Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng phyllanthus emblica linn

n. Còn ở Việt Nam, quả Me rừng khô thường được dùng để trị tiêu chảy đau bụng. Hơn hết, quả Me rừng còn được dùng như một nguồn vitamin C dồi dào với tên “Myrobalan emblic”, chữa bệnh cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát (dùng 10 – 30 quả sắc uống mỗi ngày), còn trị được bệnh đái tháo đường, trị ho, lợi tiểu, nhuận tràng. Còn rễ có vị đắng, chát, tính mát được dùng để trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp (dùng 15 – 20g sắc uống mỗi ngày). Bên cạnh đó, lá nấu nước rửa bên ngoài để trị lở loét, mẩn ngứa. Vỏ thân cây và rễ có vị đắng, chát, tính mát, sắc lấy nước uống làm lợi tiểu, chữa phù thũng và tăng huyết áp [1–2]. 1.2.2. Dược tính theo y học hiện đại Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về dược tính theo y học hiện đại về cây Me rừng, trong đó phải kể đến một số nghiên cứu tác dụng dược lý của các hợp chất quan trọng trong cây Me rừng như acid gallic, acid ellagic, phyllaemblicin B, phyllaemblicin C, putranjivain A, emblicamin A và B  Tác dụng kháng khuẩn và chống oxi hóa Năm 2007, từ dịch chiết của quả Me rừng, Xiaoli Liu cùng các cộng sự của mình đã nghiên cứu thành công được về khả năng kháng khuẩn và chống oxi hóa từ dịch chiết đó. Dịch chiết này thu được bằng phương pháp chiết với chất lỏng siêu tới hạn và cao chiết với methanol [22]. Kết quả của cuộc nghiên cứu cho thấy cao chiết bằng phương pháp chiết với chất lỏng siêu tới hạn có khả năng kháng khuẩn ở các loại vi khuẩn gram âm (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi), gram dương (S. aureus, B. cereus và B. subtilis) và kể cả nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) gây hại trên thực 3 phẩm. Điều này được xem như góp phần vào việc sử dụng một sản phẩm thay thế để kiểm soát vi khuẩn và bảo quản thực phẩm từ tự nhiên. Ngoài ra, vào năm 2016, cũng từ dịch chiết ethanol của quả Me rừng, Sirinya Pientaweeratch và các cộng sự đã cho thấy nó khả năng chống oxi hóa với nồng độ ức chế 50% (IC50) được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DDPH) là 1.70  0.07 mg/mL và phương pháp khử gốc tự do 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) là 4.45  0.10 mg/mL [13].  Tác dụng bảo vệ gan Năm 2008, từ dịch chiết trong vỏ thân cây Me rừng, S.K. El-Desouky và các cộng sự đã công bố trong dịch này có chứa các phenolic, flavonoid và tanin. Với một số thử nghiệm trên chuột, kết quả thu được cho thấy dịch chiết này có tác dụng chống rối loạn chức năng gan dưới tác dụng của ethanol [15]. Sau đó, năm 2010, một loạt các nghiên cứu của Sharma Bhawna và cộng sự đã công bố dịch chiết ethanol của cây Me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức năng gan với liều lượng 75 mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [12].  Tác dụng kháng virus Vào năm 2011, Yang Fei Xiang và các cộng sự đã cô lập được hợp chất 1,2,4,6‐tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐glucose (75), sau đó họ tiến hành một loạt các thử nghiệm với tác dụng chống virus HSV (Herpes Simplex virus) loại 1 và 2 (HSV- 1 và HSV-2). Kết quả cho thấy rằng hoạt chất này ngăn chặn được sự lây nhiễm virus trong tế bào ở giai đoạn đầu [26]. Năm 2017, He Yan và các cộng sự từ dịch chiết rễ Me rừng đã tìm ra được hai hợp chất chalconoid là emblirol A (21) và emblirol B (22) có tác dụng kháng virus khảm thuốc lá (TMV) gây bệnh khảm thuốc lá, với khả năng ức chế lần lượt ở 79,6% và 82,1% (nồng độ thử nghiệm 1mg/mL) [5].  Tác dụng gây độc tế bào ung thư Năm 2012, Xiaoli Liu cùng các cộng sự đã cô lập từ cao etyl acetat của quả Me rừng và thử nghiệm hoạt tính sinh học một số hợp chất một số hợp chất 4 tannin (41–52), flavonoid (70–73). Kết quả cho thấy các hoạt chất này có tác dụng gây độc tế bào ung thư vú. Đặc biệt, hợp chất isocorilagin (41) có tác dụng gây độc HELF (Human embryonic lung fibroblast cell) với nồng độ ức chế 50% (IC50) là 51,4 μg/mL [23]. Vào năm 2013, Xinxian Zhu cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu cho thấy trên cao chiết xuất giàu polyphenol từ cây Me rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) ở nồng độ tối ưu là 150 mg/mL [24]. 1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Theo một số nghiên cứu đã được công bố, phần lớn trên các bộ phận như lá, quả, cành và rễ của cây Me rừng chứa các nhóm hợp chất alkaloid, benzenoid, coumarin, phenolic, tanin, terpenoid, steroid, flavonoid, [4], [6], [16–21], [25–28]. Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn. Nhóm hợp chất Hợp chất Bộ phận cây Tài liệu tham khảo Alkaloid Zeatin (1) Quả [6] Zeatin nucleotide (2) [6] Zeatin riboside (3) [6] Benzenoid Chebulic acid (4) Quả [6] 3,6-Di-O-galloyl-β-O-D-glucopyranose (5) [6] Gluco-gallin (6) [6] Gallic acid (7) [4], [6] Ethyl gallate (8) [4], [6] Cinnamic acid (9) [4] 2-O-Galloyl L-malic acid (10) [26] 2-O-Galloyl mucic acid (11) [26] 2-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid (12) [26] 5-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid (13) [26] 5 3-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid (14) [26] 3,5-Di-O-galloyl1,4-lactone mucic acid (15) [26] 2-O-Galloylmethyl ester mucic acid (16) [26] 2-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (17) [26] 5-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (18) [26] 3-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (19) [26] 3,5-Di-O-galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (20) [26] Emblirol A (21) Rễ [5] Emblirol B (22) [5] Coumarin Ellagic acid (23) Quả [4], [6] Diterpenoid Giberellin A-1 (24) Quả [6] Giberellin A-3 (25) [6] Giberellin A-4 (26) [6] Giberellin A-7 (27) [6] Giberellin A-9 (28) [6] Sesqui- terpenoid Phyllaemblic acid (29) Rễ [27] Phyllaemblic acid methyl ester (30) [28] Phyllaemblic acid B (31) [28] Phyllaemblic acid C (32) [28] Phyllaemblicin D (33) [28] Norsesqui- terpenoid Phyllaemblicin A (34) Rễ [29] Phyllaemblicin B (35) [29] Phyllaemblicin C (36) [29] Phenolic Glycoside 2-Carboxylmethylphenol-1-O-β-D- glucopyranoside (37) Rễ [28] 2,6-Dimethoxy-4-(2- hydroxyethyl)phenol1-O-β-D- glucopyranoside (38) [28] Tannin Chebulanic acid (39) Quả [19] 6 Corilagin (40) [6] Isocorilagin (41) [21], [22] Chebulanin (42) [19] Chebulagic acid (43) [19] Mallotusinin (44) [20] Phyllaembinin A (45) [29] Phyllaembinin B (46) Lá, cành [29] Phyllaembinin C (47) [22] Phyllaembinin D (48) [29] Phyllaembinin E (49) [29] Phyllaembinin F (50) [29] Phyllanthunin (51) Quả [4] Geraniin (52) [22] Lipid và acid Stearic acid (53) Quả [4] Lauric acid (54) Steroid β-Sitosterol 3-O-β-D-glucoside (55) Lá, quả [8] Stigmasta-5,22-diene-3-O-β-D- glucopyranoside (56) [8] 5α,6β-Dihydroxysitosterol (57) Lá, cành [18] 5α,6β,7α-Trihydroxysitosterol (58) [18] 7α-Acetoxysitosterol (59) [18] β-Sitosterol (60) [18] 7α-Hydroxy-β-sitosterol (61) [18] 7β-Ethoxy-β-sitosterol (62) [18] 7-Ketositosterol (63) [18] Stigmast-4-ene-3-one (64) [18] Stigmast-4-ene-3,6-dione (65) [18] Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (66) [18] Stigmast-4-ene-3β,6α-diol (67) [18] 3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma st-5-ene-3β-ol (68) [18] 3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma st-5-ene-3β,7β-diol (69) [18] Flavonoid Kaempferol (70) Quả [21], [22] Quercetin (71) [6], [22] 7 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) R = H, (8) R = C2H5 (9) (10) (16) R1=R2=CH3, (18) R1=CH3, R2=H (12) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H (17) R1=H, R2=CH3, (11) R1=R2=H (19) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3 (14) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl (15) R1=R4=H, R2=R3=Gallo Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (72) [21] Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (73) [21], [22] Leucodelphinidin (74) [6] Rutin (75) [6] 8 (13) R1=H, (20) R1=Me (21) R=Me, (22) R=H (23) (24) R1=R2=OH (25) R=OH (29) R=H (26) R1=H, R2=OH (27) R=H (30) R=Me (28) R1=R2=H (31) R1=OH, R2=H (34) (32) R1=R2=H (33) R1=H, R2=Glu (35) (36) 9 (37) (38) (39 (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) 10 (51) (47) (48) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H (49) R1=Galloyl, R3=neoche, R2=R4=H (50) R1=Galloyl, R4=neoche, R2=R3=H (53) R=n-C17H35 (54) R=n-C11H23 11 (55) (56) (57) R=H (59) R1=H, R2=OCOCH3, (60) R1=H, R2=H (58) R=OH (61) R1=H, R2=OH, (62) R1=OC2H5, R2=H (63) (64) R1=R2=H (66) R1=H, R2=OH (65) (67) 12 (68) R1=H, R2=OOC(CH2)14CH3 (70) R=H (69) R1=OH, R2=OOC(CH2)14CH3 (71) R=OH (72) (73) (74) (75) Chú thích: Galloyl Neoche Glu =Glucopyranosyl Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica Linn. 13 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp 2.1.1. Hoá chất - Silica gel: silica gel 40–63μm, Merck và silica gel 230–400μm, Himedia dùng cho sắc kí cột. - Silica gel pha đảo, RP–18, Merck dùng cho sắc kí cột. - Sắc kí lớp mỏng loại DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254, Merck. - Sắc kí lớp mỏng loại 25DC, RP–18, Merck. - Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n–hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất. - Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng dung dịch H2SO4 20%, nung nóng bảng. 2.1.2. Thiết bị - Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. - Các cột sắc kí. - Máy cô quay chân không. - Bếp cách thuỷ. - Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. - Cân điện tử. 2.1.3. Phương pháp tiến hành  Phương pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP–18 và sắc kí lớp mỏng. Phát hiện vết chất hữu cơ có trên sắc kí lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%, nung nóng bảng mỏng. 14  Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh và tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Phòng 133, nhà A18, Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. Nguyên liệu 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được thu hái tại xã Tân Tiến, thị xã La Gi, tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014. Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt (khoa Sinh học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh) nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica Linn.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.3. Điều chế các loại cao Vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được phơi khô và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (16.2kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (350.5g). Cao ethanol thô được chiết lỏng–lỏng lần lượt với n–hexane, ethyl acetate thu được cao hexane (11.5g), cao ethyl acetate (85.4g) và cao còn lại (224.8g). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. 15 2.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Cao ethyl acetate (85.4g) được SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 70% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 9 phân đoạn (EA1 – 9) được trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA1 H:EA (95:5) 4.1 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát 2 EA2 H:EA (9:1) 5.4 Nhiều vết, kéo dài Đã khảo sát 3 EA3 H:EA (85:15) 12.6 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 4 EA4 EA:Me (99:1) 4.6 Nhiều vết Đã Khảo sát - Chiết lỏng – lỏng với dung môi n–hexane - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Dịch chiết còn lại Dịch chiết còn lại - Chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi - Ngâm dầm với ethanol - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Bột vỏ thân cây khô (16.2kg) Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng Cao n-hexane (11.5g) Cao ethanol thô (350.5g) Cao ethyl acetate (85.4g) 16 5 EA5 EA:Me (95:5) 6.2 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát 6 EA6 EA:Me (9:1) 11.2 Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát 7 EA7 EA:Me (8:2) 6.7 Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát 8 EA8 EA:Me (7:3) 10.5 Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát 9 EA9 Me (100%) 9.8 Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 2.1 Phân đoạn EA4 (4.6g) SKLM cho nhiều vết, hiện hình màu tím dưới đèn tử ngoại nên được chọn SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:Ac có độ phân cực tăng dần từ 75% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 8 phân đoạn (EA4.1 – EA4.8) được ghi lại ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA4.1 H:Ac (95:5) 437.8 Có vết trùng với vết glycoside của stigmasterol Chưa khảo sát 2 EA4.2 H:Ac (9:1) 323.9 Có vết trùng với vết của lupeol Chưa khảo sát 3 EA4.3 H:Ac (85:15) 554.7 Nhiều vết Khảo sát thu được hợp chất PA1 4 EA4.4 H:Ac (8:2) 449.9 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 EA4.5 H:Ac (7:3) 375.9 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 6 EA4.6 H:Ac (6:4) 536.6 3 vết Khảo sát thu được hợp 17 chất PEE04 7 EA4.7 EA:Me (95:5) 421.3 Nhiều vết Khảo sát thu được hợp chất PA2 8 EA4.8 EA:Me (9:1) 312.9 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 của bảng 2.2 Phân đoạn EA4.6 (536.6mg) bằng hệ dung môi C:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.6.1 – EA4.6.6). Kết quả được trình bày ở bảng 2.3. Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA4.6.1 C:Me (95:5) 68.6 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 2 EA4.6.2 C:Me (95:5) 81.9 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 3 EA4.6.3 C:Me (9:1) 161.7 Nhiều vết, tách rõ Tinh chế thu được hợp chất PEE04 4 EA4.6.4 C:Me (9:1) 121.3 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 5 EA4.6.5 C:Me (9:1) 52.0 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 6 EA4.6.6 C:Me (8:2) 49.6 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát Phân đoạn EA4.6.3 (161.7mg) của bảng 2.3 khi SKLM cho vết màu xanh và hai vết dơ kéo dài, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac thu được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PEE04 (5.8mg). 2.4.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 của bảng 2.2 Phân đoạn EA4.3 (554.7mg) bằng hệ dung môi H:Ac có độ phân cực tăng dần từ 20% đến 100% Ac. Tiến hành các bước tương tự như khi SKC phân đoạn 18 trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA4.3.1 – EA4.3.5). Kết quả được trình bày ở bảng 2.4. Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA4.3.1 H:Ac (9:1) 143.7 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 2 EA4.3.2 H:Ac (9:1) 121.3 Nhiều vết, tách rõ Tinh chế thu được hợp chất PA1 3 EA4.3.3 H:Ac (8:2) 85.8 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 4 EA4.3.4 H:Ac (8:2) 97.4 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 5 EA4.3.5 H:Ac (7:3) 105.9 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát Phân đoạn EA4.3.2 (121.3mg) của bảng 2.4 khi SKLM cho vết màu cam và nhiều vết dơ nhưng các vết tách rõ ràng nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi H:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng hình kim màu trắng, được kí hiệu là PA1 (5.9mg). 2.4.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 của bảng 2.2 Phân đoạn EA4.7 (421.3mg) bằng hệ dung môi C:Me có độ phân cực tăng dần từ 10% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.7.1 – EA4.7.6). Kết quả được trình bày ở bảng 2.5. Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA4.7.1 C:Me (95:5) 68.1 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 2 EA4.7.2 C:Me (95:5) 71.2 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 19 3 EA4.7.3 C:Me (9:1) 100.7 Nhiều vết, tách rõ Tinh chế thu được hợp chất PA2 4 EA4.7.4 C:Me (9:1) 69.8 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 5 EA4.7.5 C:Me (9:1) 59.9 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 6 EA4.7.6 C:Me (8:2) 51.1 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát Phân đoạn EA4.7.3 (100.7mg) của bảng 2.5 khi SKLM cho vết màu nâu, hiện hình UV và có bốn vết dơ không hiện hình dưới đèn tử ngoại nhưng tách rõ, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PA2 (10.9mg). Dưới đây là sơ đồ trình bày quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate. Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate 20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04 Hợp chất PEE04 (5.8mg) thu được từ phân đoạn EA4.6.3 có những đặc điểm như sau: - Dạng hình kim, màu trắng. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu xanh. (dung môi giải ly chloroform : acetone (9:1), Rf = 0.4) - Phổ 1H–NMR (CDCl3, phụ lục 1, bảng 3.1) δH (ppm): 5.88 (1H, s, H–22), 4.98 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21a) , 4.81 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21b), 4.18 (1H, brs, H–3), 2.78 (1H, m, H–17), 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H– 18). - Phổ 13C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 2, 2a và 3, bảng 3.1) δC (ppm): 174.5, 174.4 (>C=O, >C=C, C–20/23), 117.8 (=CH–, C–22), 16.7 (– CH3, C–19), 15.7 (–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.1. - Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 4, 5).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của một proton olefin tại δH 5.88 (1H, s, H–22). Phổ đồ còn thể hiện hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methylene gắn với oxygen tại δH 4.98 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21a) và 4.81 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21b), tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl –CH3 tại δH 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H–18). Ngoài ra, một số tín hiệu cộng hưởng của các proton methylene –CH2– và methine >CH– cũng xuất hiện trên phổ ở vùng từ trường cao. Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT và HSQC của hợp chất PEE04 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 23 carbon, gồm hai carbon methyl, mười carbon 21 methylene, năm carbon methine và sáu carbon bậc bốn. Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của vòng lactone không no 𝛼, 𝛽 ở δC 174.5 (>C=O, C–23), 174.4 (>C=C, C–20), 117.8 (=CH–, C–22), 73.5 (–CH2–O, C–21). Ngoài ra, phổ đồ còn có tín hiệu cộng hưởng của hai carbon tứ cấp mang oxygen tại δC 85.5 (C–14), 74.6 (C–5) và carbon oxymethine tại δC 68.1 (>CH–O–, C–3). Tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl bậc 4 tại δC 16.7 (–CH3, C–19) và 15.7 (–CH3, C–18). Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PEE04 được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với một nhóm C=O được gắn trong vòng lactone không no và ba nhóm hydroxyl. Tương quan HMBC của proton tại δH 2.78 (1H, m, H–17) với các carbon ở δC 174.4 (>C=, C–20), 117.8 (>C=CH–, C–22), 85.5 (>C<, C–14), 73.5 (–CH2–, C–21), 49.5 (>C<, C–13), 40.1 (–CH2–, C–12) và 26.8 (–CH2–, C– 16) giúp dự đoán vòng lactone không no gắn ở vị trí carbon C–17. Ngoài ra, tương quan HMBC từ proton methyl tại δH 0.88 (3H, s, H–18), proton tại δH 2.78 (1H, m, H–17) đến carbon mang oxygen tại δC 85.5 (C–14) xác định nhóm hydroxyl gắn tại C–14. Tương tự, tương quan HMBC từ proton H–3 (δH 4.18) và proton methyl H–19 (δH 0.95) đến C–5 (δC 74.6) giúp xác định nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C–5. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.1. Qua các dữ kiện phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất periplogenin [9] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PEE04 được đề nghị là periplogenin. 22 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEE04 và periplogenin Vị trí carbon PEE04 (CDCl3) Periplogenin (CDCl3) [9] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm) 1 24.8 24.9 2 28.0 27.9 3 4.18 (brs) 68.1 68.0 4 36.9 36.9 5 74.6 74.6 6 35.3 35.2 7 23.8 23.7 8 40.9 40.8 9 39.0 39.0 40.7 10 40.9 11 21.5 21.5 40.0 49.5 85.4 33.0 26.8 50.7 15.7 16.7 174.5 12 40.1 13 49.5 14 85.5 15 33.1 16 26.8 17 2.78 (m) 50.7 18 0.88 (s) 15.7 19 0.95 (s) 16.7 20 174.4* 21 4.98 (dd, 1.5, 8.5) 4.81 (dd, 1.0, 8.0) 73.5 73.5 22 5.88 (s) 117.8 117.7 174.5 23 174.5* Ghi chú: (*): tín hiệu có thể trao đổi lẫn nhau. 23 Periplogenin (PEE04) Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PEE04 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA1 Hợp chất PA1 (5.9mg) thu được từ phân đoạn EA4.3.2 có những đặc điểm như sau: - Dạng bột, màu trắng. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu vàng nâu. (dung môi giải ly n-hexane : chloroform (85:15), Rf = 0.45) - Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 6, bảng 3.2) δH (ppm): 6.70 (1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz, H–16), 5.36 (1H, dd, J = 2.5, 3.0 Hz, H–6), 3.52 (1H, m, H–3), 2.39 (3H, s, H–21), 1.04 (3H, s, H–19), 0.92 (3H, s, H–18). - Phổ 13C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 7 và 8, bảng 3.2) δC (ppm): 197.0 (>C=O, C–20), 155.6 (=C<, C–17), 144.5 (=CH–, C–16), 141.6 (=CCH–O–, C–3), 19.5 (–CH3, C–19), 15.9 (–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 9, 10 và 11).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefin ở δH 6.70 (1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz, H–16), 5.36 (1H, dd, J = 2.5, 24 3.0 Hz, H–6), tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen ở δH 3.52 (1H, m, H–3), tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methyl ketone tại 2.39 (3H, s, H–21) và tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl –CH3 ở δH 1.04 (3H, s, H–19), 0.92 (3H, s, H–18). Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT–NMR của hợp chất PA1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 21 carbon. Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của carbon ketone không no tại δC 197.0 (>C=O, C–20), bốn carbon olefin tại δC 155.6 (>C=, C–17), 144.5(=CH–, C–16), 141.6 (>C=, C–5), 121.2 (=CH–, C–6), carbon gắn oxygen tại δC 71.9 (>CH–O–, C–3), một nhóm methyl ketone tại δC 27.3 (–CH3, C–21) và hai nhóm methyl –CH3 tại δC 19.5 (–CH3, C–19), 15.9 (– CH3, C–18). Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PA1 được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với hai liên kết đôi, một nhóm hydroxyl và một nhóm ketone. Về phổ HMBC, nhận thấy proton của nhóm methyl ketone tại δH 2.39 (3H, s, H–21) cho tương quan HMBC đến carbon carbonyl tại δC 197.0 (>C=O, C–20) và carbon olefin tại δC 155.6 (=C<, C–17) giúp xác định nhóm methyl ketone gắn tại carbon C–17. Tương quan HMBC từ proton methyl ở δH 0.92 (3H, s, H–18) đến carbon olefin tại δC 155.6 (=C<, C–17) và tương quan từ proton olefin H–16 (δH 6.70, 1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz) đến carbon δC 197.0 (>C=O, C–20) giúp xác định nối đôi nằm tại vị trí carbon C16–17. Tương tự, proton methyl ở δH 1.04 (3H, s, H–19) tương quan HMBC đến carbon olefin ở δC141.6 (=C<, C–5) và proton olefin H–6 (δH 5.36, 1H, dd, J = 2.5, 3.0 Hz) tương quan đến carbon tại δC 30.4 (>CH–, C–8) giúp xác định nối đôi nằm tại vị trí carbon C5–6. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.2. Qua các dữ kiện của phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất 16-dehydropregnenolone [30] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PA1 được đề nghị là 16-dehydropregnenolone. 25 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA1 và 16-dehydropregnenolone Vị trí carbon PA1 (CDCl3) 16-dehydropregnenolone (CDCl3) [30] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) 1 37.3 37.2 2 31.8 31.7 3 3.52 (m) 71.9 3.58 71.8 4 42.5 42.4 5 141.6 14