Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của nấm pestalotiopsis

ngập mặn phía Nam Trung Quốc với các công bố liên tục trong năm năm gần đây của nhóm tác giả Trung Quốc. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA SINH VỀ LOÀI NẤM PESTALOTIOPSIS 1.2.1. Cây chưa được xác định loài ở Trung Quốc Pestalachloride A-C (1-3) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis adusta.[30] Trang 2 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Các chất này được đánh giá khả năng kháng một số nấm gây bệnh cây trồng gồm Fusarium culmorum, Gibberella zeae, Verticillium aiboatrum. Pestalachloride A có khả năng kháng nấm F. culmorum với giá trị IC50 0.89 µM. Pestalachloride B thể hiện khả năng kháng mạnh với nấm G. zeae với giá trị IC501.1 µM. Tuy nhiên Pestalachloride C không thể hiện khả năng kháng nấm F. culmorum, G. zeae và V. aiboatrum.[30] Pestaloficiol A-E (4-8) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis fici.[18] Pestaloficiol A, B và D có khả năng ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong dòng tế bào C8166 với giá trị EC50 lần lượt là 26.0, 98.1, 64.1 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 là 8.81 nM).[31] Pestalofone A-E (9-13) cũng được cô lập từ loài nấm sinh trưởng trên cây này.[17,20] Pestalofone A, B và E thể hiện hoạt tính ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong dòng tế bào C8166 với giá trị EC50 lần lượt là 90.4, 64.0, 93.7 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 8.81 nM) ). Pestalofone A-E còn được đánh giá khả năng kháng C. albicans (ATCC10231), G. candidum (AS2.498) và A. fumigatus (ATCC10894). Pestalofone A và C thể hiện hoạt tính kháng mạnh đối với A. fumigatus với giá trị IC50/MIC lần lượt là 1.10/35.3, 0.90/31.2 µM (chứng dương fluconazole có giá trị IC50/MIC là 7.35/163.4 µM).[19,20] 1.2.2. Cây đặc hữu vùng, không có ở Việt Nam. 1.2.2.1. Melaleuca quinquenervia (Tràm gió). Pestalactam A-C (14-16) cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis sp. trên cây Melaleuca quinquenervia ở Úc bởi Davis R. A. và cộng sự công bố vào năm 2010.[4] Pestalactam A và B ở nồng độ 25 µM thể hiện khả năng ức chế từ 16 – 41% sự phát triển của kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. Hai hợp chất này ở nồng độ 100 µM còn có hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào MCF-7 và NFF (ức chế sự phát triển từ 12-64%).[4] Trang 3 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2.2.2. Virola mechelii (Myristicaceae) ở Brazil Một dẫn xuất mới của anthraquinone là guepinone (17), cùng với 2 hợp chất đã biết isosulochrin (18) và chloroisosulochrin (19) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis guepinii ở cây thuốc Virola michelii.[22] Các hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất này đã được đánh giá, chỉ có hoạt tính kháng S. aureus (đường kính vòng ức chế 13 mm), và hoạt tính của hợp chất chloroisosulchrin là tích cực nhất.[22] 1.2.3. Cây vùng rừng ngập mặn. 1.2.3.1. Cây Đưng Rhizophora mucronata Pestalotiopyrone A-H (20–26), pestalotiopisorin A (27), pestalotiollides A-B (28-29), pestalotiopin A (30), amide pestalotiopamide A-D (31-34), nigrosporapyrone D (35), p-hydroxybenzaldehyde (36) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis sp. sinh trưởng trên cây Đưng Trung Quốc Rhizophora mucronata sinh trưởng ở vùng rừng ngập mặn bởi nhóm nghiên cứu của Xu J. và cộng sự năm 2011. Các hợp chất chromone Pestalotiopsone A-F (37-42) cũng được cô lập bởi Xu J. và cộng sự năm 2008, đã được xác định cấu hình tuyệt đối vào năm 2013 bởi nhóm tác giả Beekman A. M. và Barrow R. A.[2,24,29,30] Pestalotiopsone F thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình với giá trị EC50 là 8.93 µg/mL.[28] 1.2.3.2. Cây Sấu Dracontomelon duperreanum Virgatolide A-C (43-45) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis virgatula ở cây Sấu Dracontomelon duperreanum bởi Li J. và cộng sự năm 2011.[14] Các hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình đối với dòng tế bào HeLa, giá trị IC50 lần lượt là 19.0, 22.5, 20.6 µM (chứng dương 5-fluorouracil có giá trị IC50 là 10.0 µM).[14] Trang 4 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2.3.3. Cây Bần chua Sonneratica caseolaris Pestalotiopyrone I-L (46-49), một xuyên lập thể phân của hydroxypestalotin và hydropestalotin, pestalotin, và pestalopyrone được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis virgatula trên cây Bần chua Sonneratica caseolaris ở vùng rừng ngập mặn bởi Ronsberg D. và cộng sự được công bố vào năm 2013.[23] Các hợp chất này không có hoạt tính kháng khuẩn, không có khả năng gây độc tế bào cũng như không có khả năng tiêu diệt ấu trùng của côn trùng.[23] Các dẫn xuất prenyl depside (50) và methylcoumarin (51, 52), endocrocin (53), pestalotiollide B, pestalotiopyrone G, scirpyrone A (54), và chromone (55) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis acaciae bởi Yang X.-L. và cộng sự vào năm 2013.[32] Các hợp chất này không có hoạt tính gây độc tế bào cũng như kháng khuẩn, kháng virus.[32] Cytosporin F-K (56-61) và cytosporin D (62) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis theae trên cây thuốc Turraeanthus longipes ở Cameroon bởi Akone S. H. và cộng sự cũng vào năm 2013.[1] Các hợp chất này cũng không có hoạt tính gây độc tế bào cũng như kháng khuẩn và kháng virus.[1] 1.2.3.4. Cây Trang Kandelia candel (L.) Druce Pestalamine A (63) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis vaccinii, sinh trưởng trên cây Trang Kandelia candel (L.) Druce ở vùng rừng ngập mặn Trung Quốc cùng với các hợp chất diketopiperazine, các hợp chất đơn vòng khác. Pestalamine A thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình đối với các dòng tế bào MCF-7, HeLa và HepG2, với giá trị IC50 lần lượt là 40.3, 22.0, 32.8 µM (giá trị IC50 của chứng dương taxol đối với các dòng tế bào ung thư này lần lượt là 5.2, 21.0 và 960 nM). Trang 5 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Các hợp chất vaccinol A-G (64-70), vaccinal A (71) cùng với 5 hợp chất cladoacetal B (72), cladoacetal A (73), xylarinol A (74), agropyrenol (75), vaccinol H- I (76-77), 3-(2-formyl-3-hydroxyphenyl)-propionic acid (78) được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis vaccinii bởi Wang J. và cộng sự vào năm 2014 và 2015.[25,26] Vaccinal A có khả năng kháng dòng tế bào COX-2 với giá trị IC50 là 1.8 µM. Vaccinal A cũng có khả năng kháng virus đường ruột EV71 với giá trị EC50 là 19.2 µM. Vaccinol I thể hiện hoạt tính kháng dòng tế bào COX-2 với giá trị IC50 là 16.8 µM.[25,26] 1.2.3.5. Cây Sú biển Aegiceras corniculatum Pestalols A-E (79-83) cùng với 4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl) acetate (84), p-hydroxyphenylacetic acid methyl ester, trans-harzialactone A (85) và F (86), 3-hydroxy-3-methyl-δ-lactone (87), -trihydroxy-7,22-en- ergost-6-one và -hydroxysterol được cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis sinh trưởng trên cây sú biển Aegiceras corniculatum ở vùng rừng ngập mặn bởi Jian-Fan S. và cộng sự vào năm 2014.[24] Trong số các chất này, có 7 chất thể hiện khả năng ức chế sự nhân lên của H3N2 và H1N1. -hydroxysterol có hoạt tính ức chế mạnh nhất, giá trị IC50 đối với H3N2 là 4.7 µM, đối với H1N1 là 2.2 µM. Pestalol B có khả năng kháng vi khuẩn lao.[24] 1.2.4. Các cây loài khác 1.2.4.1. Cây trà Trung Quốc Camellia sinensis Năm 2008, Ding G. và cộng sự đã cô lập được pestalazine A-B (88-89), asperazine (90), pestalamide A-C (91-93), aspernigzrin (94), carbonarone (95) từ loài nấm Pestalotiopsis theae.[5] Pestalazine A, pestalamide A, asperazine có khả năng ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào C8166 với giá trị EC50lần lượt là 47.6, 64.2, 98.9 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 là 5.5 nM). Pestalamide A còn có khả năng Trang 6 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP kháng nấm A. fumigatus với giá trị IC50 và MIC lần lượt là 1.5 và 57.8 µM (chứng dương fluconazole có giá trị IC50 và MIC lần lượt là 7.35 và 163.4 µM).[5] Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Ling L. đã cô lập được pestaloficiol F-L (96- 102), các dẫn xuất isoprenyl chromone từ nấm Pestalotiopsis fici trên cây trà Camellia sinensis.[16] Pestaloficiol J thể hiện khả năng ức chế sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào C8166 với giá trị EC50 là 8.0 µM (chứng dương indinavir sulfate có giá trị EC50 là 8.2 µM). Pestaloficiol L thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào HeLa và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 8.7 và 17.4 µM (chứng dương 5-fluorouracil có giá trị IC50 lần lượt là 10.0 và 15.0 µM).[15] Pestaloficiol Q-S (103-105), các dẫn xuất isoprenyl chromone, cùng với anofinic acid, siccayne, pyrenophorol được cô lập bởi Shuchun và cộng sự, công bố năm 2013.[21] Siccayne thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với cả 2 dòng tế bào HeLa và HT29 với giá trị IC50 lần lượt là 48.2 và 33.9 µM (chứng dương 5-fluorouracil có giá trị IC50 lần lượt là 8.0 và 12.0 µM).[21] Ling L. và cộng sự cô lập được chloropestolide B-G (107-112), dechloromaldoxin (113) vào năm 2013.[15] Chloropestolide B có khả năng gây độc với cả 3 dòng tế bào CNE1-LMP1, A375, MCF-7 với giá trị IC50 lần lượt là 16.4, 9.9 và 23.6 µM (chứng dương paclitaxel có giá trị IC50 lần lượt là 4.2, 8.9 và 0.14 nM).[15] Nhóm nghiên cứu của Ling L. tiếp tục cô lập tiếp được pestalotriol A (114) và B (115) từ Pestalotiopsis fici cũng trên cây Trà Camellia sinensis. Pestalotriol B thể hiện hoạt tính yếu đối với dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 là 87.0 µM (chứng dương cisplatin có giá trị IC50 là 7.4 µM). Trang 7 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2.4.2. Thông la hán Podocarpus macrophyllus Cytosporin D và hai dẫn xuất isoprenyl epoxyquinol, pestaloquinol A - B (116- 117 được cô lập từ nấm nội sinh Pestalotiopsis sp. trên cây Podocaarpus macrophyllus bởi nhóm nghiên cứu của Gang Ding, công bố năm 2011.[7] Pestaloquinol B và cytosporin D thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 là 8.8 µM (chứng dương VP-16 và D-24851 thể hiện giá trị IC50 là 1.63 và 0.88 µM).[7] MP [4-(3’,3’-dimethylallyloxy)-5-methyl-6-methoxyphthalide] (118) được cô lập từ nấm Pestalotiopsis photiniae ở cây Thông la hán Podocarpus macrophyllus bởi Chen . và Yang R. L. năm 2013.[3] Hợp chất này có khả năng ức chế sự nhân lên của dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 sau 24, 48, 72 giờ lần lượt là 36, 22, 13 µg/mL.[3] 1.2.4.3. Cây Cau vua Roystonea regia Photinide A-F (119-124) với khung sườn benzofuranone γ-lactone cô lập từ loài nấm Pestalotiopsis photiniae trên cây cau vua Roystonea regia ở Trung Quốc bởi Ding G. và cộng sự, công bố năm 2009.[8] Các hợp chất này ở nồng độ 10 µg/mL đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào MDA-MB-231 với mức độ ức chế tế bào lần lượt là 24.4%, 24.2%, 23.1%, 24.4%, 24.6%. Tuy nhiên, ở cùng nồng độ, không có hợp chất nào thể hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào HeLa.[8] 1.2.4.4. Thông trắng Pinus armandii Năm 2014, Jin Xie và cộng sự đã cô lập được hai dẫn xuất của ambuic acid 1,2 (125-126) từ Pestalotiopsis sp. trên cây thông trắng Pinus armandii.[27] Trong đó hợp chất thứ nhất có khả năng gây độc yếu đối với 5 dòng tế bào ung thư, giá trị IC50 lần lượt là 18.99 µM (HL-60), 17.68 µM (SMMC-7721), 18.28 µM (A-549), 21.67 µM (MCF-7) và 12.27 µM (SW480).[27] Trang 8 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 1.1: Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Hợp chất Vi khuẩn, nấm Pestalachloride A Nấm F. culmorum Pestalachloride B Nấm G. zeae Pestalazine A, Pestalamide A, asperazine Nấm Candida albicans (ATC 10231), Geotrichum candidum (AS2.498), và Aspergillus fumigatus (ATCC 10894). Pestalamide A Nấm A. fumigatu Pestalofone A – E C. albicans (ATCC10231), G. candidum (AS2.498) và A. fumigatus (ATCC10894). Pestalolide Nấm C. albicans và Cryptococcus neoformans. Pestalol B Vi khuẩn lao. Bảng 1.2: Hoạt tính kháng virus Hợp chất Hoạt tính Pestalazine A; Pestalamide A; asperazine; pestaloficiol J; Chloropestolide A; pestaloficiol A, B, D; pestalofone A, B, E. Ức chế sự nhân lên của virus HIV - 1 Pestaloxazine A, Vaccinal A. Kháng virus đường ruột EV71 -hydroxysterol Ức chế mạnh sự nhân lên của H3N2, H1N1 Trang 9 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 1.3: Hoạt tính gây độc tế bào Hợp chất Hoạt tính gây độc Pestalactam A – C, Dòng tế bào MCF – 7 và NFF. Photinide A – F Dòng tế bào MDA – MB – 231. Pestaloficiol L Dòng tế bào HeLa và MCF7. Siccayne Dòng tế bào HeLa và HT29. Chloropestolide A Dòng tế bào HeLa, HT29. Chloropestolide B Dòng tế bào CNE1 - LMP1, A375, MCF – 7. Pestalotriol A – B Dòng tế bào HeLa, A549, T24, MCF – 7 Pestaloquinol B, cytosporin D, Virgatolide A-C Dòng tế bào HeLa. Pestalamine A Dòng tế bào HeLa, MCF – 7, HepG2. Vaccinal A, vaccinol I Dòng tế bào COX – 2 Trang 10 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG THỨC CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP TỪ PESTALOTIOPSIS SP. OH OH HN O OH Cl O Cl OH OH O O Cl Cl OH O O OH OH H H OCl Cl Pestalachloride A (1) Pestalachloride B (2) Pestalachloride C (3) O O OH O O OH OH O RO Pestaloficiol A (4) R=H Pestaloficiol B (5) R=CH3 Pestaloficiol C (6) O OH OH O RO R=H Pestaloficiol D (7) R=CH3 Pestaloficiol E (8) O OH O Pestalofone A (9) O OH O O HO OH Pestalofone B (10) O OH O O HO OH Pestalofone C (11) O OH O C O OH O HO O COOCH3 O OH O OH O O COOCH3 Pestalofone D (12) O O Pestalofone E (13) NH O O HO OH NH O O HO OH NH O O HO Cl Cl Pestalactam A (14) Pestalactam B (15) Pestalactam C (16) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis Trang 11 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O O O OH Pestalotiopyrone A (20) O O O Pestalotiopyrone C (21) O O O OH OH Pestalotiopyrone D (22) O O O OH Pestalotiopyrone E (23) O O OO Pestalotiopyrone F (24) O O O O Pestalotiopyrone G (25) O O O O O HO Pestalotiopyrone H (26) O O O O O HO O O O OH O HO HO O O O OH O HO HO Cl Guepinone (17) Isosulochrin (18) Chloroisosulochrin (19) O OOHOH O Pestalotiopisorin A (27) O O OO HO R R = R = OH OH OH OH Pestalotiollides A (28) Pestalotiollides B (29) O OH OO Pestalotiopin A (30) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 12 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O NH2 OO amide Pestalotiopamide A (31) O H N OO amide Pestalotiopamide B (32) O OH O H N OO amide Pestalotiopamide C (33) O OCH3 O H N OO amide Pestalotiopamide D (34) OCH3 O O O O O Nigrosporapyrone D (35) p-hydroxybenzaldehyde (36) OH O R1 = R2 = R2 = R2 = R2 = R1 = R1 = R2 =R1 = R1 = O OR2 HO R1 OH OH R1 = O O O O OH O O O O O R2 = O O Pestalotiopsone A (37) Pestalotiopsone B (38) Pestalotiopsone C (39) Pestalotiopsone D (40) Pestalotiopsone E (41) Pestalotiopsone F (42) O O O O O HO OHO O O O HO O HO OH O O O HO O HO OH Virgatolide A (43) Virgatolide B (44) Virgatolide C (45) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 13 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP R = CH2OH Pestalotiopyrone J (47) O O O O O OH OH O O O O O OH OH R R = CH2OCOCH3 Pestalotiopyrone K (48) Pestalotiopyrone I (46) O O O HO O O OH Pestalotiopyrone L (49) O O OH OH OH OH O OH O HO OH O OH O HO O O OH HO OH COOH O O OO O OHO O OH Prenyl depside (50) Methylcoumarin (51-52) Endocrocin (53) Pestalotiopyrone G (54) Chromone (55) O O OH H OR1 R4 R3 R2 R1 R2 R3 R4 H H H H Ac H H H Ac OH H H Ac H OH H Ac H H OH H H OH H H H H OH Cytosporin D (62) Cytosporin F (56) Cytosporin G (57) Cytosporin H (58) Cytosporin I (59) Cytosporin J (60) Cytosporin K (61) OH OH O O NH2 O O O Pestalamine A (63) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 14 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O OH O O OH O OH O R1 R2 OH OH O R1 R2 OH O R1 = OH R2 = H Vaccinol C (66) R1 = H R2 = OH Vaccinol D (67) R1 = OH R2 = H Vaccinol E (68) R1 = H R2 = OH Vaccinol F (69) OH O OH OH Vaccinol A (64) Vaccinol B (65) Vaccinol G (70) O OH O O OH O Cladoacetal B (72) O HO OH Vaccinal A (71) Cladoacetal A (73) OH O O OH O OH OH OH O COOH Xylarinol A (74) Agropyrenol (75) OH Vaccinol H (76) O O OH OH O O OH Vaccinol I (77) 3-(2-formyl-3-hydroxyphenyl)propanoic acid (78) OH OH O OH H O OH H OH HO Pestalols A (79) Pestalols B (80) Pestalol C (81) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 15 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O OH OH H O OH OSO3H H Pestalol D (82) Pestalol E (83) HO O O OH 4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate (84) O O OH O O OH O O HO Harzialactone A (85) Harzialactone F (86) 3-hydroxy-3-methyllactone (87) N H NHN H H O O H N N H H N O O N H NHN H H O O N N H H N O O N H NHN H H O O H N N H H N O O Pestalazine A (88) Pestalazine B (89) Asperazine (90) R OO N H O HOOC R=O Pestalamide A (91) R=NH Pestalamide B (92) N OO H2N HO Pestalamide C (93) R OO H2N R=O Arpernigrin (94) R=NH Carbonarone (95) O O OH O Pestaloficiol F (96) O OH OH O O OH OH O O O OH O OH Pestaloficiol G (97) Pestaloficiol H (98) Pestaloficiol I (99) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 16 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O OH O Pestaloficiol J (100) O OH O O O OH OH HO OH O COOCH3 O Pestaloficiol L (102)Pestaloficiol K (101) O OH O O Pestaloficiol Q (103) O OH O OH Pestaloficiol R (104) HOOC O OH Pestaloficiol S (105) O O O O OH OH Pyrenophorol (106) Cl O C H HO OH O O O HO O O O Cloropestolides B (107) Cl O O O HO O O O Cl O O HO O C OHO H HO C OH HO O O H O O O O Cloropestolides C (108) Cloropestolides D (109) OH O O O O O O O Cl HO O OH H Chloropestolides E (110) OH O O O O O O O Cl H Chloropestolides F (111) OH HO O OH O O O O O O O Cl O OH H H Chloropestolides G (112) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 17 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP O O OH O O O O O Dechloromaldoxin (113) O O O OH H H Pestaloficiol A (114) O OH O OH OH Pestaloficiol B (115) n-C5H11 O O HO O O O OH O H O OH O O HO O O O OH O H O OH n-C5H11 Pestaloquinol A (116) Pestaloquinol B (117) O HO O COOH O HO O COOH HO Cl O (1) (2) n-C5H11 n-C5H11 O O O O OR OH R = CH3 Photinide A (119) R = H Photinide C (121) O OOR R = CH3 Photinide B (120) R = H Photinide D (122) O O OH O O O O OMe OHO O OOR O O OH O Photinide E (123) Photinide F (124) O O O O MP (118) Dẫn xuất của acid ambumic 1,2 (125-126) Hình 1.1: Các hợp chất cô lập từ nấm Pestalotiopsis (tiếp) Trang 18 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 2.1.1. Hóa chất Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: hexan, ethyl acetate, acetic acid, acetone, ethanol, methanol đều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam. Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng bằng vanillin/H2SO4, đèn UV. Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70-30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm xuất xứ Ấn Độ. 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng). Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath. Cột sắc ký: cột cổ điển. Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck. Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Tất cả phổ NMR được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. NGUYÊN LIỆU Mẫu nấm Pestalotiopsis được cung cấp bởi thạc sĩ Trần Thị Minh Định – Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm TP.HCM. Trang 19 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.3. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Từ 500.0 g sinh khối nấm, thực hiện phương pháp ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng, lấy được dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 19.2 g cao ethanol thô. Cao ethanol thô được hòa tan trong EtOH: H2O (9:1) thu được phần dung dịch DE (2.0 g) và phần tủa TE (18.0 g, tủa tan hoàn toàn trong nước). Lấy phần dung dịch DE thực hiện sắc kí cột với hệ dung môi H: EA: Ac: Me: AcOH với tỉ lệ thể tích 40: 6: 2: 1: 1 thu được các phân đoạn cao tương ứng là Et1 (201.0 mg), Et2 (196.0 mg), Et3 ( 405.0 mg), Et4 (361.0 mg) và Et5 (150.0 mg). Tiến hành sắc ký cột trên phần TE bằng hệ dung môi EA: Ac: Me: AcOH với tỉ lệ thể tích là 3: 1: 0.5: 0.5, thu được các phân đoạn cao tương ứng W1 (0.5 g), W2 (2.0 g), W3 (5.1 g) và W4 (6.1 g). 2.3.1. Sắc kí cột lên cao Et3 Cao Et3 (405.0 mg) được tiến hành sắc kí cột với hệ H: EA: Ac: Me: AcOH (40: 6: 2: 1: 1) thu được 5 phân đoạn Et3.1 (130.0 mg), Et3.2 (60.0 mg), Et3.3 (26.0 mg), Et3.4 (20.0 mg) và Et3.5 (40.0 mg). Thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế trên phân đoạn Et3.5 (40.0 mg) ta thu được 8.0 mg hợp chất Et35. 2.3.2. Sắc kí bản mỏng W1 Thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế trên phân đoạn W1 (0.5 gam) với hệ dung môi EA: Ac: Me: AcOH (3: 1: 0.5: 0.5), thu được 25.0 mg hợp chất EtA. Trang 20 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP pTLC/B pTLC/A CC/B CC/A CC/A Cao EtOH thô (20.0 g) Phần dung dịch DE (2.0 g) Phần tủa TE (tan trong nước) (18.0 g) W1 (0.5 g) W2 (2.0 g) EtA (25.0 mg) Et3.1 (130.0 mg) Et3.2 (60.0 mg) Et3.3 (26.0 mg) Et3.4 (20.0 mg) Et3.5 (40.0 mg) W3 (5.1 g) W4 (6.1 g) Et35 (8.0 mg) Hòa tan trong EtOH:H2O (9:1) Hệ dung môi A H:EA:Ac:Me:AcOH 40:6:2:1:1 Hệ dung môi B EA:Ac:Me:AcOH 3:1:0.5:0.5 Sơ đồ 1: Quá trình ly trích và cô lập các hợp chất Et1 (201.0 mg) Et2 (196.0 mg) Et3 (405.0 mg) Et4 (361.0 mg) Et5 (150.0 mg) Trang 21 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Et35 3.1.1. Đặc điểm hợp chất Et35 • Chất dầu không màu, hấp thụ UV (γ= 254 µm), cô lập từ phân đoạn Et3. • [ ]25Dα = -27.6 o (c 0.17, MeOH). • Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) (Phụ lục 1) và 13C-NMR (100MHz, DMSO-d6) (Phụ lục 2) được trình bày trong bảng 3.1. • Phổ HSQC được trình bày ở phụ lục 3. • Phổ HMBC được trình bày ở phụ lục 4 và phụ lục 5. 3.1.2. Biện luận cấu trúc hợp chất Et35 Phổ 1H-NMR cho thấy có hai proton nhóm -NH [𝛿𝛿 9.18 (H, br); 𝛿𝛿 7.73(1H, m)], năm proton nhân thơm [𝛿𝛿 7.32 (2H, m); 𝛿𝛿 7.24 (2H, m); 𝛿𝛿 7.23 (H, m)], một proton nhóm methine [𝛿𝛿 5.14 (H, d, J= 3.5Hz)] có tín hiệu dịch về từ trường thấp, một nhóm ethoxyl [𝛿𝛿 3.98 (2H, q, J= 7.0Hz), 𝛿𝛿 1.09 (3H, t, J= 7.5Hz)], một nhóm methyl tại 𝛿𝛿 2.24 (3H, s) gắn trên carbon sp2. Phổ 13C-NMR cho thấy có một nhóm carboxyl ester (𝛿𝛿 165.2), một nhóm carboxyl amide (𝛿𝛿 152.2), một nhóm methine sp3 liên kết với nitrogen tại 𝛿𝛿 53.9. Proton H-2’’ và H-6’’ có tương quan HMBC với C-1’’ (𝛿𝛿 145.0) và C-4 (𝛿𝛿 53.9) đồng thời H-4 cũng có tương quan HMBC với C-1’’, C-2’’ và C-6’’ (𝛿𝛿 126.2), giúp xác định sự liên kết giữa 2 nhân A và B tại C-4. Proton H-4 (𝛿𝛿 5.14) có tương quan HMBC với các carbon C-5 (𝛿𝛿 99.3), C-6 (𝛿𝛿 148.3), C-1’ (𝛿𝛿 165.4). Mặt khác, proton H3-4’ (𝛿𝛿 2.24) cũng có tương quan HMBC với các carbon C-5 và C-6 đồng thời có tương quan xa với C-1’ và C-4, từ đó xác định các vị trí nhóm thế trên nhân A. Proton H2-2’ có tương quan HMBC với C-1’, xác định sự liên kết giữa nhóm ethoxyl với C-1’. Trang 22 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Proton NH-1 tại 𝛿𝛿 7.73 có tương quan HMBC với C-4 và C-5 và NH-3 tương quan với C-5 và C-4’, giúp xác định các vị trí còn lại trên nhân A. Từ các dữ liệu trên, kết hợp và so sánh với dữ liệu phổ và năng lực triền quang [ ]Dα của (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)- one[10], thấy dữ liệu phổ và năng lực triền quang [ ]Dα của (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6- methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one và Et35 có sự tương đồng, nên cấu trúc hợp chất Et35 được đề nghị như hình vẽ 3.1. N H NH O O O 2 4 5 6 4' 1'' 3'' 2'' 4'' 5'' 6'' 1' 2' 3' 1 3 HMBC B A Hình 3.1: Một số tương quan HMBC của hợp chất Et35 Trang 23 HOÀNG KHÁNH AN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hợp chất Et35 đã được công bố là sản phẩm tổng hợp hữu cơ. Đây là lần đầu tiên hợp chất Et35 được tìm thấy trong tự nhiên. (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4- phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)- one (DMSO-d6) Et35 (DMSO-d6) NO δH δC δH δC 1 9.18 (1H,s) 9.18 (1H,s) 2 152.7 152.2 3 7.73 (1H,s) 7.73 (1H,s) 4 5.14 (1H,s) 51.6 5.14 (1H,d) 53.9 5 97.7 99.3 6 148.6 148.3 1’ 165.3 165.4 2’ 3.97 (2H, q) 59.1 3.98 (2H, q) 59.2 3’ 1.09 (3H, t) 14.3 1.09 (3H, t) 14.1 4’ 2.20 (3H, s) 17.8 2.24 (3H, s) 17.8 1’’ 136.3 145.0 2’’-