Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây Xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum)

kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẻ xãy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để 12 phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh. - Kháng nguyên H: Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Kháng nguyên H có bản chất là protein, dể bị phá huỷ ở 1000C hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xãy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thàng không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. - Kháng nguyên K: Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt. kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.typhy). Kháng nguyên K, nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra được khang nguyên này. 2.2.1.8. Phân loại Vấn đề phân loại của Enterobacteriaceae đã từng được tranh luận rất nhiều. ngoài cách phân loại của Bergey có ba cách phân loại khác: Cách phân loại của tiểu ban về Enterobacteriaceae thuộc Hội Vi sinh học quốc tế, năm 1958, chia họ này thành 12 giống. 13 Cách phân loại của Kauffmann, năm 1966, chia Enterobateriaceae thành 3 tộc và 12 giống. Cách phân loại của Ewing, năm 1986, chia Enterobacteriaceae thành 8 tộc và 14 giống.Nhiều tác giả cho rằng cách phân loại của Ewing là hợp lý hơn vì nó giúp ích nhiều trong chuẩn đoán vi sinh vật và trong nghiên cứu dịch tể học. Dưới đây là sơ đồ phân loại họ Enterobacteriaceae của Ewing. Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột Tộc I: Escherichieae Giống I: Escherichia. Giống II: Shigella. Tộc IV: Citrobactereae Giống I: Citrobacter Tộc VII: Yersinieae Giống I: Yersinia Tộc II: Edwardsielleae Giống I: Edwardsiella Tộc V: klebsielleae Giống I: Klebsiella Giống II: Enterobacter Giống III: Hafnia Giống IV: Serratia Tộc VIII: Erwinieae Giống I: Erwinia Tộc III: Salmonelleae Giống I: Samonella Tộc VI: Proteeae Giống I: Proteus Giống II: Morganella Giống III: Providencia 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiểu cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp… Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. Bệnh lý ở các mô, các cơ quan khác nhau có thể là hậu quả của bệnh lý đường tiêu hoá, có thể song hành với bệnh lý ở đường tiêu hóa, nhưng cũng có thể chỉ biểu 14 hiện bệnh lý ở một cơ quan nào đó trong khi đường tiêu hóa vẫn hoàn toàn bình thường. 2.3. Salmonella [3],[12],[27] Mặc dù hiện nay người ta đã biết đến mấy chục loài đến hàng nghìn typ huyết thanh khác nhau thuộc giống Salmonella, S.typhi vẫn là loài được quan tâm nhiều nhất không những bởi vai trò gây bệnh của nó mà vì nó gắn liền với những mốc lịch sử quan trọng trong quá trình nghiên cứu về Salmonella nói chung và bệnh thương hàn nói riêng. Bệnh thương hàn đã được biết đến từ rất lâu. Y văn thế giới ghi nhận sự mô tả về bệnh này lần đầu tiên vào năm 1820 của Bretoneau. Năm 1880, Grafky đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản làm từ hạch của bệnh nhân bị chết vì bệnh thương hàn và ông cũng là người đầu tiên phân lập được S.typhi vào năm 1884. Năm 1896, Widal chứng minh rằng huyết thanh của bệnh nhân thương hàn có khả năng ngưng kết S.typi. Đây là cơ sở cho phương pháp chuẩn đoán huyết thanh học. Năm 1917, Felix đã mô tả kháng nguyên thân và kháng nguyên lông của Salmonella, đặt cơ sở cho phương pháp phân tích kháng nguyên của vi khuẩn. Năm 1935, Reilly đã nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của bệnh thương hàn. Ông chứng minh rằng hệ thần kinh thực vật có vai trò trong việc gây ra những tổn thương ở ruột. 2.3.1. Đặc điểm sinh học 2.3.1.1. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 μm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), rất di động, không có vỏ, không sinh bào tử. 15 Hình 2.2: Salmonella typhimurium 2.3.1.2. Tính chất nuôi cấy Có khả năng phát triển trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Rất dễ nuôi cấy, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ 60C – 420C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9. Trên môi trường lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ môi trường đục đều. Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, thường không màu hoăc màu trắng sáng. Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng; trên môi trường Istrati khuẩn lạc có màu xanh. 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học Không lên men lactose (loài S.arizona lên men lactose chậm). Lên men đường glucose thường sinh hơi (trừ S. typhi). Sử dụng được citrat ở môi trường Simmons (trừ S. typhi và S. paratyphiA). Catalase (+), oxidase (-), urease (-). Lysin decarboboxylase (+) (trừ S. paratyphi A). ONPG (-), RM (+), VP (-). H2S (-) (một số chủng trong loài S. paratyphi A có khả năng sinh H2S). 2.3.1.4. Sức đề kháng Có thể tồn tại trong nước 2 – 3 tuần, trong phân 2 – 3 tháng. Trong nước đá có thể sống được 2 – 3 tháng. 16 Bị chết ở nhiệt độ 500C trong vòng 1 giờ hoặc 1000C trong vòng 5 phút. Với các thuốc sát khuẩn thông thường, trực khuẩn Salmonella dễ bị tiêu diệt. 2.3.1.5. Độc tố - Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoăc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Peyer bị phù nề, đôi khi hoại tử. Nội độc tố có vai trò quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella. - Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện nuôi cấy invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố. 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên Kháng nguyên O: Hiện nay đã tìm thấy gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Dựa trên kháng nguyên O người ta chia Salmonella thành các nhóm A.B,C,D… Mỗi nhóm mang một yếu tố kháng nguyên đặc hiệu nhóm. Mỗi loài mang một yếu tố khác nhau, những yếu tố đó cấu tạo thành công thức O của từng loài. Kháng nguyên H: Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. gallinarum và S. pullorum. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những loài Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động. Những loài có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép khi nuôi cấy chúng trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với kháng nguyên H thì chúng vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Dựa vào kháng nguyên H người ta chia Salmonella thành các serotyp (typ huyết thanh). Kháng nguyên H lai được chia thành hai phase: phase 1 đặc hiệu và phase 2 không đặc hiệu. Thường các chủng Salmonella đều có cả hai phase này (trừ S. typhi và S. paratyphi). Kháng nguyên K: Kháng nguyên K chỉ có ở S. typhy và S. paratyphi C và còn được gọi là kháng nguyên Vi (Virulence). Kháng nguyên Vi dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường. Tuy nhiên kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, trong trường hợp này vi khuẩn sẽ không ngưng kết mặc 17 dù trộn với kháng huyết thanh O đặc hiệu. Muốn cho hiện tượng ngưng kết O xuất hiện, cần phải làm nóng huyền dịch vi khuẩn (1000C trong 20 phút) để tách kháng nguyên K ra khỏi tế bào. Kháng nguyên Vi không tham gia trong việc gây bệnh. 2.3.1.7. Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhóm, các loài và các typ huyết thanh. Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. typhy và các S. paratyphi A,B,C (typhoid = bệnh thương hàn), hoặc theo vật chủ như S. typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột). Về sau, người ta thấy rằng, một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập ở nhiều loài động vật khác nhau. Vì những lý do đó, cuối cùng người ta gọi các loài mới phát hiện đuợc theo tên địa phương ở đó nó được phân lập như S. teheran, S. congo, S. london. Đến nay người ta đã phát hiện được trên 1500 typ huyết thanh Salmonella. 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh Tùy theo từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người, chỉ gây bệnh cho động vật, nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho động vật. Những loài Salmonella có khả năng gây bệnh cho người được quan tâm nhiều hơn cả là: S. typhi: Loài này chỉ gây bệnh cho người, nó là vi khuẩn quan trong nhất trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn. S. paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh cho người. Là căn nguyên gây bệnh thương hàn, ở nước ta, tỷ lệ phân lập được chỉ đứng sau S. typhi. S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng có thể gây bệnh cho động vật. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ phân lập được vi khuẩn này cao hơn ở nước ta. S. paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây viêm dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết. Thường gặp ở các nước Đông Nam Á. S. typhimurium và S. enteritidis: vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có khả năng gây bệnh cho động vật. Có thể gặp ở nhiều nước khác nhau trên thế giới. Chúng là nguyên nhân chủ yếu của nhiểm độc thức ăn do Salmonella. 18 S. choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thƣơng hàn Bệnh thương hàn do S. typhi và S. paratyphi A, B, C gây ra. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn. Số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh khoảng 105 – 107. Sau khi vào ống tiêu hoá, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm sàn bắt đầu xuất hiện. Từ máu, vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác. Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân. Một số vi khuẩn đi đến thận và được đào thải qua nước tiểu. Tới mảng payer, vi khuẩn tiếp tục nhân lên. Vi khuẩn thương hàn gây bện bằng nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây ra thủng ruột, vị trí tồn thương thường ở các mảng payer. Đây là biến chứng thường găp do bệnh nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu đi lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn toàn thân nhiệt tăng cao, sốt. Thân nhiệt tăng nhưng nhịp tim không tăng. Bệnh nhân thường có dấu hiệu li bì, có thể hôn mê, trụy tim mạch, có thể dẫn đến tử vong. Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã hết các triệu chứng lâm sàng, khoảng 5% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân do vi khuẩn vẫn tồn tại ở túi mật. Tình trạng này có thể kéo dài nhiêu năm. Họ trở thành nguồn truyền bệnh rất nguy hiểm. 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn Bệnh xãy ra do ăn phải thực phẩm nhiễm Salmonella, thường do ăn thức ăn không được bảo quản tốt. Thời gian ủ bệnh thường vào khoảng 10 đến 48 giờ (đây là điểm khác biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ khoảng vài ba giờ). Sau thời gian ủ bệnh bệnh nhân sốt, nôn và tiêu chảy. Ở người lớn rối loạn tiêu hóa thường kéo dài từ 2 đến 5 ngày rồi tự khỏi. Một số ít bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài trong nhiều tháng. 19 Một số loài Salmonella chỉ gây nhiễm độc thức ăn ở người lớn lại có thể gây ra tình trạng bệnh lý rất nặng ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh. Bệnh nhi có thể nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm xương. Có thể gây ra các vụ dich ở các khoa nhi. 2.3.3. Miễn dịch Sau khi mắc bệnh thương hàn, trong huyết thanh bệnh nhân có các kháng thể chống lại kháng nguyên O, H (và cả kháng nguyên Vi đối với những bệnh do S. typhy và S. paratyphy C). Tuy nhiên ngày nay người ta nhận thấy vai trò bảo vệ của kháng thể trong huyết thanh không đầy đủ. Kháng thể lớp IgA trong dich tiết tại chỗ có vai trò rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ. Người ta cũng có những bằng chứng về miễn dịch qua trung gian tế bào chống Salmonella. Tế bào lympho ở tổ chức bạch huyết tại ruột có khả năng đề kháng tự nhiên đối với Salmonella. 2.3.4. Chuẩn đoán vi sinh vật bệnh thƣơng hàn 2.3.4.1 Cấy máu Cấy máu được tiến hành lúc bệnh nhân đang sốt cao, cần lấy máu trước khi điều trị kháng sinh. Lấy 5 – 10 ml máu tĩnh mạch ngay vào tuần đầu của bệnh cấy vào bình canh thang (thường dùng canh thang có mật bò), ủ ở 370C, theo dõi hàng ngày. Vi khuẩn thương hàn thường mọc sau 24 đến 48 giờ, nếu chưa mọc thì tiếp tục theo dõi tiếp 2 tuần lễ, nếu không mọc thì mới kết luận âm tính.. Khi vi khuẩn mọc, môi trường đục và có váng thì nhuộm Gram, kiểm tra hình thể và tính chất bắt màu. Nếu là Gram (-) thì cấy chuyển sang môi trường chọn lọc và xác định tính chất sinh vật hoá học. Cuối cùng xác định công thức kháng nguyên bằng kháng huyết thanh mẫu. Nếu chưa điều trị bằng kháng sinh, ở tuần lễ đầu, tỉ lệ cấy máu dương tính tới 90%; tuần thứ 2 khoảng 70 – 80%; tuần thứ 3 khoảng 40 – 60%. Cấy máu có giá trị nhất trong chuẩn đoán. Nếu cấy máu dương tính cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh thương hàn. 2.3.4.2. Cấy phân Nên cấy phân vào môi trường tăng sinh để Salmonella phát triển nhiều và kìm hãm các vi khuẩn khác. Sau đó cấy chuyển vào môi trường có tinh ức chế chọn lọc. 20 Môi trường phân lập thích hợp nhất là SS (Salmonella – Shigella), ở nước ta các phòng xét nghiệm thường dùng môi trường Endo hoặc môi trường Istrati vì nó dễ sản xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm và cho kết quả tốt. Chỉ riêng cấy phân, dù phân lập được vi khuẩn cũng không cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh vì người lành cũng có thể mang vi khuẩn thương hàn. Cấy phân ngoài mục đích chuẩn đoán cón có giá trị kiểm tra sau khi bệnh nhân đã hết các dấu hiệu lâm sàn có còn tiếp tục đào thải vi khuẩn nữa hay không. Cấy phân còn là phương pháp để phát hiện người lành mang vi khuẩn. 2.3.4.3. Chuẩn đoán gián tiếp Tiến hành phản ứng Widal để xác định kháng thể trong huyết thanh. Sau khi nhiễm Salmonella 7 – 10 ngày, trong máu sẽ xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên O, sau 12 – 14 ngày xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên H. Kháng thể tồn tại trong máu trung bình là 3 tháng đối với kháng thể O và 1 - 2 năm đối với kháng thể H. Phản ứng Widal là phản ứng ngưng kết. Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng dần thành nhiều độ đậm khác nhau, trộn riêng biệt với kháng nguyên O và kháng nguyên H để xác định hiệu giá kháng thể O. Trong giai đoạn đầu có thể chỉ thấy kháng thể O. Đến giai đoạn toàn phát sẽ thấy cả kháng thể O và H. Việc phân tích kết quả xét nghiệm ở lần thứ nhất nhiều khi rất khó và thường không cho phép ta kết luận chắc chắn. Phản ứng cần được làm hai lần để xác định động lực kháng thể: lần đầu làm ở tuần thứ nhất, lần hai làm ở tuần thứ hai của bệnh. Nếu động lực kháng thể cao thì mới cho phép chuẩn đoán chắc chắn. Nhược điểm của phương pháp chuẩn đoán gián tiếp là cho kết quả chậm. 2.3.5. Phòng bệnh 2.3.5.1. Phƣơng pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu Những biện pháp chủ yếu là: Thực hiện vệ sinh ăn uống: Ăn chín, uống nước đã được đun sôi, rửa tay trước khi ăn, diệt ruồi. Cung cấp và sử dụng nước sạch. Quản lý, xử lý phân 21 Phát hiện người lành mang vi khuẩn, đặc biệt lưu ý những người liên quan trực tiếp với ăn uống tập thể, như những người cấp dưỡng ở các cơ quan, những người chế biến thức ăn, phục vụ ở các cửa hàng ăn uống. Chuẩn đoán sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của bệnh nhân. Đối với xúc vật bị bệnh: chữa triệt để hoặc giết. 2.3.5.2. Phƣơng pháp phòng bệnh đặc hiệu Trước đây người ta xử dụng rộng rãi vacxin TAB. Đây là loại vacxin chết, 1 ml chứa khoảng 1 tỉ S. typhi, 250 triệu S. paratyphi A và 250 triệu S. paratyphi B. Vacxin TAB được đưa vào cơ thể qua đường tiêm, hiệu lực không cao và chỉ duy trì được 6 tháng. Sau đó người ta sản xuất loại vacxin chứa kháng nguyên Vi của S. typhi, đưa vào cơ thể bằng đường tiêm, có hiệu lực bảo vệ trên 70 % với liều 25 μg. Ngày nay, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang nghiên cứu loại vacxin sống, giảm độc lực, đưa vào cơ thể bằng đường uống để kích thích miễn dịch tiết tại ruột. Loại vacxin này đã được thử nghiệm ở một số nước nhưng kết quả đã được công bố khác nhau khá nhiều. 2.3.6. Điều trị Những kháng sinh thường được dùng để điều trị Salmonella là chloramphenicol và ampicillin. Trước đây chloramphenicol là loại kháng sinh có hiệu lực gần như tuyệt đối trong điều trị các Salmonella nói chung và các Salmonella gây bệnh thương hàn nói riêng. Tuy nhiên hiện nay tỷ lệ Salmonella kháng thuốc ngày càng tăng. Ở nước ta, những năm gần đây đã xuất hiện nhiều vụ dịch thương hàn do vi khuẩn kháng thuốc gây nên. Theo kết quả của Chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh công bố năm 1999, đã có tới 40 % S. typhi (phân lập năm 1998) kháng lại ampicillin và 62 % kháng lại chloramphenicol. 2.4. Escherichia coli [3],[12],[29] Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Giống Escherichia được chọn là đại biểu điển hình của họ vi khuẩn đường ruột. Giống này gồm nhiều loài như E. coli, E. adecarbonxylase, E. blattae, E. fergusonii, E. hermanii và E. vulneris; 22 trong số đó, E. coli có vai trò quan trọng nhất và được chọn làm đại biểu điển hình của giống Escherichia. 2.4.1. Đặc điểm sinh học 2.4.1.1. Hình thái E. coli là trực khuẩn Gram (-), hình que thẳng. Kích thước dài, ngắn khác nhau, trung bình từ 2 – 3 x 0,5 μm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài (6 – 8 μm). Rất ít chủng E. coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động. Hình 2.3: Escherichia coli 2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi. Phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Phát triển được ở nhiệt độ từ 5 – 400C, phát triển tốt nhất ở 37 0 C, pH 7 – 7,2. Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 – 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những ngày sau dưới đáy ống có thể thấy cặn. Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10 giờ, dùng kính lúp có thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5 mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M. 23 2.4.1.3. Tính chất hoá sinh Lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose (trừ E. coli loại EIEC), glucose, manitol, ramnose…Người ta dựa vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt E. coli với các loài vi khuẩn đường ruột khác ONPG (+), urease (-), H2S (-), LDC (+).ff Nghiệm pháp IMVIC: I+ M+ V- I- C-, indol (+), methyl red (+), Vosges Proskauer (-), lên men đường inositol (-), citrat simmons (-). 2.4.1.4. Sức đề kháng E. coli có sức đề kháng yếu. Các chất sát khuẩn thông thường như nước Javel 1/200; phenol 1/200 giết chết vi khuẩn sau 2 – 4 phút. Nhiệt độ 550C giết chết vi khuẩn sau 1 giờ và nhiệt độ 600C giết chết vi khuẩn sau 30 phút. 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên Cấu tạo kháng nguyên của E. coli rất phức tạp. E.coli có đủ ba loại kháng nguyên O, H, K. Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân. Hiện nay người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E. coli. Kháng nguyên K: Là kháng nguyên bề mặt. Khoảng 100 loại yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và chia làm 3 loại dựa vào độ nhạy cảm của của kháng nguyên này với nhiệt độ: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử. Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông. Hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định. 2.4.1.6. Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli được chia thành các typ huyết thanh. Với sự tổng hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều typ huyết thanh 24 khác nhau. Mỗi typ huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B). Dựa vào tính chất gây bệnh, người ta chia E. coli thành các loại: - EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E. coli ): E. coli xâm nhập đường ruột. - EAEC (Enteroadherent E. coli): E. coli bám dính đường ruột. - EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây chảy máu đường ruột. 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh Trong đường tiêu hóa E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80 %). Tuy nhiên, E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong số các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương. Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988 – 1994) thì E. coli đứng hàng thứ hai (sau S. aureus) về tỷ lệ phân lập được từ các loại bệnh phẩm ở nước ta. Những typ huyết thanh thường găp trên lâm sàn là: O111B4, O86B57, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12. Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tuỳ loài: ETEC: Gây bệnh do ngoại độc tố LT, là loại độc tố ruột giống độc tố ruột của V. cholerae. Độc tố này bám vào thụ thể ở ruột, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và ion Cl-. EIEC: Gây bệnh do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EAEC: Gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột. Cơ chế của hiện tượng này chưa được sáng tỏ. EHEC: Cơ chế cũng chưa hoàn toàn rõ ràng, nhưng người ta đã xác định được một loại độc tố có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động giống S. shiga. Trong quá trình gây bệnh, EHEC làm tổn thương xuất huyết ở ruột. EPEC: Cơ chế gây bệnh chưa được biết rõ. 25 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp Bệnh phẩm khác nhau tùy từng bệnh: - Phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hoá. - Nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu. - Máu nếu là nhiễm khuẩn máu… Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy. Phương pháp chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm được nhân lên trên môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên thạch thường. Máu được cấy vào canh thang. Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa học và định loại bằng kháng huyết thanh mẫu. Đối với viêm màng não, hiện nay người ta còn tiến hành phương pháp chuẩn đoán nhanh và đặc hiệu bằng kỹ thuật ngưng kết lactex để xác định kháng nguyên trong dịch não tủy. 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp