Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-Glucosidase của cao hexan lá bình bát dây coccinia grandis (l.) j. voigt họ bầu bí (cucurbitaceae)

cũng như Việt Nam. Do vậy, đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của cao hexan lá Bình bát dây Coccinia grandis (L.) J. Voigt. Họ Bầu Bí (Cucurbitaceae)” là cơ sở khoa học ban đầu cho những nghiên cứu tiếp theo, nhằm sớm đưa cây Bình bát dây thành một vị thuốc có giá trị và đóng góp thêm những hiểu biết về thành phần Hóa – Thực vật của loài Coccinia grandis (L.), qua đó nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này. Mục tiêu của đề tài - Phân lập các chất tinh khiết từ lá Bình bát dây. - Xác định cấu trúc các chất đã phân lập được. - Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 3 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 BỆNH TIỂU ĐƯỜNG[6],[14],[30],[31] 1.1.1 Định nghĩa Bệnh tiểu đường, còn gọi là Đái tháo đường, là một nhóm bệnh lý chuyển hóa, đặc trưng bởi tăng đường huyết do sự khiếm khuyết tiết insulin hoặc suy giảm hoạt tính insulin. Tăng đường huyết có thể gây ra các biến chứng cấp tính, tình trạng dễ bị nhiễm trùng và về lâu dài, gây tổn thương, rối loạn và suy giảm chức năng của các cơ quan khác nhau. Bệnh tiểu đường đã được mô tả từ thời cổ Hy Lạp có nghĩa là mật ong. 1.1.2 Phân loại 1.1.2.1 Bệnh tiểu đường loại 1 Loại bệnh tiểu đường này thường ảnh hưởng đến trẻ em, nhưng cũng có thể xảy ra ở người lớn.Trong Bệnh tiểu đường loại 1, cơ thể không thể sản xuất insulin. Do hệ thống miễn dịch của cơ thể, nhầm lẫn đã tấn công các tế bào trong tuyến tuỵ làm cho tế bào tuyến tụy không còn sản xuất được insulin. Khi không có Insulin, tế bào sẽ không sử dụng được Glucose, do đó Glucose trong máu sẽ tăng rất cao. Bệnh nhân cần được tiêm insulin để sống. 1.1.2.2 Bệnh tiểu đường loại 2 Đây là loại tiểu đường thường gặp nhất.Thông thường, với Bệnh tiểu đường loại 2, trong cơ thể vẫn còn sản xuất insulin, nhưng các tế bào không thể sử dụng nó.Điều này được gọi là đề kháng insulin.Theo thời gian, đường huyết sẽ tăng cao trong máu.Béo phì và ít vận động làm tăng nguy cơ phát Bệnh tiểu đường loại 2. 4 Hình 1.1 Phân loại bệnh đái tháo đường 1.1.2.3 Bệnh tiểu đường thai kỳ Đây là dạng tiểu đường xảy ra ở một số phụ nữ mang thai và chấm dứt sau khi sanh. Có thể gây ra các vấn đề trong quá trình mang thai. Phụ nữ bị Bệnh tiểu đường thai kỳ có nhiều khả năng phát triển thành Bệnh tiểu đường loại 2 sau này. 1.1.3 Các biến chứng của bệnh tiểu đường Các biến chứng được chia ra theo thời gian xuất hiện và mức độ tiến triển. 1.1.3.1 Biến chứng cấp tính Các biến chứng cấp tính là những bệnh cảnh cấp cứu nội khoa, thường gặp và đe dọa tính mạng, thường gặp ở các nước đang phát triển, gồm các loại biến chứng sau: - Nhiễm toan ceton: Là biến chứng thường gặp điển hình ở bệnh nhân tiểu đường loại 1. Cơ chế sinh lý bệnh chủ yếu là do thiếu insulin và sự tăng tiết các 5 hormon đối kháng gây giảm sử dụng glucose, rối loạn chuyển hóa lipid và tăng tạo các thể cetone gây tình trạng toan máu và rối loạn nước, điện giải. - Tăng áp lực thẩm thấu: bệnh nhân đái tiểu đường không được điều trị sẽ mất rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều, gây ra tình trạng cô đặc máu làm áp lực thẩm thấu trong máu tăng cao. Biến chứng này thường gặp ở bệnh nhân tiểu đường loại 2 và có thể gây tử vong nếu không được điều trị. - Hạ đường huyết: bệnh nhân tiêm insulin sẽ gặp hiện tượng đường huyết hạ thấp quá mức do lượng insulin cần thiết cho cơ thể quá cao. Hạ đường huyết có thể được điều trị nhanh chóng bằng cách nạp đường vào cơ thể, ngược lại có thể dẫn tới ngất xỉu. -Tăng acid lactic trong máu: Là do sự tích tụ acid lactic trong cơ thể, nếu có quá nhiều acid lactic trong cơ thể thì độ cân bằng sẽ bị phá vỡ. Biến chứng này rất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu đường loại 2. 1.1.3.2 Biến chứng mãn tính Các thể bệnh tiểu đường đều gây ra nhiều biến chứng mãn tính đa dạng trên nhiều hệ cơ quan khác nhau.Đa số các biến chứng là hậu quả của tổn thương các tổ chức mạch máu và thần kinh. - Biến chứng tim mạch: Bệnh tiểu đường làm tăng nguy cơ bị nhồi máu cơ tim, đột quị, tai biến mạch máu não và mạch máu ngoại biên đưa đến đoạn chi. - Biến chứng mắt: Bệnh lý võng mạc do tiểu đường là nguyên nhân hàng đầu gây mù lào, giảm thị lực. -Biến chứng thận: Là biến chứng mãn tính thường gặp của tiểu đường, gây bệnh thận giai đoạn cuối, suy thận. Điều trị cần chạy thận nhân tạo hay thẩm phân phúc mạc để duy trì cuộc sống. -Biến chứng thần kinh: Biến chứng thần kinh ngoại biên do tiểu đường gây mất cảm giác ở chân, tay hay dị cảm, tê, gây đau nhứclà nguy cơ của nhiễm trùng chân đưa đến đoạn chi. 6 1.1.4 Phương pháp điều trị Bệnh tiểu đường 1.1.4.1 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường loại 1 Với bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường loại 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra hormon này. 1.1.4.2 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường loại 2 Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động. Chỉ bệnh nhân tiểu đường loại 2 mới dùng thuốc kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết.Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin. Thuốc sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm: • Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sufonylurea: Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid, Glipizide, Glinide; nhóm meglitinide: Prandin, Starlix; nhóm sitagliptin: Januvia, Onglyza. • Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm biguanide: metformin (Glucophage, Glucophge XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione (TZD)hay glitazone, (Rosiglitazone, pioglitazone ). • Thuốc ức chế men alpha-glucosidase(làm chậm hấp thu đường glucose từ ruột vào máu):Acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset). Ngày nay, việc sử dụng nhóm thuốc chất ức chế alpha-glucosidase đang được chú ý nhiều. Thuốc ức chế α-glucosidase sẽ làm chậm quá trình hấp thu carbohydrat ở đường tiêu hóa, nhờ đó làm giảm độ tăng đường máu sau bữa ăn. Chất đường trong ruột sẽ được hấp thụ chậm vào cơ thể và đường ngay sau khi ăn sẽ không tăng cao trong máu. Tuy nhiên, chúng lại có nhiều tác dụng phụ như gây đầy hơi và sôi bụng, đôi khi gặp đau bụng và tiêu chảy, vì thuốc này làm chậm quá trình tiêu hóa chất bột đường trong lòng ruột.Chính vì vậy, việc nghiên cứu thêm những chất ức chế enzyme α-glucosidase từ nhiều nguồn khác nhau là rất cần thiết, giúp cho sự điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 có nhiều lựa chọn tốt hơn. 7 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYM ΑLPHA–GLUCOSIDASE[1],[2],[7] 1.2.1 Sơ lược về enzym Enzym là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong mọi tế bào sinh vật.Trong cuộc sống, nhờ có enzym mà xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học với một hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Như vậy,enzym là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzym sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau.Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó. Hầu hết phản ứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym. Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Tác nhân ức chế là các phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng hoạt tính của enzym. 1.2.2 Chất ức chế enzym Là chất làm giảm hoạt tính của enzym do làm giảm ái lực của enzym với cơ chất hoặc làm enzym mất khả năng kết hợp với cơ chất. - Chất ức chế không đặc hiệu: Gây biến tính phân tử enzym, thậm chí phá hủy protein, tác dụng trên bất kì phân tử enzym nào, thường thì tác dụng đột ngột nhanh, không thuận nghịch. - Chất ức chế đặc hiệu: tác dụng vào những trung tâm phản ứng đặc biệt của từng enzym một. Tùy theo cách tác dụng chia làm hai nhóm: chất ức chế cạnh tranh và chất ức chế không cạnh tranh. 1.2.3 Giới thiệu enzym α–glucosidase Enzymeα-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase,maltase-glucoamylase, α−glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân). 8 1.2.4 Cơ chế hoạt động của enzym α–glucosidase Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp chất đường cho cơ thể.Sau khi vào cơ thể, những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzyme trong ruột non và các phân tử đường này được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể.Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid, màng tế bào ruột non lại tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường đơn rồi mới thẩm thấu vào máu. Chức năng chính của enzyme này là xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng ra α-D-glucose. Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzyme α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu. 1.2.5 Tác nhân ức chế enzym α–glucosidase Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩmĐã có rất nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzym α-glucosidase.Tuy nhiên, những tác nhân ức chế enzym α-glucosidase hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ.Vì vậy, việc tìm kiếm các chất có khả năng ức chế enzym α-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. 1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT[3],[10],[23],[24],[25],[27],[28],[29] 1.3.1 Đặc điểm cây Bình Bát Dây Tên khoa học: Coccinia grandis (L.) J. Voigt Tên Việt Nam: dây Mảnh Bát, dây Bình Bát Tên tiếng Anh: Ivy Gourd, Baby Water Melon, Baby Gourd. Tên Ấn Độ là Kanduri Họ: Bầu Bí (Cucurbitaceae). 9 1.3.1.1 Mô tả cây Bình bát dây Cây thảo nhẵn và mảnh, mọc leo cao, đôi khi dài tới 5m hay hơn. (Hình 1.2). Hình 1.2 Bình bát dây Lá hình 5 cạnh, có răng, rộng 5 - 8cm, hình tim ở gốc, rất nhẵn, chia 5 thùy hình tam giác, có mũi nhọn cứng; tua cuốn đơn (Hình 1.3). Hình 1.3 Lá bình bát dây 10 Hoa đực và hoa cái giống nhau, mọc đơn độc hay xếp lại hai cái một ở nách lá, có cuống dài 2cm. Quả hình trứng ngược hoặc thuôn, dài 5cm, rộng 2,5cm, khi chín có màu đỏ và thịt quả đỏ chứa nhiều hạt (Hình 1.4). Hình 1.4 Hoa và quả Bình bát dây 1.3.1.2 Phân bố, thu hái và chế biến Loài phân bố ở Ấn Ðộ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Malaixia... Mọc hoang trên nương rẫy, ở rào, lùm bụi từ vùng thấp tới vùng cao khắp nước ta. Có thể thu hái các bộ phận của cây quanh năm. Lá non và quả dùng làm rau ăn. 1.3.2 Tác dụng dược lý của Bình bát dây.[10],[11] Lá và thân chống co thắt và là chất long đàm.Quả xanh có vị rất đắng.Quả xanh được nhai để chữa bệnh loét trên lưỡi. Ở Ấn Ðộ dịch lá và rễ dùng trị bệnh tiểu đường.Người ta dùng cả cây để làm thuốc trị bệnh lậu. Lá dùng đắp ở ngoài da trị phát ban da, trị ghẻ lở, mụn nhọt, các vết thương và các vết cắn của rắn rết. Lá Bình bát dây cho thấy rằng nó ức chế hoạt động của enzyme glucose-6-phosphatase và có hoạt tính chống ô xi hoá. Ở Campuchia người ta dùng dịch chiết từ thân cây để trị bệnh đau giác mạc. 11 Ở Inđônêxia, người ta còn dùng cây làm thuốc trị bệnh đậu mùa, đau dạ dày và ruột. Dân gian dùng củ ngâm rượu bóp chữa sưng đau hay các khớp bị viêm. Trong dân gian, Bình bát dây còn dùng điều trị bệnh vàng da, bệnh viêm cuống phổi, bệnh vẩy nến, herpes mảng tròn, bệnh lây lan qua đường tình dục như bệnh giang mai, bệnh lậu (Nadkarni và Nadkarni, 1976; Dash, 1987; Jain và DeFilipps, 1991; Kapoor, 1990). Trong y học cổ truyền, lá bình bát dây có vị ngọt, tính mát. Tác dụng: Thanh nhiệt, mát phế, thanh vị, nhuận táo, sinh tân dịch, dưỡng âm, tiêu độc. Người bệnh tiểu đường hái lá non bình bát dây 100g, thịt cua 50g, gia vị vừa đủ nấu canh ăn thường xuyên. Có thể dùng ngọn lá non cả hoa quả rửa sạch ăn sống hoặc xay nước uống đều được. 1.3.3 Thành phần hóa học chung của Bình bát dây[10],[25] G. Singh và các cộng sự cô lập được hợp chất đầu tiên có trong Bình bát dây là C60-polyprenol C60-polyprenol Trong cây có các thành phần: saponin, flavonoid, sterol và alkaloid. Một số hợp chất phân lập từ cây cùng chi Coccinia indica: Ở rễ cây đã tìm thấy các chất: Lupeol, β-amyrin, β-sitosterol, Stigmast-7-en-3-one. Cấu trúc các hợp chất: 12 β-sitosterol β-amyrin Lupeol Stigmast-7-en-3-one Ở trong trái bình bát dây có chứa các chất: β-carotene, lycopene, cryptoxanthin, β–sitosterol, taraxerol và apo-6’-lycopenal. Cấu trúc các hợp chất: β–carotene cryptoxanthin apo-6’-lycopenal 13 Taraxerol 14 Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất Dung dịch đệm phosphat 0,01 M; pH = 7,0 Dung dịch enzym 0,2 U mL-1 Dung dịch nền p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid 3 mM Dung dịch Na2CO3 0,1 M Hạt silica gel cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm dùng cho pha thường của Scharlau, silica gel pha đảo ODS (0,040 – 0,063 mm), sephadex LH-20, bảng nhôm tráng sẵn với silica gel 60 F254 (Merck) dùng cho pha thường và Rp18 F254S (Merck) cho pha đảo. Dung môi: n- hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol 960, nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: dùng H2SO4/EtOH, FeCl3/EtOH. 2.2. Thiết bị Máy đo điểm nóng chảy Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance. Máy cô quay chân không Máy sấy. Máy đánh siêu âm. Máy hút chân không. Đèn UV soi tử ngoại bước sóng 254 – 365 nm hiệu UVITEC Cân phân tích AB 265 – S và cân kỹ thuật PB 602 – S. Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT. Dụng cụ thủy tinh : cột thủy tinh đường kính từ 2-5,5 cm, phễu lọc, bình sắc ký, ống nghiệm,ống đong, bình cô quay loại 100 ml, 500 ml,1000 ml, 15 2.3. Phương pháp tiến hành 2.3.1 Phương pháp cô lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp chiết xuất trong phòng thí nghiệm hóa học các hợp chất thiên nhiên để điều chế cao. Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thườngkết hợp SKLM. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH hay FeCl3/EtOH. 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS, Viện Hóa học, Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà Nội. 2.4. Nguyên liệu Mẫu thực vật được dùng trong nghiên cứu là lá bình bát dây được thu hái ở xã An Ngãi Trung, ấp An Lợi, huyện Ba Tri, Tỉnh Bến Tre. Thời gian thu hái: tháng 7 năm 2012. Mẫu lá cây Bình bát dây được bộ môn tài nguyên thực vật - Trung tâm sâm và dược liệu giám định tên khoa học. 2.5 Xử lí mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ 500C, rồi xay thành bột mịn.Đây là nguyên liệu dùng trong nghiên cứu. 16 Hình 2.1 lá Bình bát dây khô 2.6.Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 2.6.1 Điều chế mẫu thử Bột lá bình bát dây được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOH ở dạng sệt. Cao EtOH được hòa tan trong nước và chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan, ethyl acetace. Cô đuổi dung môi các dịch trích dưới áp suất kém thu được các cao tương ứng. Quá trình điều chế cao thô được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. 17 Sơ đồ 2.1 Điều chế mẫu thử hoạt tính Các cao chiết gồm cao hexan (BBD-C-H), cao etyl acetat (BBD-C-EA), cao nước (BBD-H2O) được đem thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 2.6.2 Nguyên tắc Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro được tiến hành theo phương pháp của Sigma Aldrich có cải biên. Để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase từ Cao EtOH Dịch Hexan Cao Hexan (20,05g) Dịch nước Dịch EA Cao EA (1,4g) Dịch nước Cao nước (27,25g) - Hòa tan với nước - Chiết lỏng-lỏng với Hexan - Tận trích bằng EtOH 960 - Lọc bỏ bã, cô giảm áp dịch chiết Thu hồi dung môi Chiết lỏng-lỏng với EA Thu hồi dung môi 18 Saccharomyces cerevisae, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-G) được sử dụng làm chất nền và bị enzym α-glucosidase thuỷ phân thành p-nitrophenol (PNP) và α-D-glucose. Xác định lượng p-nitrophenol sinh ra bằng cách đo độ hấp thu quang tại bước sóng 400-401 nm. Sơ đồ 2.2 Phản ứng thủy phân enzym α-glucosidase với cơ chất là p-Nitrophenyl- α-D-glucopyranoside Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỷ lệ thuận với PNP, vì vậy, dựa trên độ hấp thu của PNP ở bước sóng 400- 401 nm để xác định lượng glucose sinh ra. Khi mẫu thử nghiệm có sự ức chế α-glucosidase thì hàm lượng PNP tạo thành sẽ giảm. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế (mẫu thử) và mẫu không có ức chế (mẫu chứng âm)để xác định % ức chế. Xây dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50. 2.6.3 Cơ sở phương pháp Enzym α-glucosidase xúc tác cho quá trình chuyển hóa p-nitrophenyl-α- glucopyranosid thành α-glucose và p-nitrophenol có màu vàng nhạt, hấp thu cực đại tại 401 nm. Khi có mặt chất ức chế enzym, cường độ hấp thu của dung dịch sẽ giảm. Dựa vào độ hấp thu của dung dịch khi có và không có mẫu thử sẽ tính được phần trăm ức chế enzym α-glucosidase của mẫu. Dựng đường biểu diễn giữa phần 19 trăm ức chế và nồng độ chất ức chế, xác định giá trị IC50 - nồng độ của mẫu mà tại đó ức chế 50% enzym. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. 2.6.4 Quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase Mẫu được hòa tan trong đệm phosphat, thêm 100 µL enzym, lắc đều, ủ ở 37oC trong 5 phút, sau đó thêm 100 µL dung dịch nền, lắc đều, ủ ở 37oC trong 15 phút, cuối cùng thêm 1500 µL dung dịch Na2CO3 và đo mật độ quang tại bước sóng 401 nm. Tiến hành thử hoạt tính trên các mẫu thử vớ nhiều nồng độ khác nhau (100, 50, 25, 10 µg ml-1), chất đối chứng dương là acid tannic. Hình 2.2 Cấu trúc của Acid tannic (C76H52O46) 2.6.5 Cách tính kết quả Khả năng ức chế α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I %). Phần trăm ức chế (I %) được xác định theo công thức: I (%) = Ao - As Ao * 100% I (%): Phần trăm ức chế 20 Ao: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có chất ức chế As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chất ức chế IC50: Được định nghĩa là nồng độ của một mẫu thử nghiệm mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzym α-glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất.Mẫu có hoạt tính ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. 2.7Cô lập các chất từ lá bình bát dây 2.7.1 Điềuchế các cao thô Bột lá bình bát dây (1,4kg) được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOH ở dạng sệt. Cao EtOH được hòa tan trong nước và chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan, ethyl acetace. Cô đuổi dung môi các dịch trích dưới áp suất kém thu được các cao tương ứng. Quá trình điều chế cao thô được tóm tắt theosơ đồ 2.3. 21 Sơ đồ 2.3 Điều chế cao thô 2.7.2 Cô lập các chất từ cao hexan Trong luận văn này, chúng tôi chỉ khảo sát thành phần hóa học của cao n-hexan. Thực hiện sắc khí cột cao n-hexan (171g) trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexan (100%),hexan: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 1:1 và ethyl acetate (100%). Theo dõi quá trình sắc khí cột bằng Cao EtOH Dịch Hexan Cao Hexan (171g) Dịch nước Dịch EA Cao EA (9,8g) Dịch nước Cao nước (76,1g) - Hòa tan với nước - Chiết lỏng-lỏng với Hexan - Tận trích bằng EtOH 960 - Lọc bỏ bã, cô giảm áp dịch chiết Thu hồi dung môi Chiết lỏng-lỏng với EA Thu hồi dung môi 22 sắc khí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 7 phân đoạn, mã hóa thành BBD1-7. Quá trình thực hiện được tóm tắt trong sơ đồ 2.4. Sơ đồ 2.4 Quy trình điều chế các phân đoạn từ cao n-hexan Thực hiện sắc khí cột cao BBD2 (13,7g) trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexan:aceton với độ phân cực tăng dần (0-100%Ac). Theo dõi quá trình Cao hexan BBD1 (112g) BBD2 (13,70g) BBD4 (3,9g) BBD5 (5,24g) BBD3 (3,93 g) BBD7 (23,5g) BBD6 (10,16g) - Hòa với lượng nhỏ n-hexan, tẩm silica gel, cô đến bột tơi khô. - SKC silica gel với hệ dung môi H:EA (0-100%EA) - Cô cạn dịch trích. 23 sắc khí cột bằng sắc khí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 16 phân đoạn (BBD21-16). Kết quả được tóm tắt trong bảng 1. Bảng 2.1. Kết quả sắc ký cột cao BBD2(13,7g) Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Ghi chú 1 BBD21 Nhiều vết Không khảo sát 2 BBD22 Nhiều vết Không khảo sát 3 BBD23 Nhiều vết Không khảo sát 4 BBD24 Nhiều vết Không khảo sát 5 BBD25 Nhiều vết Không khảo sát 6 BBD26 Nhiều vết Không khảo sát 7 BBD27 Nhiều vết Không khảo sát 8 BBD28 Nhiều vết Không khảo sát 9 BBD29 Nhiều vết Không khảo sát 10 BBD210 Rõ vết Khảo sát 11 BBD211 Nhiều vết Không khảo sát 12 BBD212 Nhiều vết Không khảo sát 13 BBD213 Nhiều vết Không khảo sát 14 BBD214 Nhiều vết Không khảo sát 15 BBD215 Nhiều vết Không khảo sát 16 BBD216 Nhiều vết Không khảo sát Phân đoạn BBD210 tiếp tục SKC silica gel với dung môi rửa giải là H:Ac (50:1,30:1, 15:1, 5:1, 1:1) và 100% Ac, qua SKLM gom thành 7 đoạn (BBD2101- 7). Kết quả được tóm tắt trong Bảng 2. Bảng 2.2.Kết quả sắc khí cột silica gel cao BBD2.10 (567,4mg). Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (mg) 24 1 BBD2.10.1 Nhiều vết 51,6 2 BBD2.10.2 Nhiều vết 90 3 BBD2.10.3 Nhiều vết 79,2 4 BBD2.10.4 Rõ vết 105,2 5 BBD2.10.5 Nhiều vết 113,5 6 BBD2.10.5 Nhiều vết 50,9 7 BBD2.10.7 Nhiều vết 122,2 Từ phân đoạn BBD2.10.4 tiếp tục SKC silica gel với dung môi rửa giải là hexan: acetone có độ phân cực tăng dần (30:1, 20:1, 15:1, 5:1) qua SKLM gom thành 4 đoạn (BBD2101-4). Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3. Bảng 2.3. Kết quả khảo sát phân đoạn BBD2.10.4(105,2mg). Phân đoạn Tên mã hóa SKLM Khối lượng (mg) 1 BBD2.10.4.1 Nhiều vết 26,3 2 BBD2.10.4.2 Nhiều vết 37,9 3 BBD2.10.4.3 Vết tím chính Vết vàng 30,5 4 BBD2.10.4.4 Nhiều vết 4,4 Từ phân đoạn BBD2.10.4.3 tiếp tục SKC silical với hệ dung môi hexan : acetone (25:1) nhiều lần, thu được tinh thể trắng BBD-H1. Quá trình cô lập được tóm tắt theosơ đồ 5. Sơ đồ 2.5: Quy trình điều chế BBD-H1 từ phân đoạn BBD2.10 25 BBD2.10 (567,4mg) BBD2.10.1 (51,6mg) BBD2.10.2 (90mg) BBD2.10.4 (105,2mg) BBD2.10.5 (113,5mg) BBD2.10.3 (79,2mg) BBD2.10.7 (122,2mg) BBD2.10.6 (50,9mg) BBD2.10.4.1 (26,3mg) BBD2.10.4.2 (37,9mg) BBD2.10.4.3 (30,5mg) BBD2.10.4.4 (4,4mg) BBD-H1 (5mg) -SKC silica gel với hệ dung môi H:Ac (50:1, 30:1, 15:1, 5:1, 1:1) và 100% Ac. -Cô cạn dịch trích -SKC silica gel với hệ dung môi H:Ac (30:1, 20:1, 15:1, 5:1) và 100% Ac. -Cô cạn dịch trích -SKC silica gel (hệ 25H:1Ac) -Giải li hệ H:Ac=10:1 26 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao chiết được trình bày trong bảng Bảng 3.1 Kết quả IC50 của các mẫu cao Bình bát dây STT Tên mẫu IC50 (µg/mL) 1 BBD-C-H 10,98 2 BBD-C-EA 3,26 3 BBD-C-H2O 132,07 Nhận xét: Qua thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn với chất đối chứng dương acid tannic cho thấy: Cao etyl acetat có biểu hiện hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 là 3,26 µg/mL. Tiếp đến là cao hexan với giá trị IC50 là 10,98 µg/mL và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase yếu nhất là cao nước với giá trị IC50 là 132,07 µg/mL. Kết quả của thử nghiệm trên cao phân đoạn sẽ là tiền đề cho việc tìm ra các hợp chất có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase trong lá cây Bình bát dây. Từ kết quả trên cho thấy việc sử dụng cây Bình bát dây trong những bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường của dân gian là có cơ sở khoa học. Bước đầu mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng cây Bình bát dây trong các sản phẩm tân dược, tạo ra các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng chữa bệnh đái tháo đường, nhưng ít gây những tác dụng phụ không mong muốn đối với người sử dụng như những loại thuốc tổng hợp hiện nay. 27 3.2Xác định cấu trúc hợp chất[4],[5],[8] HỢP CHẤT BBD-H1 Hợp chất BBD-H1 thu được ở dạng tinh thể màu trắng, hiện màu tím với thuốc thử H2SO4/EtOH. Phổ 1H-NMR (CDCl3, δ ppm, 500MHz) phụ lục 1.