí Hợp chất OI-1 (CDCl3) Loại carbon δH (ppm) (J=Hz) δC (ppm) 2 =C< 164,1 3 =C< 6,66, 1H, s 105,3 4 =CO 183 5 =C< 152,1 6 =C< 130,4 7 =C< 155,2 8 =CH- 6,62, 1H, s 93,5 9 =C< 153,3 10 =C< 105,9 1′ =C< 131,3 2′ =CH- 7,88, m 126,3 3′ =CH- 7,54, m 129,1 4′ =CH- 7,54, m 131,9 5′ =CH- 7,54, m 129,1 6′ =CH- 7,88, m 126,3 6-OCH3 CH3 4,05, 3H, s 60,9 5-OH 12,99, 1H, s 7-OH 6,64, 1H, s 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT OI-2: Hợp chất OI-2 (40mg) thu được từ phân đoạn EA.4 của lá cây Oroxylum indicum L. có tinh thể màu vàng nhạt. Phổ 1H-NMR (CDCl3-MeOD, 500 Hz), δ (ppm), J (Hz) (phụ lục 6): 6,30 (1H, d, J= 2 Hz, H6); 6,48 (1H, d, J= 2 Hz, H8); 6,66 (1H, s, H3); 7,51-7,56 (3H, m, H3′, H4′, H5′); 7,89-7,92 (2H, m, H2′, H6′). Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δ (ppm) (phụ lục 7): 94,2 (C8); 99,2 (C6); 104,5 (C10); 105,1 (C3); 126,1 (C2′, C6′); 128,8 (C3′,C5′); 131,0 (C1′); 131,6 (C4′); 157,9 (C9); 161,5 (C5); 164,0 (C2); 164,2 (C7); 182,4 (C4). Phổ DEPT, HSQC, HMBC (phụ lục 8,9,10). BIỆN LUẬN CẤU TRÚC: Phổ 1H-NMR (500 MHz): xuất hiện 2 tín hiệu doublet có δH [6,30 (1H, d, J= 2 Hz); 6,48 (1H, d, J= 2 Hz)] do đó 2 proton này ở vị trí meta với nhau trên vòng benzene, 2 tín hiệu multiplet có δH [7,54 (3H, m)]; δH [7,91 (2H, m)], 1 tín hiệu singlet có δH 6,66 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125 MHz) kết hợp với phổ DEPT cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 15 carbon gồm 8 carbon loại CH δC (94,2; 99,2; 105,1; 126,1; 128,8; 131,6), trong đó có 2 tín hiệu cao gấp đôi so với các tín hiệu còn lại, 7 carbon tứ cấp δC (104,5; 131,0; 157,9; 161,5; 164,1; 164,2; 182,4). Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC cho phép dự đoán OI-2 là một flavonoid có khung flavon. Tại carbon có δC 182,4 là C4. Ở vùng trường yếu, xuất hiện 2 tín hiệu có δH 7,54 (3H, m) và δH 7,91 (2H, m), được quy kết cho các proton H-3',4',5' và H-2',6' trên vòng B không mang nhóm thế. (Phụ lục 6.2). Phổ HSQC cho thấy H2′, H6′ (δH 7,91) tương quan với carbon CH tại δC 126,1 nên đây là C2′, C6′. H3′, H5′ (δH 7,54) tương quan với carbon CH tại δC 128,8 là C3′, C5′. H4′ tương quan với carbon CH tại δC 131,6 là C4′. Phổ HMBC cho thấy H3′, H4′, H5′ cho thấy tương quan với carbon có δC [126,1 (C2′, C6′); 128,8 (C3′, C5′); 131,64 (C4′); 131,0] vậy δC 131,0 là C1′. H2′, H6′ tương quan với carbon có δC [131,0 (C1′); 131,6 (C4′); 164,0] vậy δC 164,0 là của C2. Từ phổ 1H-NMR thấy có một tín hiệu singlet tại δH 6,66 (1H, s) là của proton H3. Trên phổ HSQC thấy H3 (δH 6,66) tương quan với carbon δC [104,5; 131,0 (C1′); 182,4 (C4); 164,0 (C2)] đồng thời thấy 2 proton ở vị trí meta với nhau δH (6,30; 6,48) cũng tương quan với carbon có δC 104,5 vậy đây là C10. Vì 3 proton này cùng tương quan với C10 nên 2 proton ở vị trí meta với nhau δH (6,30; 6,48) là của H6 và H8, 2 nhóm thế ở vị trí 5 và 7 trên vòng benzene A. Do H6 chịu ảnh hưởng đẩy electron mạnh hơn H8 nên H6 sẽ cộng hưởng ở vùng trường mạnh hơn H8, vì vậy δH 6,30 là của H6, còn δH 6,48 chính là H8. Trên phổ HMBC, proton H6 và H8