Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate lá ô môi cassia grandis l. họ vang (caesalpiniaceae)

so sánh ngang với Canh-ki-na. Chính thứ cơm màu nâu đen đặc sền sệt chứa trong quả Ô môi này được người dân ta ngâm rượu làm thuốc bổ uống. Rượu Ô môi có màu đỏ đẹp như màu rượu Canh-ki-na và cũng có tác dụng như rượu canh-ki-na, nên Ô môi còn được gọi là “Canh-ki-na Việt Nam”. Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học về loài này chưa được nghiên cứu nhiều ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học lá Ô môi Cassia grandis L. họ Vang (Caesalpiniaceae)” làm cơ sở khoa học ban đầu cho những nghiên cứu tiếp theo, nhằm sớm đưa cây Ô môi thành một vị thuốc có giá trị và đóng góp thêm những hiểu biết về thành phần Hóa-thực vật của loài Cassia grandis L. mọc tại Đồng sông Cửu Long, qua đó nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này. Mục tiêu của đề tài - Phân lập các chất tinh khiết từ lá cây ô môi. - Xác định cấu trúc các chất đã phân lập được. Chương 1 TỔNG QUAN ---------- 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT 1.1.1 Đặc điểm cây Ô môi Tên khoa học: Cassia grandis L.1,5 Tên Việt Nam: cây Cốt khí, cây quả Canh-ki-na Việt Nam, Bò cạp đỏ.1,5 Tên nước ngoài: Anh (coral shower, apple blossom cassia, pink shower, liquorice tree, horse cassia, Cathartocarpus grandis (L.f.) Pers. 1805, Cassia brasiliana Lamk. 1785, Cathartocarpus brasiliana (Lamk.) Jacq. 1809); Pháp (bâton casse, casse du Brésil); Lào (brai xiêm, Sino-Tibetan, may khoum); Malaysia (kotek mamak); Tây Ban Nha (sandal, carao, carámano, cañafistula, cañadonga); Thái (kanpaphruek (Bangkok)), Campuchia (Sac phlê, krêête, rich chopeu).1,5,15 Họ: Vang (Caesalpiniaceae).1,5 1.1.1.1 Mô tả cây Ô môi 1,5 Cây to cao 7 đến 15 m. Vỏ thân nhẵn, cành mọc ngang, cành non có lông màu rỉ sắt, cành già màu nâu đen (Hình 1). Hình 1 Cây Ô môi Lá có kích thước lớn, kép lông chim, màu xanh bóng, gân rõ,gồm 5-16 đôi lá chét hình hơi quả trám, dài 7-12 cm, rộng 4-8 cm có phủ lông mịn (Hình 2). Hình 2 Lá Ô môi Cụm hoa mọc thành chùm thưa, thõng, dài 20-40 cm. Cụm hoa nở rộ khi lá rụng,màu hồng tươi (Hình 3). Hình 3 Hoa Ô môi Quả hình trụ cứng, cong lưỡi liềm, màu nâu đen nhạt, dài 20-60 cm, rộng 2-3 cm, cuống ngắn không mở, đầu có mỏm nhọn, nhỏ (Hình 4). Quả được phân chia thành 50-60 ngăn nhỏ phân cách nhau bởi những lớp màng mỏng, màu trắng nhạt, trong chứa một thứ cơm mềm, đặc sền sệt, màu nâu đỏ hay nâu đen, vị ngọt, lúc tươi có vị hơi chua, khi khô có màu sẫm. Trong mỗi ngăn có chứa một hạt dẹp cứng màu nâu lợt. Khi chín khô long ra, lúc lắc quả có tiếng kêu đặc biệt. Mùa hoa quả vào tháng 5-10. Hình 4 Trái Ô Môi 1.1.1.2 Phân bố, thu hái và chế biến1,5: Cây có nguồn gốc từ các nước Nam châu Mỹ, được gây trồng làm cây bóng mát cho hoa đẹp ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, cây trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam. Cây làm cảnh vì hoa đẹp, gây trồng bằng hạt, ươm gieo hạt vào đầu mùa mưa (sau khi rửa hết sạch cơm ở hạt). Đất bầu vườn ươm cần tơi xốp, đủ phân và tưới nước. Cây con chịu bóng một phần. Sau 1 năm đem trồng nơi cố định. Gần đây, một số nơi ở miền Bắc thường hái quả chín về dùng với tên quả Canh-ki-na, vì thấy rượu ngâm quả này có màu đỏ như màu rượu Canh-ki-na và cũng có tác dụng như rượu Canh-ki-na. Mùa quả vào thu đông, hái về bỏ vỏ, bỏ nhân, chỉ lấy cùi ngâm rượu, trung bình một quả Ô môi có thể ngâm với một nửa lít rượu 25-30° trong 15-20 ngày là dùng được nhưng nếu càng để lâu thì càng tốt. 1.1.2 Tác dụng dược lý của cây Ô môi Những bài thuốc dân gian: Quả dùng sống chữa táo bón, với liều dùng 4-6 g (nhuận) hoặc 10-20 g (tẩy). Ngâm rượu uống làm thuốc tiêu, thuốc bổ giúp ăn ngon cơm, chữa đau lưng, đau người. Nếu nấu cơm và hạt (1 kg) với 1 lít nước rồi lọc và cô cách thủy đến thành cao thì dùng để làm thuốc chữa đau lưng, đau người, nhuận tràng, tẩy hoặc chữa lỵ, tiêu chảy với liều dùng 5-15 g. Lá tươi giã nát vắt lấy nước xát vào nơi hắc lào, có thể sắc uống chữa đau lưng, nhuận tràng. Ngày uống 15-20 g lá. Vỏ thân được dùng đắp lên nơi rắn cắn và bò cạp cắn. 1.2 NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY Ô MÔI 1.2.1 Thành phần hóa học chung của cây Ô môi 1,4 Trong cơm quả có đường, chất nhầy, tannin, saponin, calcium oxalate, anthraglucoside, sáp, tinh dầu và chất nhựa. Trong hạt có chứa chất béo. Trong lá có anthraglucoside, flavonoid. 1.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới Chi Cassia chứa nhiều nhóm chất anthraquinone, flavonoid, các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học trên chi Cassia đã được thực hiện từ rất lâu. Tuy nhiên những nghiên cứu trên loài Cassia grandis L.hiện rất ít. Năm 1981, Y.S.Srivastava và P.C.Gupta đã cô lập được flavonol glycoside mới, kaempferol-3-O-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-D-glucopyranoside (1) từ hạt của cây Cassia grandis L. (N.O.Leguminoseae).13 O O HO OH O O H H OH HOH H CH2OH H O O H H OH OH HH OH CH2OH H OH Năm 1984, V.K. Mahesh và Rashmi Sharma, R.S. Singh đã tách được chrysophanol (2), rhein (3), kaempferol (4) và physcion (5) từ Cassia grandis L.14 O O OHOH 1 345 8 9 10 11 12 13 14 O O O O OH O OH O Kaempferol-3-O-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-D-glucopyranoside (1) Chrysophanol (2) Rhein (3) O OH O OH HO OH O O O OHOH Năm 1984, V.K. Mahesh và Rashmi Sharma, R.S. Singh và , S.K. Upadhya phân lập được Rhein(6) từ lá Cassia grandis L., có nhiệt độ nóng chảy là 321-3220C.13 OH O O OH OH O Rhein (6) Năm 1993, Ibadur Rahman Siddiqui, Mithiles, Dipti Gupta và Jagdamba Singh đã phân lập được từ hạt Cassia grandis L. 4 anthraquinone mới là 1,2,4,8-tetrahydroxy-6-methoxy-3-methylanthraquinone-2-O-β-D-glucopyranoside (7), 1,3,4-hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methylanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (8) và 1,3-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (9) và 3 - hydroxy-6, 8-dimethoxy-2- methyl anthraquinone - 3 - O-β -D –glucopyranoside(10)9 Kaempferol (4) Physcion (5) OO OH O OH OH H3CO O H OH H OH H H HO H OH O O OH OH OCH3 H3CO O O H OH H OH H H HO H HO O O OHOCH3 H3CO O O H OH H OH H H HO H OH H3CO 1,2,4,8-Tetrahydroxy-6-methoxy-3-methylanthraquinone-2-O-β-D-glucopyranoside (7) 1,3-Dihydroxy-6,7,8-trimethoxyanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (9) 1,3,4-Hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methylanthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (8) OOO O O H OH H OHH H HO H O HO 3 - hydroxy-6, 8-dimethoxy-2- methyl anthraquinone - 3 - O-β -D –glucopyranoside (10) Năm 1994, R.P.Verma và K.S.Sinha đã phân lập được 1,3,4-trihydroxy-6,7,8- trimethoxy-2-methylantharaquinone (11) và 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone-3-O-ß-D-glucopyranoside(12)11 từ vỏ quả Cassia Grandis L. O O OHOCH3 H3CO OH H3CO OH O OO O O OH OH O H OH H OH H H HO H O HO 1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methyl anthraquinone-3-O-β-D-glucopyranoside (12) Năm 1995, E. Valencia, A. Madinaveitia, J. Bermejo, A. G. Conzalez và M. P. Gupta đã chiết suất được kokusaginine (6,7-dimethoxyfuroquinoline) (13) và alkaloid mới 1,1′-bipiperidine (14) từ những phần trên mặt đất của cây Cassia grandis L.8 1,3,4-Trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2-methylanthraquinone (11) N O MeO MeO OMe N N Năm 1996, A. G. Gonzalez, j. Bermejo, và E. Valencia đã cô lập được hợp chất mới trans-3-methoxy-4,5-methylene dioxycinamaldehyde (15), aloe emodin (16), centaureidin (17), (+)-catechin (18), myristicin (19), 2,4-dihydroxybenzaldehyde (20), 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde (21), 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde (22), và β-sitosterol (23).7 O O H3CO O H O O OH OH OH Kokusaginine (6,7-dimethoxyfuroquinoline) (13) 1,1′-Bipiperidine (14) Trans-3-methoxy-4,5-methylene dioxycinamaldehyde (15) Aloe emodin (16) OOH OCH3 OCH3 OOH H3CO HO O OH OH HO OH OH O O CH2 O CH3 HO H OOH O H3CO OCH3 OCH3 O H3CO OCH3 OCH3 Centaureidin (17) (+)-Catechin (18) Myristicin (19) 2,4-Dihydroxybenzaldehyde (20) 3,4,5-Trimethoxybenzaldehyde (21) 2,4,6-Trimethoxybenzaldehyde (22) HO H H H H Năm 1998, Meenarani, S. B Kalidhar đã phân lập được palmitic acid (21), β-sitosterol (24) và emodin (25).10 COOH O O 4 9 10 CH35 OH OH HO 8 11 12 13 14 Năm 2010 Pino J.A. đã phân lập được linalool (26)11 HO Linalool (26) β-Sitosterol (23) Palmitic acid (24) Emodin (25) 1.2.2 Các công trình nghiên cứu ở Việt Nam Có rất ít công trình trong nước nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học của Cassia grandis L.. Năm 2011 Đào Huy Phong 5 hợp chất đã phân lập được (-)-epicatechin (3,3’,4’,5,7- pentahydroxyflavan) (27), (-)-epiafzelechin (4’,5,7-trihydroxy flavanol ) (28), 2,3,6’-trihydroxy- 2’-methoxy-4’-hydroxymethylbenzophenone (29), quercitrin ( 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-α-L- rhamnopyranosylflavonol)(30), iso quercitrin (31)4 . O OH HH HO OH OH OH (-)-epicatechin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavan) (27) O OH HH HO OH (-)-epiafzelechin (4’,5,7-trihydroxy flavanol ) (28) O HO OH CH3 OH OH O 2,3,6’-trihydroxy-2’-methoxy-4’-hydroxymethylbenzophenone (29) OHO OH O OH OH O O HO OH CH3 OH OH quercitrin [ 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-α-L-rhamnopyranosylflavonol] (30) OHO OH O OH O OH O HO OH CH2OH OH iso quercitrin [ 3’,4’,5,7-tetrahydroxy-3-O-β-D-glucopyranosylflavonol] (31) Chương 2 THỰC NGHIỆM ---------- 2.1 HÓA CHẤT-THIẾT BỊ-PHƯƠNG PHÁP 2.1.1 Hoá chất Hạt silica gel cỡ hạt 0.04-0.063 mm dùng cho pha thường của Scharlau, silica gel pha đảo ODS (0.040-0.063 mm), sephadex LH-20, bảng nhôm tráng sẵn với silica gel 60 F254 (Merck) dùng cho pha thường và Rp18 F254S (Merck) cho pha đảo. Dung môi: n-Hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 96°, nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: dùng H2SO4/EtOH, FeCl3/EtOH. 2.1.2 Thiết bị Máy đo điểm chảy Büchi B545. Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance. Máy cô quay chân không Büchi-111. Máy sấy. Máy đánh siêu âm. Máy hút chân không. Đèn UV soi tử ngoại bước sóng 254-365 nm hiệu UVITEC. Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S. Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT. Dụng cụ thuỷ tinh: cột thủy tinh đường kính từ 2-5.5 cm, phễu lọc, bình sắc ký, ống nghiệm, ống đong, bình cô quay loại 100 mL, 500 mL, 1000 mL,. 2.1.3 Phương pháp tiến hành 2.1.3.1 Phương pháp cô lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp chiết xuất trong phòng thí nghiệm hóa học các hợp chất thiên nhiên để điều chế cao. Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp18, sắc ký lọc gel sephadex LH-20 kết hợp SKLM. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH hay FeCl3/EtOH. 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy phổ Agilent 6410 Triple Quad GC/MS của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.2.1 Thu hái nguyên liệu Mẫu thực vật được dùng trong nghiên cứu là lá Ô môi già được thu hái ở ấp Trường Lộc-xã An Mỹ-huyện Kế Sách-tỉnh Sóc Trăng. Thời gian thu hái: tháng 10/2010. Mẫu lá cây Ô môi được ThS. Nguyễn Thị Kim Huê, bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, đại học Cần Thơ giám định tên khoa học. 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy lại ở nhiệt độ thấp (khoảng 50°C), rồi xay thành bột mịn. Đây là nguyên liệu dùng trong nghiên cứu. Hình 5 Lá Ô môi khô 2.3 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO THÔ 2.3.1 Điều chế các cao thô Bột lá Ô môi (2.9 kg) được tận trích với ethanol 96° bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOH dạng sệt có khối lượng là 500 g. Hòa cao sệt với một lượng tối thiểu ethanol và tẩm với silica gel, đuổi khô dung môi trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 40°C cho đến khi thu được bột tơi. Trích pha rắn cao ethanol lần lượt với các dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol. Cô đuổi dung môi các dịch trích dưới áp suất kém thu được các cao tương ứng. Quá trình điều chế cao thô được tóm tắt theo Sơ đồ 1. Sơ đồ 1 Quy trình điều chế các cao thô từ lá Ô môi Trong luận văn này, chúng tôi chỉ khảo sát cao EtOAc. Thực hiện sắc ký cột cao EtOAc (330 g) trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexane:ethyl acetate với độ phân cực tăng dần (3.2%-100% EtOAc), 100% MeOH. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 9 phân đoạn, mã hóa thành CGA1-9. Quá trình thực hiện được tóm tắt trong Sơ đồ 2. - Hoà với lượng nhỏ EtOH, tẩm silica gel, cô đến bột tơi. - SKC silica gel với các dung môi:H, CHCl3, EtOAc, MeOH. - Cô quay dịch chiết. - Tận trích bằng EtOH 96°. - Lọc bỏ bã, cô giảm áp dịch chiết. Bột lá Ô môi (2.9 kg) Cao EtOH (1500 g) Cao H (130 g) Cao CHCl3 (51g) Cao EtOA (330 g) Cao MeOH (588 g) Sơ đồ 2 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao EtOAc Cao EtOAc (330 g) - Hoà với lượng nhỏ MeOH, tẩm silica gel, cô đến bột tơi khô. - SKC silica gel với hệ dung môi H:EtOAc (3.2%-100% EtOAc), 100% MeOH. - Cô cạn dịch trích. CGA8 (150 g) CGA7 (40 g) CGA6 (0.4 g) CGA4 (0.12 g) CGA5 (0.57 g) CGA3 (0.5 g) CGA2 (1.3 g) CGA1 (0.4 g) CGA9 (80 g) 2.3.2 Cô lập các chất từ cao CGA5 Cao CGA5 có 0.57 g được SKC sephadex với dung môi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 3 phân đoạn (CGA51-3). Kết quả được tóm tắt trong Bảng 1. Bảng 1 Kết quả sắc ký cột sephadex cao CGA5 (0.57g) Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (g) 1 CGA51 Diệp lục 0.129 2 CGA52 Vết vàng chính 0.3 3 CGA53 Vết dơ 0.12 Từ phân đoạn 5.2 tiếp tục SKC sephadex với dung môi 100% MeOH nhiều lần, sau đó SKC silica gel pha đảo thu được CGAV tinh thề mảu vàng. Quá trình cô lập được tóm tắt theo sơ đồ 3 : CGA5 (570 mg) + Hòa với lượng nhỏ MeOH + SKC sephadex với hệ dung môi 100% MeOH + Cô cạn dịch trích CGA51 (129.2 mg) CGA52 (300mg) CGA53 (120.8 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cô cạn dịch trích CGA521 (56 mg) CGA522 (33,5 mg) CGA523 (42 mg) CGA524 (117.2 mg) CGA525 (16 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cô cạn dịch trích CGA5241 (20.3 mg) CGA5242 (65.6 mg) CGA5243 (17 mg) Sơ đồ 3 Quy trình điều chế CGAVA từ phân đoạn CGA5 2.3.2 Cô lập các chất từ cao CGA7 (21 g) Cao CGA7 có 21 g được SKC sephadex với dung môi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 3 phân đoạn (CGA71-3). Kết quả được tóm tắt trong Bảng 2. Bảng 2 Kết quả sắc ký cột sephadex cao CGA7 (25g) Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (g) 1 CGA71 Nhiều vết 3 2 CGA72 Vết vàng 0.6 3 CGA73 Vết cam 7 2.3.2.1 Cô lập các chất từ phân đoạn 7.3 (0.75 g) Phân đoạn 7.3 có vết cam chính được SKC sephadex với dung môi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 4 phân đoạn (7.2.1-7.2.4). Kết quả được tóm tắt theo Bảng 3 CGA5242 (65.6 mg) CGA52422 ( 38.5mg) CGA52423 (8.7 mg) CGA52421 (12.1 mg) CGAVA (7 mg) + SKC silica gel pha đảo (hệ MeOH:H2O = 1:1). + giải li hệ ET:EA = 3:2 + SKC sephadex (100% MeOH). + Cô cạn dịch trích Bảng 3 Kết quả sắc ký cột cao CGA7.3(0.75 g) Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (g) 1 CGA7.2.1 Nhiều vết 0.11 2 CGA7.2.2 Vết tím chính 0.2 3 CGA7.2.3 Vết cam cao chính 0.3 4 CGA7.2.4 Vết cam thấp chính 0.1 2.3.2.1.1 Cô lập các chất từ phân đoạn 7.2.4 Phân đoạn 7.2.4 có vết cam thấp chính tiếp tục được SKC sephadex với dung môi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 3 phân đoạn (7.2.4.1-7.2.4.3). Tiếp tục SKC sephadex nhiều lần ta thu được CGAVII, được tóm tắt theo sơ đồ 4: Sơ đồ 4 Quy trình điều chế CGAVII từ phân đoạn CGA7.2.4 2.3.2.1.2 Cô lập các chất từ phân đoạn 7.2.3 Phân đoạn 7.2.3 có vết cam cao chính tiếp tục được SKC sephadex với dung môi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 2 phân đoạn (7.2.3.1 và 7.2.3.2). Tiếp tục SKC sephadex nhiều lần ta thu được CGAVII, được tóm tắt theo sơ đồ 5: CGA7.2.4 (100 mg) CGA7.2.4.3 (32 mg) CGA7.2.4.2 (53 mg) CGA7.2.4.1 (12 mg) + SKC sephadex (100% MeOH) nhiều lần. + Cô cạn, trích li. CGAVII (12,1 mg) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cô cạn, trích li. Sơ đồ 5 Quy trình điều chế CGAVIII từ phân đoạn CGA7.2.3 2.3.2.1.3 Cô lập các chất từ phân đoạn 7.2.2 Phân đoạn CGA7.2.2 (0.8 g) có vết tím chính tiếp tục được SKC sephadex với dung môi 100% MeOH, qua SKLM gom thành 2 phân đoạn (7.2.2.1 và 7.2.2.2). Tiếp tục SKC sephadex nhiều lần ta thu được CGAIX, được tóm tắt theo sơ đồ 6: CGA7.2.3.1 (0.12 g) CGA7.2.3 (0.3 g) CGA7.2.3.2 (0,17 g) CGA7.2.3.3 (29 mg) CGAVIII (11,4 mg) CGA7.2.3.1 (14 mg) CGA7.2.3.2 (63 g) + SKC sephadex (100% MeOH). + Cô cạn, trích li. + SKC sephadex (100% MeOH) nhiều lần. + Cô cạn, trích li. + SKC sephadex (100% MeOH). + Cô cạn, trích li. Sơ đồ 6 Quy trình điều chế CGAIX từ phân đoạn CGA7.2.2 CGA7.2.2 (0.2 g) CGA7.2.2.2 (0.14g) CGA7.2.2.1 (0.03 mg) CGA7.2.2.2.1 (32 mg) CGA7.2.2.2.3 (16 mg) CGA7.2.2.2.2 (27 mg) CGAIX (3.8 mg) + SKC sephadex (100% MeOH) nhiều lần. + Cô cạn, trích li. + SKC silica gel, hệ dung môi ET:EA = 6:1. + Trích li, cô cạn. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ---------- 3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 3.1.1 HỢP CHẤT CGAVII: Phổ 13C-NMR (125 MHz, acetone -d6) (phụ lục 2.2) hợp với phổ DEPT (phụ lục 2.3) cho thấy có 15 carbon gồm : 4C nhóm =CH- δC [ 94.1, 99.0, 116.0, 130.1] ; 11C tứ cấp : δC [104.0, 123.0, 136.2, 146.5, 156.5, 160.0, 162.0, 165.0] và 1 nhóm >C=O tại δC (176.2). Phổ 1H-NMR có 6H thuộc vòng thơm δH [6.34 (d, 1H, J = 2), 6.52 (d, 1H, J = 2), 7.25(d, 2H, J = 7), 8.15 (d, 2H, J = 8.5)] và 1H có tại δH = 12.20. Phổ 13C-NMR và phổ 1H-NMR cho phép dự đoán CGAVII là hợp chất có khung flavon. O 1 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' O A B khung flavon.  Biện luận vòng B Phổ 1H-NMR (500 MHz, ACETONE-d6) (phụ lục 2.1) Hai tín hiệu proton ghép ortho với cường độ gấp đôi δH 7.25, d, 2H, J = 7 và δH 8.15, d, 2H, J = 8.5 chứng tỏ 4 proton này phải thuộc một vòng benzene có cấu trúc đối xứng. Suy ra, đây là vòng B của khung flavon với vị trí C4’ mang nhóm thế -OH, δH 6.34 và δH 6.52 thuộc vòng A. Mặt khác H-2’/H-6’ ở vị trí meta, H-3’/H-5’ ở vị trí ortho so với C4’ nên H-2’/H-6’ có δH 8.15 và H-3’/H-5’ có δH 7.25. Kết hợp với phổ HSQC (phụ lục 2.4) C-2’/C-6’và C- 3’/C-5’ cộng hưởng lần lượt tại δC 130.1 và 116.0 H-2’/H-6’ có δH 8.15 và H-3’/H-5’ có δH =7.25 đều tương quan với C (δC = 160.0) ắt hẳn là C4. H-3’/H-5’ tương quan với sp2 bậc 4 δC 123.0 suy ra đây là C1’. H-2’/H-6’ tương quan với carbon bậc 3 mang oxy tại δC 146.5 ắt hằn là C2. O O OH H H H H 1 2 OH 3 4 5 6 1' 2' 3' 4' 5' 6' Hình 7: Tương quan HMBC trong vòng B của CGAVII.  Biện luận vòng A Phổ 1H-NMR xuất hiện proton kiềm nối tại δH = 12.20 khẳng định vị trí C5 mang nhóm thế -OH. Phổ HMBC (phụ lục 2.4) cho thấy: Proton kiềm nối tại δH = 12.20 tương quan HMBC với một carbon bậc 3, một carbon bậc ba mang oxy và một carbon bậc 4 lần lượt tại δC (99.0, 162.0, 104.0 ) xác nhận 3 carbon trên lần lượt là C-6, C-5, C-10. Từ phổ HSQC độ dịch chuyển hóa học của H-6 là δH (6.30, 1H, d, J = 2). Vậy proton ghép meta với H-6 phải là H-8 tại δH (6.25, 1H, d, J = 2) đồng thời phổ HSQC khẳng định tín hiệu carbon tại δC 94.1 khẳng định là C-8. Như vậy vòng A phải mang nhóm –OH tại C7. Proton của C-6 và C-8 đều tương quan với tín hiệu carbon tại δC = 165 khẳng định đây là tín hiệu của C7. Trên phổ HMBC, proton H-8 tương quan với tín hiệu carbon tại δC = 156.5 suy ra đây là C-9. Như vậy tín hiệu carbon cộng hưởng tại δC 136.2 là C-3. O O OH HO O H H 1 2 3 45 6 7 8 10 9 H Hình 6: Tương quan HMBC trong vòng A của CGAVII. Từ các phân tích phổ trên có thể xác định được CGAVII là kaempferol [3,5,7- trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one]. O 1 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' O OH OH OH HO Kaempferol [3,5,7- trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one]. Bảng 4: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVII STT CGAVII ACETONE-d6 δH (pmm) 500 MHz δC (ppm) 125 MHz 2 146.5 3 136.0 4 176.2 5 162.0 6 6.3 (d, 1H, J = 2) 99.0 7 165.0 8 6.52 (d, 1H, J = 2) 94.1 9 157.0 10 104.0 1’ 123.0 2’/6’ 8.15 (d, 2H, J = 7) 130.0 3’/5’ 7.25 (d, 2H, J = 8.5) 116.0 4’ 160.0 3.1.2 HỢP CHẤT CGAVA Hợp chất thu được có tinh thể màu vàng hình kim, nhiệt độ nóng chảy 223- 2240C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, ACETONE-d6) (phụ lục 2.1) có 9 proton với : 2 proton δH [4.71 (tù, rộng), 4.82 (s, 2H)]; 2 proton thuộc cùng vòng thơm ở vị trí meta với nhau δH [ (7.37, 1H, d, J = 1.5), (7.36, 1H, d, J = 1.5)]; 3 proton thuộc vòng thơm liền kề nhau δH [7.81(1H,d), 7.82(1H, d), 7.84 (1H, d)] và 1 proton của –OH kiềm nối tại δH = 12.s Phổ 13C-NMR (125 MHz, acetone -d6) (phụ lục 1.2) hợp với phổ DEPT (phụ lục 1.3) cho thấy có 15 carbon gồm 1C methylene tại δC = 60.4, 5C nhóm =CH- tại δC [118.2, 120.5, 121.5, 138.4, 125.2 ], 9C tứ cấp trong đó 2 nhóm (>C=O) có độ dịch chuyển hóa học là δC [182.2 và 194.6], và có 7C khác tại δC [115.5, 117.1, 134.5, 135.7, 155.2, 163.2, 163.8]. Từ dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán CGAVA là một anthraquinon với vòng A có 3H liên tiếp ở vị trí 5, 6, 7. Vòng B có 2 H ở vị trí 2, 4. Đồng thời C-1 và C-8 mang 2 nhóm –OH. O O A B 1 2 3 45 6 7 8 9 10 4a5a 8a 1a Khung anthraquinon  Biện luận vòng B : Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu carbon tại δC = 194.6 (C-9) khẳng định sẽ có 2 nhóm thế -OH ở vị trí 1 và 8. Phổ HMBC (phụ lục 2.4) cho thấy: Proton tại δH = 7.37 tương quan với C-1 (δC 163.8) suy ra đây chính là tín hiệu của H-2 , Kết hợp với HSQC suy ra C-2, C-4 lần lượt cộng hưởng tại δC (121.5), δC (125.2). Proron của C-4 (δC 125.5) và C- 2 (δC 121.5) cùng tương đương với C (δC 115.5) suy ra đây là C-1a. Tín hiệu cộng hưởng của C-3 được xác nhận dựa trên tương quan HMBC giữa proton H-3’ (δH = 4.82) với carbon tứ cấp tại δC 155.2. O OH H CH2OH H 9 1 2 34 10 O 3' 4a 1a Hình 7: tương quan HMBC trong vòng B của CGAVA  Biện luận vòng A: Phổ HMBC có: Proton tại δH = 7.82 tương quan với C-10 (δC = 182.2 suy ra đây là H-5. vây C-5 cộng hưởng tại δC = 118.2. Tín hiệu proton tại δH = 7..84 tương quan với C-8 (δC = 163.2) hẳn là H-6, vậy C-6 có độ dịch chuyển hóa học là δC 138.8. Như vậy tín hiệu proton tại δH = 7..81 là H-7 và C-7 có δC = 120.5. Hai proton H-7 (δH 7.81) và H-5 (δH 7.82) cùng tương quan với carbon bậc 4 δC 116.5 hẳn là C-8a. Hai proton H (δH = 7.81) và H (δH = 7.82) cùng tương quan với carbon bậc 4 C (δC = 116.5) suy ra δC = 116.5 là C-8a. Hai proton H-5 (δH = 7.82) và H-6 (δH = 7..84) cùng tương quan với carbon bậc 4 C (δC = 135.0) suy ra đây là C-5a. Vậy C-4a có độ dịch chuyển hóa học là δC = 134.5. OO OH H2 C OH OH H H H H H1 2 34 4a 5a 105 6 7 8 8a 9 1a Hình 8 :Tương quan HMBC của CGAVA. Từ các phân tích phổ trên có thể xác định được CGAVA là aloe –emodin O O OHOH OH 1a 1 3 4 4a 5 6 7 8 9 10 3' 2 5a 8a aloe – emodin Bảng 5: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CGAVA STT CGAVA AXETONE – d6 δH (pmm) 500Hz δC (ppm) 125 Hz 1 163.8 2 7.37 (d, 1H, J = 1.5) 121.5 3 155.2 4 7.36 (d, 1H, J = 1.5) 125.2 5 7.82 (d, 1H) 118.2 6 7.84 (d, 1H). 138.8 7 7.81 (d, 1H) 120.5 8 163.2 9 192 10 182 1a 115.5 3’ 4.82 (s, 2H) 60.8 4a 134.5 5a 135.0 8a 116.5 3.1.3 HỢP CHẤT CGAVIII: Phổ 1H-NMR (500 MHz, acetone -d6) (phụ lục 3.1) cho thấy có 6-H với 2 proton tại δH [(6.26, 1H, d, J = 1.5) và (6.52, 1H, s)] ở vị trí meta với nhau; 3 proton tại δH [(6.99, d, 1H, J = 8.5), (7.70, dd, J = 2), (7.85, d, J = 1.5)] và 1 proton của –OH kiềm nối tại δH 12.20. Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho thấy có 15C trong đó có 5 nhóm =CH- tại δC [94.5, 99.2, 115.8, 116.2, 121.5] ; 10C tứ cấp với 9C tại δC [104.0, 123.8, 137, 146, 146.9, 148.5, 158.9, 162.5, 165] và 1C nhóm >C=O tại δC 176.8. Các giá trị phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR cho phép dự đoán CGAVIII là hợp chất có khung flavon. O 1 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' O A B  Biện luận vòng A: Phổ 1H-NMR (500 MHz, acetone -d6) cho thấy: Tín hiệu cộng hưởng tại δH 12.2 xác nhận –OH gắn vào C-5 của vòng A. Proton δH 6.26 (d, 1H, J = 1.5) và δH 6.52 (s, 1H) thuộc vòng A và H6 có độ dịch chuyển hóa học nhỏ hơn H-8 nên H-6 có δH 6.26,