Khóa luận Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

khuẩn. Do tính chất tương đối đặc biệt như vậy mà màng cellulose vi khuẩn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực các như: thực phẩm, công nghiệp, mĩ phẩm và đặc biệt là y học [3, 4, 8]. Việc nghiên cứu và ứng dụng VLC trong nước đang được quan tâm và đã có được một số thành tựu nhất định. VLC có tẩm dầu mù u được thử nghiệm trên thỏ gây bỏng làm màng trị bỏng giúp vết thương mau lành và ngăn sự nhiễm trùng đó là kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Ngoài ra, VLC còn được ứng dụng trong: phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9]. Diclofenac là dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid. Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh [5]. Diclofenac Natri được đánh giá là có tác động giảm đau mạnh trong những cơn đau từ trung bình cho đến trầm trọng, khi viêm do chấn thương, do can thiệp phẫu thuật, thuốc nhanh chóng làm giảm chứng đau tự nhiên, đau do vận động, và giảm phù nề do viêm và phù nề ở vết thương [5]. Tuy nhiên, khi dùng Diclofenac Natri cũng gây các tác dụng không mong muốn như đau đầu, đau vùng thượng vị, chán ăn, khó tiêu, trướng bụng, bồn chồn, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, gan tăng các transaminase, ù tai; thỉnh thoảng có gặp trường hợp phù, dị ừng, đau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, 2 làm ổ loét tiến triển, nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu;[1,2]. Do đó, với mục tiêu tạo ra màng cellulose vi khuẩn dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng G. xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, kháng lại tác động của acid và khả dụng sinh học của vật liệu cellulose trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 3. Nội dung nghiên cứu Tạo và thu VLC tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường môi trường nước vo gạo. Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong sự giải phóng thuốc. Nghiên cứu tiềm năng của môi trường nuôi cấy trong nước vo gạo. Nghiên cứu ứng dụng của VLC nhằm khắc phục hạn chế của thuốc Diclofenac Natri để mang lại lợi ích cho việc điều trị. Đánh giá những ưu nhược điểm khả năng giải phóng thuốc của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc khác. 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo ra hệ thống giải phóng Diclofenac Natri kéo dài từ màng cellulose vi khuẩn. 5. Tính mới của đề tài Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclfenac Natric từ vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu cellulose nạp thuốc. 4 PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus Vật liệu cellulose là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, chủng Gluconacetobacter xylinus. Vật liệu cellulose cấu tạo bởi những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose mạch thẳng. Theo AJ. Brown (1886), vật liệu cellulose gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [12]. Vật liệu cellulose được tạo từ Gluconacetobacter xylinus có cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học lớn, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu,... Vì vậy, vật liệu cellulose được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, môi trường, dầu mỏ, mỹ phẩm, da nhân tạo, y học,...Vật liệu cellulose được sử dụng như hệ thống để phân phối thuốc [3, 4, 8]. Ngoài ra, Vật liệu cellulose còn được ứng dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9]. Amin và cộng sự đã báo cáo việc sử dụng vật liệu cellulose làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy vật liệu cellulose giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc [11]. Ở Brazil, Vật liệu cellulose ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thương [9]. Vật liệu cellulose được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với nhiều ứng dụng và đang được nghiên cứu, sản xuất hàng loạt. 5 1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri Diclofenac là một dẫn chất của acid 2-amino benzen acetic, có sinh khả dụng thấp do kém nước (độ tan trong nước ở 25oc khoảng 0.06 mM) [17]. Vì vậy dạng được dùng thường là muối của nó (có độ tan lớn hơn, ổn định hơn), đặc biệt muối được sử dụng nhiều là muối Natri Diclofenac [5]. 1.1.2.1. Công thức hoá học Tên khoa học: [2- (2,6- dicloro anilino) phenyl] acetat natri. Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2. Khối lượng phân tử: 318,13 [5]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri 1.1.2.2. Tính chất hóa lý Diclofenac là một axit yếu, dạng tồn tại bột kết tinh hoặc tinh thể màu trắng đến trắng hơi vàng. Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong axit acetic, thực tế không tan trong ether, hơi tan trong nước độ tan phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, và các chất có mặt trong môi trường hoà tan [5]. 1.1.2.3. Độ ổn định Trong cấu trúc phân tử, Natri Diclofenac có nhóm chức amin bậc hai dễ bị oxy hoá, nhóm phenyl acetat dễ bị thuỷ phân đặc biệt dưới tác động của lực cơ học, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Tuy nhiên nếu tồn tại ở dạng rắn thì tương đối bền. 6 1.1.2.4. Hấp thụ Diclofenac Natri được hấp thụ nhanh. Diclofenac Natri hấp thụ qua đường tiêu hoá gần như là hoàn toàn, hấp thụ trong huyết tương đạt nồng độ tối đa khoảng 1 đến 4 giờ sau khi uống. Diclofenac natri cũng được hấp thu qua da và niêm mạc[5]. 1.1.2.5. Tác dụng và chỉ định Natri Diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do có khả năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian gây đau, viêm, sốt. Diclofenac Natri có hoạt tính chống viêm mạnh hơn aspirin, nhưng tương đương với indomethacin [5]. Diclofenac Natri chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp: viêm khớp dạng thấp, viêm gân, viêm bao hoạt dịch,... với liều duy trì hàng ngày khoảng 75 đến 100mg, chia 3 đến 4 lần. Với thuốc TDKD, chỉ cần uống 1 viên 75 mg, hoặc 100 mg trong một ngày, uống khi no [5]. 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam đã và đang quan tâm đến việc nghiên cứu tạo VLC. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu VLC mới dừng lại ở bước đầu thí nghiệm. Nghiên cứu VLC làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn còn là một hướng nghiên cứu mới. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng màng cellulose vi khuẩn trong hệ thống phân phối thuốc (năm 2014) [11] Nghiên cứu của Wei B. Và CS (2011) màng cellulose vi khuẩn thu được sau khi ngâm trong benzalkkonium chloride có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis [19]. 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng 2.1.1. Đối tượng Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc 1 Diclofenac Natri dạng tinh khiết Trung Quốc 2 Metanol Trung Quốc 3 D-Glucose Trung Quốc 4 Pepton European Union 5 Amoni sunfat ((NH4)2SO4 ) Trung Quốc 6 Diamoni photphat (KH2PO4 ) Trung Quốc 7 Axit axetic Việt Nam 8 Nước vo gạo VNCKH&UD 9 vi khuẩn G. xylinum Nhật Bản 10 NaOH Việt Nam 11 HCL Việt Nam 12 KCL Việt Nam 13 H3PO4 Việt Nam 8 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 2.1.3.1. Thiết bị Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Thiết bị 1 Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ) 2 Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) 3 Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA 4 Buồng cấy vô trùng (Haraeus) 5 Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) 6 Bể ổn nhiệt 1013, bể rửa siêu âm TCP 280 7 Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức) 8 Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh) 9 Máy đo pH 10 Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu,...và nhiều thiết bị khác 2.1.3.2. Dụng cụ Bảng 2.3. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu STT Dụng cụ 1 Bình thủy tinh, bình tam giác 2 Bình định mức 100ml, 500ml, 1000ml, bình hút ẩm 3 Hộp nhựa, cốc thủy tinh, thước 4 Ống nghiệm 5 pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml 6 Gạc vô trùng, vải xô, giấy nhớ, và nhiều dụng cụ khác. 9 2.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng-Trường ĐHSP Hà Nội 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC. Thí nghiệm 3: Tìm quang phổ hấp thụ và giải phóng của thuốc Diclofenac Natri. Thí nghiệm 4: Xây Dựng đường chuẩn Diclofenac Natri. Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc Diclofenac Natri trong 2 giờ. Thí nghiệm 6: Tính tỉ lệ thuốc giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC nạp Diclofenac Natri ở các môi trường pH khác nhau. Thí nghiệm 7: Tính tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC nạp Diclofenac Natri ở độ dày khác nhau. 2.3.2. Chuẩn bị màng BC Pha môi trường nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn được thể hiện ở bảng 2.1 [13] 10 Bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấy nước vo gạo STT Thành phần Khối lượng 1 Glucose 30g 2 Pepton 10g 3 Amoni sunfat ((NH4)2SO4 ) 0,5g 4 Diamoni photphat (KH2PO4 ) 0,3g 5 Axit axetic 2% 6 Nước vo gạo 1000ml 7 Dịch giống 10% Qua bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấynước vo gạo ta có quá trình tạo VLC được thể hiện ở hình 2.1: Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô Bổ Sung 10% Dịch Giống, 2% Acid Acetic Hấp khử trùng môi trường trong 113oC, 15 phút Khử trùng môi trường bằng tia UV (15 phút) Ủ tĩnh trong buồng nuôi cấy tế bào khoảng 5 đến 14 ngày ở 28oC Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Vật liệu cellulose thô 11 2.3.3. Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC Hình 2.2. Sơ đồ chu trình tinh chế VLC Kiểm tra đường glucose có trong màng (Đường D_glucose tác dụng với thuốc Fehling tạo ra kết tủa nâu đổ). Vì vậy để kiểm tra sự có mặt của đường D- glcoso ta dung thuốc thử Fehling, xử lí hóa học. Lấy dịch thử mỗi loại của màng và mẫu đối chứng_nước cất và dung dịch D-glucose. Cho mỗi loại dịch thử vào mỗi ống nghiệm, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 đến 15phút. Quan sát hiện tượng (kết tủa) xuất hiện trong mỗi ống nghiệm. 2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử. Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru-Nhật Bản), đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Vật liệu cellulose thô màu trắng, trong Vật liệu cellulose có màu vàng nâu Vật liệu cellulose có màu trắng ngà, không mùi Vật liệu cellulose thô Rửa dưới vòi nước, ngâm trong NaOH 3% trong 24 giờ đến 48giờ làm vỡ tế bào vi khuẩn, giải phóng độc tố ra ngoài Trung hòa bằng HCL 3% trong 24 giờ đến 48giờ Ngâm nước trong 24 giờ đến 48 giờ trung hòa hết acid 12 Sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ± 0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng [3]. Pha dãy dung dịch Diclofenac Natri trong Metanol ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của dung dịch Diclofenac Natri có nồng độ 50% ở bước sóng 278nm (bước sóng tại đó dung dịch Diclofenac Natri đạt cực đại (λmax) hấp thụ). Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bước sóng đã lựa chọn với mẫu trắng là dung dịch Metanol 900ml và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ thuốc Diclofenac Natri. Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac Natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R2 là hệ số tương quan Trong đó: y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax x: nồng độ của dung dịch Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau. Làm tương tự trên khảo sát phổ diclofenac natri và xây dựng khoảng tuyến tính định lượng (đường chuẩn) của Diclofenac Natri trong môi trường pH = 2; 4,5; 6,8 và 7,4. Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc Diclofenac Natri thể hiện ở bảng sau: 13 Bảng 2.5. Mật độ quang_OD, của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm Nồng độ (mg/ml) 10 20 40 60 80 100 Giá trị OD 278nm (n=3) Lần 1 0,116 0,21 0,49 0,66 0,95 1,169 Lần 2 0,116 0,25 0,46 0,76 0,94 1,173 Lần 3 0,119 0,23 0,46 0,68 0,96 1,171 Giá trị trung bình 0,117 ± 0,013 0,23 ± 0,013 0,47 ± 0,013 0,7 ± 0,04 0,94 ± 0,006 1,171 ± 0,001 Dựa vào bảng 2.2 dựng đồ thị biểu diễn, lập đường chuẩn Diclofenac Natri bằng phần mềm Excel 2010, ta được hình 2.1, hình 2.2, hình 2.3 y = -0.1583+0.218x R² = 0,9917 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 10 20 30 40 50 60 G iá t rị O D n m STT Nồng độ dung dịch Diclofenac mg/ml OD 278nm Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm Ta có phương trình đường chuẩn ở bước sóng 278nm sóng: Y = 0,218x – 0,1583 (R2= 9917) (2) Trong đó: x - nồng độ Diclofenac Natri (mg/ml). y - giá trị OD tương ứng. R2 là hệ số tương quan. 14 2.3.5. Tạo VLC nạp Diclofenac Natri B1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. B2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC. B3: Tiến hành nạp thuốc Diclofenac Natri trên 2 mẫu: Mẫu 1: VLC có độ dày 0,5cm. Mẫu 2:VLC có độ dày 1cm. B4: VLC sau khi tinh chế cho vào sấy khô 50%, sau đó để vào bình tam giác có chứa 100ml dung dịch Diclofenac 20%. B5: Rút dịch ở các mẫu trong khoảng thời gian 0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ và 2 giờ ta dùng máy quang phổ UV-Vis để đo giá trị OD của từng mẫu [9] [17]. B6: Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi tính giá trị OD trung bình cho vào phương trình đường chuẩn để tính nồng độ của Diclofenac Natri hấp thụ qua VLC được xác định theo công thức: mBC = mBC(2) – mBC(1) (1) Trong đó: mBC là khối lượng thuốc được hấp thụ qua VLC, mBC(1) là khối lượng của VLC lúc ban đầu, mBC(2) là khối lượng của VLC sau khi hấp thụ thuốc. 2.3.6. Pha dung dịch đệm Nghiên cứu sự giải phóng thuốc Diclofenac Natri từ chế phẩm trong 4 môi trường (dung dịch đệm) với pH tương ứng là 2,0; 4,5; 6,8;7.4 [1]: Pha dung dịch đệm có pH theo cách pha chế một số dung dịch chuẩn độ theo Dược điển Việt Nam [3]. Dung dịch đệm pH = 2,0: Hòa tan 6,57g aliclorid trong nước, thêm 119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH). Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphate trong 1.000ml nước; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH). 15 Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1.000 ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). Hình 2.4. Pha dung dịch đệm 2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo Môi trường khảo sát là pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4[1][17] Lấy màng cellulose vi khuẩn đã được nạp thuốc Diclofenac Natri với độ dày 0,5cm hoặc 1cm và độ rộng (1,5x1,5), mỗi loại lấy 4 mẫu cho vào các bình chứa 900ml môi trường pH như trên. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37oC ± 0,50C.Sau các khoảng thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 24 giờ, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó. Số lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung lại 5ml dung dịch đệm tương ứng. 16 Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị trung bình. Tỉ lệ giải phóng thuốc được tính theo công thức[17]: R% = x100% Trong đó: R: Tỉ lệ giải phóng thuốc; Ct: Nồng độ của dung dịch Diclofenac Natri tại thời điểm t; V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau; V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào; n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng; m: Khối lượng thuốc hấp thu vào các màng VLC. Hình 2.5. Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm 2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2007 và được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. Các thông số động học giải phóng thuốc được tính toán, xử lý bằng công cụ DDSolver trong Excel [17]. 17 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo Trong các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau, ta thu được màng ở những độ dày khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1 [15]: Bảng 3.1. Kết quả thu VLC Lô Kí hiệu Thời gian nuôi cấy (ngày) 1 Màng 0,5 cm 7 2 Màng 1cm 14 Hình 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 18 3.2. Màng tinh chế VLC nuôi cấy từ môi trường nước vo gạo sau khi tinh chế đáp ứng yêu cầu thể chất mềm mại, linh hoạt, dễ gấp mà không cần thêm một vật liệu dẻo nào, độ bền kéo và độ đàn hồi tốt, không bị khô khi để ngoài không khí. 3.3. Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri VLC sau khi tinh chế sấy ở nhiệt độ 90°C trong 4 giờ để loại nước sau đó cho màng vào bình chứa 100 ml dung dịch Diclofenac 5%, đặt bình vào bể rung siêu âm, nhiệt độ 37°C. Sau khi ngâm VLC trong Diclofenac 0,5 giờ, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ lấy dung dịch ra đo quang phổ bằng máy UV - 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào. Hình 3.2. Rung siêu âm 3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac natri được giải phóng ra khỏi màng Sau khi hấp thụ thuốc tối đa, cho 4 màng cellulose vi khuẩn vào các bình dung dịch đệm có pH tương ứng là: 2,0; 4,5; 6,8, 7,4 với mỗi bình dung tích khoảng 900ml. Xác định lượng thuốc Diclofenac Natri giải phóng ra, ta dùng máy khuấy từ gia nhiệt với tốc độ huấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37°C. Với mỗi mốc thời gian 0,5 giờ; 1 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 12 giờ; 24 giờ rút 5ml mẫu ra đo quang phổ cùng lúc ta bổ sung 5ml dung dịch đệm tương tự. 19 Hình 3.3. Máy xác định lượng thuốc giải phóng Hình 3.4. Mẫu rút ra để đo quang phổ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần được giá trị OD(y) trung bình như bảng 3.2, bảng 3.3 20 Bảng 3.2. Giá tri OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC chưa ép nước Thời gian (giờ) pH2 pH4.5 pH6.8 pH7.4 Màng 0,5 cm Màng 1 cm Màng 0,5 cm Màng 1 cm Màng 0,5 cm Màng 1 cm Màng 0,5 cm Màng 1 cm 0,5 0,02 ± 0,0082 0,09 ± 0,0077 0,08 ± 0,0076 0,17 ± 0,008 0,21 ± 0,0082 0,37 ± 0,0089 0,2 ± 0,009 0,23 ± 0,0083 1 0,25 ± 0,0084 0,12 ± 0,0078 0,19 ± 0,008 0,19 ± 0,0081 0,37 ± 0,009 0,48 ± 0,0095 0,33 ± 0,0095 0,3 ± 0,0086 2 0,4 ± 0,0091 0,16 ± 0,008 0,25 ± 0,008 0,28 ± 0,0085 0,4 ± 0,009 0,57 ± 0,001 0,37 ± 0,0099 0,42 ± 0,0092 4 0,41 ± 0,0091 0,28 ± 0,0085 0,37 ± 0,009 0,42 ± 0,0092 0,63 ± 0,001 0,59 ± 0,007 0,39 ± 0,001 0,48 ± 0,0095 6 0,51 ± 0,0096 0,35 ± 0,0089 0,42 ± 0,0091 0,45 ± 0,0093 0,7 ± 0,01 0,67 ± 0,001 0,64 ± 0,01 0,57 ± 0,0099 8 0,63 ± 0,01 0,52 ± 0,0096 0,56 ± 0,0098 0,5 ± 0,0096 0,84 ± 0,015 0,72 ± 0,011 0,69 ± 0,011 0,68 ± 0,01 10 0,75 ± 0,01 0,65 ± 0,012 0,6 ± 0,01 0,63 ± 0,01 0,88 ± 0,011 0,77 ± 0,011 0,72 ± 0,011 0,75 ± 0,011 12 0,89 ± 0,011 0,7 ± 0,014 0,78 ± 0,012 0,69 ± 0,014 0,9 ± 0,011 0,85 ± 0,012 0,77 ± 0,0089 0,86 ± 0,011 24 0,93 ± 0,013 0,87 ± 0,011 0,9 ± 0,013 0,82 ± 0,011 0,94 ± 0,012 1,00 ± 0,015 0,87 ± 0,012 0,92 ± 0,012 21 Bảng 3.3. Giá trị OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC ép 50% nước Thời gian (giờ) pH2 pH4.5 pH6.8 pH7.4 Màng 0,5 cm Màng 1 cm Màng 0,5 cm Màng 1 cm Màng 0,5 cm Màng 1 cm Màng 0,5 cm Màng 1 cm 0,5 0,32 ± 0,0087 0,12 ± 0,0078 0,14 ± 0,0079 0,19 ± 0,0081 0,28 ± 0,0085 0,37 ± 0,0089 0,3 ± 0,0086 0,29 ± 0,0085 1 0,37 ± 0,0089 0,15 ± 0,0079 0,19 ± 0,0081 0,24 ± 0,0084 0,4 ± 0,0091 0,52 ± 0,0097 0,35 ± 0,0089 0,35 ± 0,0089 2 0,43 ± 0,0092 0,21 ± 0,0082 0,27 ± 0,0085 0,34 ± 0,0088 0,53 ± 0,0097 0,6 ± 0,01 0,42 ± 0,0092 0,45 ± 0,0093 4 0,48 ± 0,0095 0,32 ± 0,0087 0,42 ± 0,0092 0,42 ± 0,0092 0,65 ± 0,01 0,67 ± 0,01 0,46 ± 0,0094 0,64 ± 0,01 6 0,54 ± 0,0097 0,43 ± 0,0092 0,53 ± 0,0097 0,63 ± 0,01 0,77 ± 0,011 0,8 ± 0,011 0,71 ± 0,011 0,74 ± 0,01 8 0,65 ± 0,01 0,67 ± 0,01 0,65 ± 0,01 0,67 ± 0,01 0,88 ± 0,013 0,89 ± 0,013 0,78 ± 0,011 0,8 ± 0,011 10 0,89 ± 0,011 0,79 ± 0,011 0,72 ± 0,011 0,78 ± 0,011 0,93 ± 0,012 0,9 ± 0,014 0,84 ± 0,01 0,87 ± 0,012 12 0,92 ± 0,012 0,81 ± 0,011 0,84 ± 0,011 0,92 ± 0,012 0,96 ± 0,012 0,93 ± 0,015 0,89 ± 0,0095 0,93 ± 0,012 24 0,96 ± 0,013 0,97 ± 0,012 0,91 ± 0,012 0,98 ± 0,013 1,00 ± 0,013 1,15 ± 0,013 0,97 ± 0,0089 1,00 ± 0,0099 Dựng đồ thị biểu diễn bằng phần mềm Excel 2010, t có hình 3.5, hình 3.6: 22 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 G iá t rị O D Thời gianpH2 Màng 0.5cm pH2 Màng 1cm pH4.5 Màng 0.5cm pH4.5 Màng 1cm pH6.8 Màng 0.5cm pH6.8 Màng 1cm pH7.4 Màng 0.5cm pH7.4 Màng 1cm Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm chưa ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 G iá t rị O D Thời gianpH2 Màng 0.5cm pH2 Màng 1cm pH4.5 Màng 0.5cm pH4.5 Màng 1cm pH6.8 Màng 0.5cm pH6.8 Màng 1cm pH7.4 Màng 0.5cm pH7.4 Màng 1cm Hình 3.6. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 23 Số liệu trong bảng 3.2; 3.3, hình 3.5; 3.6 cho thấy: Cả 4 môi trường đệm pH, giá trị OD (y) trung bình của thuốc Diclofenac Natri giải phóng từ VLC ở cả 2 độ dày màng đều tăng dần tới 1 thời điểm nhất định, giải phóng cao nhất tại thời điểm 24 giờ. Trong môi trường nước vo gạo, giá trị OD (y) t