Khóa luận Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

g lá đều có khả năng hình thành chồi. ở Việt Nam, những nghiên cứu về nuôi cấy lát mỏng tế bào hiện còn là vấn đề khá mới. Tới nay chỉ có một số kết quả nghiên cứu của một số tác giả như: Trần Thanh Vân, Bùi Thị ánh Tuyết, Trần Duy Quý, Lê Thị ánh Hồng đã sử dụng lớp mỏng ngang của cuống lá và cụm hoa của cây Saivitpaulia Vononvhawindhl. ở viện Sinh học Nông nghiệp 1 Hà Nội cũng có một số nghiên cứu lát mỏng tế bào trên cây phong lan, trên cây dứa Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl) Phương pháp TCL kinh điển Theo Trần Thanh Vân (1973, 1974, 1983, 1986) thì lớp mỏng tế bào được cắt theo chiều dọc hoặc chiều ngang từ những cơ quan khác nhau với kích cỡ rất nhỏ (từ vài micro đến 1 mm x 5mm) và số tế bào giảm đi cho phép TCL bộc lộ tính đồng nhất với các phân tử DNA ngoại lai từ quá trình cài lồng gen. Cắt lớp mỏng tế bào theo chiều dọc (itcl được sử dụng khi phân loại tế bào ( tế bào mô rộng, biểu bì, tế bào tượng tầng, tế bào nhu mô) ITCL có thể cắt từ thân, gân lá, cuống lá, lá mầm cắt lớp mỏng tế bào theo chiều ngang (tTCL) cũng có thể sử dụng cơ quan khác như phiến lá, rễ, cơ quan của hoa thân, mô sinh đỉnh. Với mục đích là để hình thành mô phân sinh đỉnh. Hình thành mô sẹo hoặc tái sinh chồi. Cơ chất của môi trường cấy thường làm đặc hoặc lỏng. Một số loài thử nghiệm thành công khi sử dụng TCL là cây thuốc lá, cà chua, lan hồ điệp. Dụng cụ chứa là ống nghiệm hoặc đĩa peptri có kích thước sao cho phù hợp với thể tích môi trường nuôi cấy và thể tích không khí để cung cấp dinh dưỡng cho mẫu cấy. Phương pháp TCL cải tiến Sử dụng tổ hợp tiền chất trên chất ức chế để nghiên cứu động lực của các con đường sinh tổng hợp khác nhau và để làm giảm mức tối thiểu sự biến đổi nội tạng của nhân tố môi trường cũng như tính gắn kết của vật liệu sinh học. Phương pháp cải tiến được Richard (1987) thực hiện bằng việc sử dụng các đĩa giếng gồm 24 đĩa với kích thước 1,6 cm để làm vật liệu chứa. Mỗi đĩa đựng một thể tích môi trường xác định sao cho tỉ lệ thể tích không khí trên thể tích môi trường thích hợp. Một màng nhựa mỏng có kích thước đàn hồi đã cách li mỗi cá thể theo trật tự để ngăn ngừa sự thay đổi giữa các đĩa riêng biệt và sự nhiễm vi sinh vật. Đĩa được bịt kín với hai lớp màng (urgo) phương pháp này có ưu điểm là sự phân bố ngẫu nhiên các mẫu cấy TCL trong mỗi đĩa. Nhờ đó giảm được kích cỡ của của các đĩa giếng và lát mỏng tiếp xúc được với các điều kiện đồng nhất của môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2 ) dẫn đến giảm sự biến động. Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước: Bước 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in - vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu in - vitro. Bước 1: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in - vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn , đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá, chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc .. Bước 2: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề này phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều xitokynin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25- 270C và 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh suplơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối. Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Bước 4: Thích ứng cây in - vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: + Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ, chiều cao cây). + Có giá thể tiếp nhận cây in - vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. + phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [17]. Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in - vitro Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability) Mục đích của nhân giống in - vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (Tue-to-type) với số lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. Dạng biến dị phổ biến là bạch tạng, sọc lá, sinh trưởng của cây bất thường, hệ số nhân in - vitro cũng giảm sút. Nhiều cây khi trồng trên đồng ruộng có số lá trên 100 lá vẫn chưa ra hoa kết quả trong khi cây bình thường có thể xử lý ra hoa khi cây có mặt 40 lá. Sự nhiễm mẫu (explantcontamination) Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn như Agrobacterium, Bacillus, Corylabactorium, Erwinnia và Pscudomnas có thể xâm nhập vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1 – 2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục được hiện tượng trên, trước hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn. Người ta cũng có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm mốc. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng lên kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thường gây ra những huỷ hoại ở ti thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất. Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds) Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuyếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol: encomicaxit và tyramine đã làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôicấy. Các phương pháp phòng trừ sự hoá nâu: + Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1 - 0,3%) phương pháp này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác. + Bổ sung Poly Vinyl Pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt. + Sử dụng mô non gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng. + Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và citric vài giờ trước khi cấy. + Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng oxi thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần). + Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trường tươi trong 1 - 2 tuần. Hiện tượng thuỷ tinh hoá (vitri fication, hyperhy dricity) Trong quá trình nhân nhanh in - vitro thường xuất hiện hiện tượng cây bị “thuỷ tinh hoá” – thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh. Hiện tượng này thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp. Cây bị thuỷ tinh hoá thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước. Cây in - vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy nên khi đưa ra môi trường tự nhiên dễ mất nước. Để khắc phục hiện tượng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải pháp: + Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao. + Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường. + Giảm sự sản sinh etylen trong bình nuôi cấy. + Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng. + Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi [17]. Quy trình trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân bằng nuôi cấy mô Tuy việc trồng lan trên thực tế không khó khăn lắm, nhưng lan là một loài hoa phát triển theo một nhịp điệu nghiêm ngặt trong đời sống của nó. Đối với cây con sau giai đoạn ống nghiệm, dù là từ gieo hạt hay từ nuôi cấy mô, cho đến khi trưởng thành, chỉ cần chúng ta xử lý sai trong mỗi giai đoạn phát triển của nó hay nói một cách khác là không phù hợp với sinh lý, sinh thái của nó có thể làm cho chúng chết hàng loạt, hoặc chậm lớn, chậm ra hoa, thậm chí không ra hoa. Cây lan sau khi đã được nhân nhanh bằng phương pháp in - vitro sẽ được đưa ra vườn ươm. Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang trạng thái sống hoàn toàn tự dưỡng do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con có thể phát triển tốt nhất [20]. Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra Đây là thời điểm mà người ta thường ít chú ý. Nhưng nếu không làm cẩn thận, nó có thể ảnh hưởng xấu đến việc phát triển của cây con sau này. Việc lấy cây con ra phải thật nhẹ nhàng, tránh làm dập lá, gẫy rễ, nhất là trong lúc rửa sạch hết thạch của môi trường dinh dưỡng còn bám vào rễ. Đối với các giống như Vanda, rễ to, cây cứng, làm sạch thạch dễ dàng hơn đối với những cây quá mảnh mai như Cymbidium, Dendrobium. Đối với rễ của Cymbidium trong ống nghiệm có lông bám khá chắc thạch của môi trường dinh dưỡng và rễ thường đan với nhau nên phải tỉ mẩn, cẩn thận. Phải rửa thật sạch thạch, tách riêng từng cây và loại bỏ những mô callus còn sót nếu không cây sẽ bị nhiễm khuẩn khi đưa ra ươm trong vườn [20]. Sau khi rửa sạch cây, dùng nước sạch có pha thêm một ít thuốc trừ nấm, thuốc sát khuẩn với nồng độ loãng (khoảng 1g/lít) nhúng cây con vào mục đích để trừ nấm hại cây con khi cây còn quá mảnh mai, yếu ớt [20]. Giai đoạn ở trong chậu chung Giai đoạn ở trong chậu chung là giai đoạn khó khăn và quan trọng nhất của việc trồng cây lan con. Rebecca Tyson Northen (nhà trồng lan người Mỹ) trong cuốn “Home Orchid Growing” (1974) chỉ dẫn như sau: Lan con lấy từ ống nghiệm ra được cho vào dung dịch sát khuẩn, sau dùng kẹp để gắp cây con vào trồng trong chậu chung. Chất liệu trồng là ba phần vỏ thông xay nhuyễn, với một phần cát, hoặc tám phần Osmunda (một chất liệu như rễ dớn của ta) xay nhuyễn, một phần cát và một phần than vụn. Tất cả chất liệu này đều được luộc kỹ để diệt nấm và diệt trùng. Pha loãng dung dịch phân bón, một phần tư muỗng cà phê phân bón với một ga-lông (bằng 4,5 lít nước) ngay tức khắc sau khi trồng phun vào cây. Đời sống cộng đồng của chúng kéo dài một năm. Water Richter (một nhà trồng lan nổi tiếng người Đức) trong cuốn “Orchideen, Pilezen, Vermehren, Zuchten” thì viết như sau: “Để trồng cây từ ống nghiệm ra người ta chuẩn bị chất nuôi cây gồm than bùn, than củi và cát với tỉ lệ ngang nhau, hạt khá nhỏ, độ ẩm bình thường. Đồ đựng là các chậu đất hoặc đĩa, 1/3 phía dưới người ta cho mảnh sành. Phía trên là các chất nuôi cây để khoảng cách từ 2-3 cm. Giai đoạn ở trong chậu chung đối với từng loại lan là khác nhau và chế độ che sáng cũng khác nhau thường tránh để ánh sáng trực tiếp chiếu vào cây. Đánh giá cây con khỏe mạnh và có thể chuyển sang giai đoạn chậu con thì phải đạt ở tiêu chuẩn sau đây: Giả banh và lá phải xanh, cứng, không còn quá mọng nước như khi mới lấy ở ống nghiệm ra. Rễ còn nguyên vẹn, có màu trắng xanh, đầu rễ bắt đầu phát triển, nhú lên xanh đậm rất đẹp. Khi trồng vào chậu cây con sống bình thường như cây lớn (tất nhiên phải che nắng thích hợp, tránh cho cây bị nắng quá làm cháy lá và không để mưa to làm long gốc). Giai đoạn trồng vào chậu nhỏ Sau khi cây trồng trong chậu chung ổn định một thời gian cần thiết phải chuyển sang giai đoạn chậu nhỏ để cây phát triển tốt hơn. Giai đoạn này tùy thuộc vào từng loại cây và tùy theo yêu cầu thực tế của cây mà tiến hành. Giai đoạn này, cần có 2 thứ là chậu và chất liệu trồng. + Về chậu: Thường dùng là chậu đất, chậu nhựa mềm, chậu nhựa cứng, đường kính khoảng 3 - 5 cm, chiều cao cũng vậy có lỗ thoát nước ở dưới. Chậu cần được rửa sạch trước khi trồng. + Về chất giữ cây: Có nhiều khuynh hướng và kinh nghiệm của người trồng. ở các nước ôn đới, người ta thường dùng: Loại chất liệu sẵn có trong thiên nhiên như osmuda, splagnum, than bùn, than củi, cát, vỏ cây, đất . Loại chất liệu nhân tạo tổng hợp như polystyren, polyuretan. ở nước ta, người ta sử dụng nhiều loại chất liệu như: xơ dừa, than củi, rễ lục bình, dớn... để trồng lan. Tuy nhiên đối với cây Cymbidium thì chất liệu trồng rất đa dạng và cầu kỳ: đất trồng cây, cát, xỉ than, vỏ cây, vỏ dừa, xơ dừa, rễ dương xỉ, bã phân vi sinh, bã cà phê với một tỷ lệ pha trộn tùy theo kinh nghiệm từng người trồng. Giai đoạn thay chậu nhỏ và trồng vào chậu lớn Việc chuyển chậu có thể thực hiện trong khoảng thời gian cây con đã ở trong chậu nhỏ từ 10 - 24 tháng hoặc hơn. Khi chuyển cây không được căn cứ vào tháng tuổi của cây ở trong giai đoạn chậu nhỏ mà phải căn cứ vào tình trạng của từng cây mà quyết định. Nếu cây bé trồng vào chậu lớn, cây sẽ phát triển chậm nhưng nếu cây lớn trồng vào chậu bé thì cũng dẫn tới tình trạng tương tự. Sau thời gian chuyển chậu được một tuần trở ra mới được bón các chất dinh dưỡng cho cây vì trong quá trình chuyển chậu, ít nhiều bộ rễ bị xây xát nhẹ, nếu bón phân hóa học ngay, có thể làm hỏng bộ rễ. Duy trì cường độ ánh sáng 40.000 lux, để trong 6 tháng đến 1 năm. Sau đó, ta chuyển cây vào nơi có cường độ ánh sáng khoảng 50.000 lux và để trong 6 tháng thì cây bắt đầu ra hoa. Có thể với một số cây Địa lan phát triển thành cụm lớn ta có thể chuyển sang loại chậu to hơn nữa hoặc tách cụm thành những chậu bé hơn Một số kỹ thuật trồng Địa lan cơ bản Kĩ thuật trồng cây con vào chậu Trước khi trồng cần chuẩn bị: + Chậu đã được rửa sạch. + Giá thể phải được rửa sạch, khử trùng, chế biến theo công thức của từng người. Nếu là các chất liệu như than củi, vỏ cây, rễ cây dương xỉ thì được chặt nhỏ kích thước khoảng 2-5 mm. Nếu là xơ dừa thì xé ra cho tơi và cắt thành đoạn khoảng một đốt ngón tay. Xơ dừa được ngâm kĩ khoảng một tuần, rửa sạch rồi luộc kỹ và sau đó rửa lại thật sạch nhiều lần cho hết chất chát. Sau đó phơi thật khô. Nên chọn xơ dừa già vì xơ dừa già lâu mục. Chọn những cục than to hoặc đá, mảnh sành kích thước khoảng 2-3 cm, đặt vào đáy chậu để giúp thoát nước và thông thoáng bộ rễ, chiếm khoảng 1/3 dung tích. Sau đó đặt giá thể lên trên, khoảng 2 lớp mỏng rồi trồng cây con vào, giữ cho cây đứng thẳng cho tiếp giá thể lên và chú ý đặt nhẹ nhàng cho rễ cây ở hết bên dưới giá thể và tránh làm gẫy và hư hại rễ. Công việc này đòi hỏi làm phải hết sức nhẹ nhàng và tỉ mỉ [12]. Khi cây mới được trồng vào chậu, lúc tưới phải tránh làm lung lay, rễ vây khó bám vào xơ dừa và than. Nếu trời mưa quá to có thể làm cây long, nghiêng ngả, đầu rễ bị hư hại [20]. Kỹ thuật chuyển chậu Việc chuyển chậu cũng cần được chuẩn bị thật tốt như khi trồng cây con vào chậu nhỏ. Về chậu: cần có kích thước lớn ít nhất gấp 2,5 lần chậu con. Rửa sạch chậu. Về giá thể: Được khử trùng là tốt nhất. Một số loại như vỏ cây, vỏ dừa... kích thước cần lớn hơn khoảng 5-10 mm. Khi chuyển chậu, nên dùng một chậu nhựa lớn, sạch. Đổ nước có pha thuốc diệt trùng, diệt nấm sẵn (tỉ lệ 1/1000). Mức nước ngang với chiều cao của chậu con. Xếp các chậu con vào chậu nước thuốc sát trùng, để khoảng 10-15 phút. Diệt hết các rệp cây hoặc giá con từ các chậu bò ra (nếu có). Khảng 15 phút sau rễ cây bám vào thành chậu đã bong ra hết, ta nhẹ nhàng cầm cây sát gốc rút nhẹ lên, bộ rễ và giá thể sẽ long lên toàn bộ cả cụm, đem rửa sạch bộ rễ. Để cây dưới ánh nắng tán xạ khoảng 20 phút sau đó đem trồng. Ta đặt cụm cây đó vào giữa chậu lớn, một tay giữ cây, một tay cho giá thể vào tới sát miệng chậu. Kỹ thuật tưới nước cho cây Tưới nước cho cây phải căn cứ trên hai nguyên tắc: Nhu cầu về nước của cây mình trồng dựa trên sinh lý, sinh thái cụ thể của chúng. Tình hình thực tế về khí hậu trong từng tuần, từng tháng của nơi mình trồng lan (gồm khí hậu trong vùng và khí hậu của môi trường, tức là khí hậu của vườn lan). Khi tưới, cần hết sức nhẹ nhàng, tránh làm cây bị long gốc, rễ khó bám vào giá thể và thành chậu, nên tưới phun mù là tốt nhất. Nước tưới cho lan Đối với lan con, nước tưới phải thật sạch, nước giếng, nước mưa là tốt nhất. Đối với những nơi có hệ thống cống rãnh ngầm, bể phân tự hoại, ta không nên dùng nước giếng. Vùng có nhiều đá vôi, nước giếng cũng không tốt cho lan. Cũng không nên dùng nước mưa đầu mùa, vì trong không khí và nhất là mái nhà, máng chưa được rửa sạch, bản thân nước mưa trong thời gian đầu cũng chứa nhiều bụi và vi khuẩn [15]. Nước máy cũng rất tốt, nhưng vì có thuốc sát trùng nên người ta khuyên dùng nước máy đựng trong bể chứa. Sau 24 giờ, các hóa chất như Cl2 đã bốc hơi hết. Trong tự nhiên nước thông thường có pH trong khoảng từ 4-9. Có người khuyên dùng axit oxalic, axit nitric 10%, axit citric để tạo nước có độ hơi axit nếu nước có pH cao (pH khoảng 5 là tốt nhất). Kỹ thuật thúc mầm cây Được thực hiện vào mùa xuân sẽ cho hiệu quả cao hơn nếu thực hiện vào mùa thu. Chọn những cây khỏe mạnh để thúc mầm. Có thể thực hiện một trong hai biện pháp sau: Biện pháp cơ giới: Tách nhánh ép mầm. Đây là biện pháp tách cụm để thúc cho mầm mới phát sinh. Kết quả cho thấy khi tách 2 nhánh/cụm sẽ cho hiệu quả tốt. Biện pháp hóa học. Đây là biện pháp sử dụng các chất kích thích như BAP thấm bông đắp lên giả hành hoặc chọc nhỏ thẳng vào đỉnh sinh trưởng từ 3- 4 lần cách nhau tuần/lần. Aspirin, KH2PO4, H3BO3... với nồng độ 1/1000 tưới cho cây khoảng cách 2 lần/tuần. Phòng trừ bệnh cho cây Trên thực tế, khi chúng ta trồng những cây lan con từ trong ống nghiệm ra (bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật) là chúng ta đã loại được những bệnh nguy hiểm nhất cho lan là các bệnh do virus [15]. Bình thường, nếu chúng ta dùng nước sạch tưới cho lan, và tạo cho các cây lan con một môi trường riêng biệt, sạch sẽ không có điều kiện cho lan con bị lây chéo các bệnh khác của lan lớn hoặc cây khác thì lan con sống khỏe mạnh cho tới khi trưởng thành. Tuy nhiên, để đảm bảo cho lan con không có bệnh, nhất là các bệnh do nấm, chúng ta nên áp dụng chế độ phun thuốc phòng bệnh nấm cho lan theo chế độ định kì tháng/lần. Nếu thấy lá lan bị vàng úa rất nhanh hàng loạt hoặc thối đọt hàng loạt việc đầu tiên là phải cách ly các cây đó ngay để tránh bệnh lây sang toàn bộ vườn lan, sau đó phun thuốc trừ bệnh phù hợp. Trên giàn lan, nếu ta thấy có triệu chứng xuất hiện một số loại sâu như sâu đo, sâu róm, sâu khoang, rệp dính, dòi đục lá, bọ xít, muỗi, rệp thì nên dùng các loại thuốc trừ sâu thông thường và nên dùng với liều lượng thấp hơn một chút. Nên phun định kỳ 2 tháng một lần để diệt các loại sâu, rệp hại lan. Ngoài các bệnh do nấm, vi khuẩn và sâu, chúng ta cũng cần đề phòng một số côn trùng khác như cuốn chiếu, giun, gián (ăn rễ lan), dế và nhất là các loại ốc sên. Cũng nên nhắc lại là khi lan đang bị bệnh (do nấm hoặc vi khuẩn) tuyệt đối không cung cấp các chất dinh dưỡng cho cây. Cây lan thường bị một số bệnh nguy hiểm hại cây, bệnh nhiều khi gây thiệt hại rất lớn cho người trồng lan như bệnh đốm than, bệnh đốm lá, bệnh thối hoa, bệnh thối mềm vi khuẩn, rệp sáp vàng, bệnh khảm lá [13]. Phần 3: vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu vật liệu Các mẫu giống thí nghiệm được cung cấp tại phòng Công nghệ Sinh học thực vật, Viện Sinh học Nông nghiệp- Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội, giống địa lan Hồng hoàng Sapa(Cymbidium iridioides) do vườn Quốc gia Hoàng liên cung cấp Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy in - vitro là các thể protocorm, chồi, cây con. Các giá thể trồng cây: dớn, xơ dừa. Phân bón: phân vô cơ tự chế, phân bón Trung Quốc. Nội dung nghiên cứu Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trường đến sự nảy mầm của hạt: CT1( Đ/C): VW + 100 ml/ lít nước dừa + 10g/ lít đường + 1g/ lít pepton + 0,65% agar. CT2: Đ/C + 25 g khoai tây. CT3: Đ/C + 50 g khoai tây. CT4: Đ/C + 75 g khoai tây. Thí nghiệm 2: Xác định môi trường khởi động thích hợp cho sự phát sinh hình thái của lát cắt Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái lát mỏng ở các nồng độ khác nhau: CT1( Đ/C): MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT2: Đ/C + 0,3 ppm BA. CT3: Đ/C + 0,5 ppm BA. CT4: Đ/C + 1,0 ppm BA. CT5: Đ/C + 1,5 ppm BA. CT6: Đ/C + 2,0 ppm BA. CT7: Đ/C + 3,0 ppm BA. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái lát mỏng CT1 ( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT2: Đ/C + 0,3 ppm kinetin. CT3: Đ/C + 0,5 ppm kinetin. CT4: Đ/C + 1,0 ppm kinetin. CT5: Đ/C + 1,5 ppm kinetin. CT6: Đ/C + 2,0 ppm kinetin. CT7: Đ/C + 3,0 ppm kinetin. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin và BA tới quá trình nhân nhanh thể protocorm. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và tỷ lệ chồi của thể protorcorm: ( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT1: Đ/C + 0,3 ppm kinetin. CT2: Đ/C + 0,5 ppm kinetin. CT3: Đ/C + 0,7 ppm kinetin. CT4: Đ/C + 1,0 ppm kinetin. CT5: Đ/C + 1,5 ppm kinetin. CT6: Đ/C + 2,0 ppm kinetin. CT7: Đ/C + 3,0 ppm kinetin. 3.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và tỷ lệ chồi của thể protorm ( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT1: Đ/C + 0,3 ppm BA. CT2: Đ/C + 0,5 ppm BA. CT3: Đ/C + 0,7 ppm BA. CT4: Đ/C + 1,0 ppm BA. CT5: Đ/C + 1,5 ppm BA. CT6: Đ/C + 2,0 ppm BA. CT7: Đ/C + 3,0 ppm BA. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa( ND) đến hệ số nhân, chất lượng của chồi: CT1( Đ/C): Môi trường MS + 2% đường + 0,65 % agar. CT2: Đ/C + 5% ND. CT3: Đ/C + 10% ND. CT4: Đ/C + 15% ND. CT5: Đ/C + 20% ND. CT6: Đ/C + 25% ND. CT7: Đ/C + 30% ND. Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của than hoạt tính và a -NAA đối với sự ra rễ của cây. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây CT1( Đ/C): Môi trường MS+ 2% đường+ 0,65 % agar. CT2: Đ/C+ 0,25 g THT. CT3: Đ/C+ 0,50 g THT. CT4: Đ/C+ 1,00 g THT. Nghiên cứu ảnh hưởng của a-NAA đối với sự ra rễ của cây CT1( Đ/C): Môi trường MS+ 2% đường+ 0,65 % agar. CT1: Đ/C+ 0,1 ppm a - NAA. CT2: Đ/C+ 0,2 ppm a - NAA. CT3: Đ/C+ 0,3 ppm a - NAA. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng việc xử lý giá thể đối với cây ra vườn ươm CT1: Dớn+xơ dừa (1:1): không xử lý. CT2: Dớn+ xơ dừa (1:1): có xử lý. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ che đối với cây ra vườn ươm. CT1: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và có che. CT2: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che. CT3: Dớn + xơ dứa (1:1 : có xử lý và có che. CT4: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đối chứng: Phân bón chuyên dụng cho lan của Trung Quốc CT1: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 ). CT2: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 ). CT3: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 )+ vitamin+ vi lượng. CT4: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 )+ vitamin+ vi lượng. Phương pháp nghiên cứu Cách bố trí thí nghiệm + Thí nghiệm trong phòng: Được bố trí tại phòng Công nghệ Sinh học- Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội Số giờ chiếu sáng: 16- 18/ 24 giờ. Cường độ chiếu sáng: 2000- 3000 lux. Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy: 25- 270C. ẩm độ trong phòng nuôi cấy: 70%. + Thí nghiệm vườn ươm: Đươc bố trí trong điều kiện ánh sáng tán xạ và cây được tưới dưới dạng phun sương. Toàn bộ thí nghiệm trong phòng và ngoài vườn ươm đều được bố trí ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, số cá thể/ lần lặp lại là 15- 20 cá thể. Số mẫu cấy ở mỗi lần lặp lại là: 5 mẫu cấy trên một lần lặp lại. Đánh giá thí nghiệm sau 8 tuần theo dõi. Số cây được trồng trên mỗi giá thể là 5 cây trên một lần lặp lại. Phương pháp tiến hành Để thu được kết quả chúng tôi tiến hành làm ở các công thức thí nghiệm như sau: Phương pháp gieo hạt Mẫu thí nghiệm là quả địa lan được lấy từ vườn lan Hoàng liên cung cấp, mẫu lấy phải đảm bảo sạch bệnh và đầy đủ yêu cầu mong muốn. Sau khi chọn lựa mẫu đem rửa sạch bằng nước máy, tiếp đó rửa bằng nước xà phòng. Rồi đem mẫu đi khử trùng bằng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút + 1 phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng. Mục đích tránh cho mẫu nhiễm hoá chất ngấm sâu gây độc hại dẫn đến tình trạng mẫu chết trước khi cấy vào môi trường tái sinh. Sau đó ta gieo hạt trên các môi trường có bổ sung nồng độ khoai tây khác nhau. Cắt lớp mỏng tế bào Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng các thể protocorm tương đối đồng đề