Khóa luận Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo ra từ gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường nuôi cấy

hiết cao - Kích thước ổn định, độ bền cơ học lớn - Có khả năng chịu nhiệt tốt - Khả năng thấm hút nước cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme,... - Có thể bị một số vi sinh vật tác động làm phân hủy hoàn toàn nên đây có thể coi là nguồn tài nguyên có khả năng tự phục hồi được - Màng BC được nuôi cấy trực tiếp từ các loại môi trường tự nhiên, không cần can thiệp bởi các bước trung gian Do đó, màng BC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: - Công nghệ thực phẩm: sản xuất thịt nhân tạo, các món tráng miệng (salad, kem,) - Mỹ phẩm: sản xuất móng nhân tạo, các loại mặt nạ, - Công nghệ dệt may: sản xuất các loại vải khác nhau, sợi tơ nhân tạo,.. - Đặc biệt trong y học: màng được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo. Ở Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng để đắp lên vết thương. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng BC giúp vết thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng. Ngoài 6 ra, sản phẩm BC còn được ứng dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan hoặc làm màng băng vết thương [4]. 1.2. Thuốc Diclofenac natri 1.2.1. Tổng quan vè Diclofenac natri Diclofenac natri là thuốc được sử dụng nhiều vì vừa giảm đau và kháng viêm. Tác dụng điều trị chủ yếu dựa vào ức chế tổng hợp Prostaglandin, chất trung gian hóa học quan trọng của phản ứng viêm và đau, được hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa sau khi uống [12]. 1.2.2. Công thức - Công thức phân tử C14H10Cl2NNaO2 [11] - Công thức cấu tạo Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Diclofenac natri - Tên IUPAC hệ thống: Natri 2-[(2,6-dicloriphenyl)amino]phenyl]acetat 1.2.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng Diclofenac natri, dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư đặc biệt ở những người bị bệnh thận hoặc suy tim mạn tính. Với những người bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp và suy tim cấp [2]. 7 Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo DICLOFENAC mucin (chất có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa) [2]. 1.2.4. Dược động học Dạng uống: Diclofenac ở dạng viên bao tan trong ruột được hấp thu nhanh và hoàn toàn. Thuốc ở dạng viên phóng thích chậm được hấp thu hoàn toàn. Do hoạt chất được phóng thích chậm nên nồng độ tối đa trong huyết tương thấp hơn so với liều lượng dùng nhưng nồng độ diclofenac huyết tương có thể duy trì trong nhiều giờ sau khi uống. Sự hấp thu thuốc xảy ra chậm hơn nếu uống thuốc trong bữa ăn hay sau bữa ăn so với uống lúc đói nhưng không ảnh hưởng gì đến lượng hoạt chất hấp thu [20]. Dạng tiêm: Nồng độ tối đa trong huyết tương trung bình là 2,5 mg/ml (8 mmol/l) đạt được khoảng 20 phút sau khi tiêm bắp 75 mg diclofenac. Nồng độ trong huyết tương có liên quan tuyến tính với liều dùng [20]. 1.2.5. Chỉ định Điều trị dài hạn các triệu chứng trong :Viêm thấp khớp mạn tính, nhất là viêm đa khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cứng khớp cột sống hay trong những hội chứng liên kết như hội chứng Fiessiger-Leroy-Reiter và thấp khớp trong bệnh vẩy nến; bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế [20]. Điều trị triệu chứng ngắn hạn các cơn cấp tính của: Bệnh thấp khớp và tổn thương cấp tính sau chấn thương của hệ vận động như viêm quanh khớp vai cẳng tay, viêm gân, viêm bao hoạt dịch, viêm màng hoạt dịch, viêm gân bao hoạt dịch; viêm khớp vi tinh thể [20]. 8 1.2.6. Tác dụng phụ Đường tiêu hóa: Đau thượng vị, có những rối loạn tiêu hóa như nôn, mửa, tiêu chảy, đau bụng, khó tiêu, đầy hơi, chán ăn. Có thể xảy ra xuất huyết tiêu hóa, nôn ra máu, tiêu ra máu, loét đường tiêu hóa với xuất huyết hay thủng, tiêu chảy ra máu [20]. Hệ thần kinh trung ương (và ngoại biên): Nhức đầu, choáng váng, chóng mặt. Có thể gây ra rối loạn cảm giác kể cả dị cảm, rối loạn trí nhớ, mất định hướng, rối loạn thị giác (giảm thị lực, song thị), giảm thính lực, ù tai, mất ngủ, dễ bị kích thích, co giật, trầm cảm, lo âu, ác mộng, run rẩy, phản ứng tâm thần, rối loạn vị giác [20]. 1.2.7. Quá liều Một số biểu hiện khi quá liều: Đau ngực, suy nhược, khó thở; ho ra máu hoặc nôn mửa ra giống bã cà phê; buồn nôn, đau tức ngực, vùng bụng phía trên, chán ăn; phản ứng da nghiêm trọng - sốt, đau họng, sưng mặt hoặc lưỡi, [21]. 1.2.8. Tương tác thuốc Diclofenac natri có thể làm tăng hay ức chế tác dụng của các thuốc khác. Không nên dùng thuốc phối hợp với: - Thuốc chống đông theo đường uống và heparin: Có thể gây xuất huyết nặng. - Kháng sinh nhóm quinolon: Có thể làm tăng tác dụng phụ lên hệ thần kinh trung ương, dẫn đến co giật. - Aspirin hoặc Glucocorticoid: Làm giảm nồng độ Diclofenac natri trong huyết tương và làm tăng nguy cơ tổn thương đối với dạ dày và ruột. - Diflunisal: Có thể làm tăng nồng độ Diclofenac trong huyết tương, làm giảm độ thanh lọc Diclofenac natri và có thể gây chảy máu nặng ở đường tiêu hóa [2]. 9 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.3.1. Tình hình ngiên cứu trên thế giới Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc Diclofenac natri như: - Srikanth A ABSTRACT, Nagaveni, SaravanaKumar, Prasanna Raju Y(2013) đã nghiên cứu đặc tính và chế tạo DICLOFENAC SODIUM loại MICROCAPSULES LOADED. - Laila Hassanein Emara, Nesrin Fouad Taha, Rania Mohamed Badr , Nadia Mohamed Mursi (2012) đã nghiên cứu phát triển hệ thống bơm thẩm thấu để phân phối có kiểm soát Diclofenac natri. - Mitra Jelvehgari , Hadi Valizadeh , Ramin Jalali Motlagh, Hassan Montazam (2014) đã nghiên cứu xây dựng và đặc tính hóa lý của Buccoadhesive Microspheres chứa Diclofenac Sodium. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là một hướng đi mới, chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này Năm 2015, Phan Thị Thu Hồng và cộng sự đã nghiên cứu về “Sử dụng cellulose tổng hợp vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học trên nền nhựa polyvinyl alcohol” [4]. Năm 2005, Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh đã nghiên cứu về “Các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”. Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh đã nghiên cứu về“Vi khuẩn A. xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng” [9]. 10 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Khả năng giải phóng của màng BC được lên men từ ba loại môi trường: MT chuẩn, MT nước vo gạo, MT nước dừa già. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn dùng lên men thu vật liệu BC được nuôi cấy tại Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.2.2. Nguyên liệu và hóa chất • Nguyên liệu: nước dừa già, nước vo gạo, nước cất 2 lần. • Hóa chất: - Thuốc Diclofenac natri dạng tinh khiết Hình 2.1: Thuốc Diclofenac natri dạng tinh khiết - Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali dihidrophotphat, cao nấm men, axit clohidric, 11 2.2.3. Các thiết bị - Máy đo quang phổ UV – Vis 2450 (Shimadru – Nhật Bản) - Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA (Nhật Bản) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức) - Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu - Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác 2.3. Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy màng BC và xử lý màng. - Tiến hành thực nghiệm, đánh giá khả năng giải phóng thuốc của từng loại màng BC khác nhau. - So sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu BC trong 3 loại môi trường nuôi cấy. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Bố trí thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Tạo màng BC từ 3 loại môi trường (MT chuẩn, MT gạo, MT dừa) - Thí nghiệm 2: Xử lý màng BC - Thí nghiệm 3: Tìm phổ hấp thụ và giải phóng của thuốc Diclofenac natri - Thí nghiệm 4: Dựng đường chuẩn Diclofenac natri - Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc Diclofenac natri trong 2 giờ (tiến hành thu các dung dịch mẫu ở các khoảng thời gian 0,5h; 1h; 1,5h; 2h) - Thí nghiệm 6: Cho màng đã nạp thuốc Diclofenac natri giải phóng thuốc trong 24h ở các loại pH khác nhau 12 - Thí nghiệm 7: Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc vào màng ở ba loại môi trường 2.4.2. Phương pháp chế tạo màng BC 2.4.2.1. Lên men thu màng BC Màng BC được tạo từ 3 môi trường khác nhau ở bảng: từ nước vo gạo (MTG), môi trường chuẩn (MTC), nước dừa già (MTD) Bước 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ ở 200 độ C, sau khi sấy xong lấy ra và để nguội Bước 2: Chuẩn bị 3 loại môi trường theo Bảng 2.1 Bảng 2.1: Thành phần trong trong 3 loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn Thành phần Môi trường MT chuẩn MT gạo MT dừa Glucose 20g 20g 20g Pepton 5g 10g 10g Dinatri phosphat 2,7g Diamoni phosphat 0,3g 0,3g Amoni sulfat 0,5g 0,5g Cao nấm men 5g Acid citric 1,15g Nước cất 2 lần 1000 ml Nước dừa già 1000 ml Nước vo gạo 1000 ml Lưu ý: pH của môi trường được hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH; pH của môi trường nằm trong khoảng 4-6 [9]. 13 Bước 3: Hấp khử trùng các môi trường ở 1110C trong 15 phút (phải bọc các bình bằng giấy bạc) Bước 4: Lấy các dung dịch môi trường ra và khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội Bước 5: Bổ sung thêm 2% dung dịch axit axetic rồi lắc đều, sau đó bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trường và dịch giống không bị nhiễm khuẩn) Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày trong điều kiện nhiệt độ ở 280C. Bước 7: Thu màng BC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước (xả nước nhẹ) 2.4.2.2. Xử lý màng BC Mục đích: Thu được màng BC đạt tiêu chuẩn cho nghiên cứu giải phóng thuốc Phương pháp: - Trong nuôi cấy tĩnh, BC tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trường. - Hấp màng trong dung dịch NaOH 3%, nhiệt độ 1130C trong 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn và giải phóng các nội độc tố của vi khuẩn. - Sau đó, ngâm màng BC trong dung dịch HCl 3% (trong khoảng 48h) để trung hòa lượng NaOH - Để màng dưới vòi nước chảy nhẹ để trung hòa lượng acid, đến khi màng chuyển sang màu trắng trong. Thử quỳ tím để kiểm tra, nếu môi trường bề mặt vật liệu là trung tính, ta thu được màng BC đạt tiêu chuẩn. 2.4.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC Mục đích: Kiểm tra sự có mặt của đường glucose trong màng nhằm đảm bảo màng BC đã được loại bỏ các chất chất độc hại và các tạp chất. 14 Nguyên tắc: Sử dụng thuốc thử Fehling. Nếu trong màng có glucose, sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ. Tiến hành: - Mẫu đối chứng là nước cất 2 lần và dung dịch D-glucose - Thu các dịch thử của các loại màng khác nhau - Cho 1ml thuốc thử Fehling vào mỗi ống nghiệm có chứa mẫu thử, đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 phút - Quan sát hiện tượng trong ống nghiệm (chú ý có kết tủa hay không) 2.4.4. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ± 0,005cm [14]. Pha dung dịch Diclofenac natri trong HCl 0,1N với các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%. Sử dụng máy đo quang phổ để đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại các bước sóng 276nm, 278nm, 281nm Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Diclofenac natri và độ hấp thụ. Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R2 là hệ số tương quan Trong đó: y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax x: nồng độ của dung dịch Giá trị OD của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau được thể hiện ở bảng sau: - Ở bước sóng 276nm 15 Bảng 2.2: Giá trị OD của dung dịch diclofenac natri ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 276nm Nồng độ Giá trị OD 276nm (n=3) Giá trị trung bình (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 0,106 0,108 0,107 0,107±0,001 20 0,212 0,216 0,214 0,214±0,001 40 0,424 0,426 0,439 0,43±0,009 60 0,648 0,635 0,640 0,642±0,003 80 0,84 0,88 0,86 0,86±0,006 100 1,08 1,065 1,065 1,07±0,006 Dựng đồ thị biểu diễn và lập phương trình đường chuẩn của thuốc bằng phần mềm Excel 2010 Hình 2.2: Phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri tại bước sóng 276nm Y = 0,199x - 0,1427 (R2=0,9923) 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 2 4 6 8 OD 276nm OD 276nm M ật đ ộ q u an g ( O D ) Nồng độ Diclofenac natri(mg/ml) 16 - Ở bước sóng 278nm Bảng 2.3: Giá trị OD của dung dịch diclofenac natri ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm Nồng độ Giá trị OD 276nm (n=3) Giá trị trung bình (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 0,119 0,111 0,121 0,117±0,013 20 0,20 0,27 0,22 0,23±0,013 40 0,50 0,44 0,47 0,47±0,013 60 0,67 0,74 0,69 0,7±0,04 80 0,92 0,97 0,94 0,94±0,006 100 1,165 1,179 1,166 1,171±0,001 Dựng đồ thị biểu diễn và lập phương trình đường chuẩn của thuốc bằng phần mềm Excel 2010 Hình 2.3: Phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri tại bước sóng 278nm y = 0.218x - 0.1583 R² = 0.9917 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 2 4 6 8 OD 278nm OD 278nm M ật đ ộ q u an g ( O D ) Nồng độ Diclofenac natri(mg/ml) 17 - Ở bước sóng 281nm Bảng 2.4: Giá trị OD của dung dịch diclofenac natri ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 281nm Nồng độ Giá trị OD 276nm (n=3) Giá trị trung bình (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 0,118 0,123 0,119 0,13±0,002 20 0,25 0,25 0,25 0,26±0,014 40 0,49 0,46 0,47 0,48±0,001 60 0,78 0,75 0,72 0,75±0,004 80 0,95 0,98 1,005 0,98±0,04 100 1,262 1,241 1,235 1,241±0,001 Dựng đồ thị biểu diễn và lập phương trình đường chuẩn của thuốc bằng phần mềm Excel 2010 Hình 2.4: Phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri tại bước sóng 281nm y = 0.2297x - 0.1667 R² = 0.9926 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 2 4 6 8 OD 281nm OD 281nm M ật đ ộ q u an g ( O D ) Nồng độ Diclofenac natri(mg/ml) 18 Ta thu được 3 phương trình đường chuẩn của Diclofenac natri ở 3 bước sóng khác nhau: - Bước sóng 276nm: Y = 0,199x - 0,1427 (R2=0,9923) - Bước sóng 278nm: Y = 0,218x – 0,1583 (R2= 0,9917) - Bước sóng 281nm: Y = 0,2297x – 0,1667 (R2= 0,9926) Trong đó: x: Nồng độ Diclofenac (mg/ml) y: giá trị OD tương ứng R2: Hệ số tương quan 2.4.5. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC được tiến hành thí nghiệm trên 2 loại mẫu: Mẫu 1: Sử dụng màng BC có độ dày 0,5cm Mẫu 2: Sử dụng màng BC có độ dày 1cm Sau khi tinh chế màng BC, lấy một nửa số màng ép nước 50%, một nửa còn lại giữ nguyên sau đó cho vào bình tam giác có dung tích 100ml dung dịch Diclofenac natri Cho các bình tam giác trên vào máy rung siêu âm ở điều kiện nhiệt độ 370 C. Sau các khoảng thời gian 0,5h; 1h; 1,5h; 2h tiến hành rút mẫu, sử dụng máy UV-2450 để đo giá trị OD của từng mẫu Từ đó xác định được lượng thuốc hấp thụ vào màng BC. 2.4.6. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng Lượng thuốc được giải phóng qua hệ thống vận tải được tiến hành thử nghiệm ở các dung dịch môi trường có pH là 2; 4,5; 6,8; 7,4 Pha 4 dung dịch đệm có pH như trên - Dung dịch đệm pH = 2,0 + 6,57g kali clorid + 119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M 19 + Thêm nước vừa đủ 1.000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH). - Dung dịch đệm pH = 4,5 + 6,8g kali dihydro phosphat + 1.000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH). - Dung dịch đệm pH = 6,8 + 28,8g dinatri hydrophosphat 11,45g kali dihydrophosphat + Thêm nước vừa đủ 1.000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). - Dung dịch đệm pH = 7,4 + 0,6g kali dihydrophosphat + 6,4g dinatri hydrophosphat + 5,85g natri clorid + Thêm nước vừa đủ 1.000 ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH) 2.4.7. Nghiên cứu sự giải phóng thuốc từ vật liệu BC nạp thuốc Cách tiến hành - Lấy vật liệu BC đã được nạp thuốc Diclofenac natri với độ dày 0,5cm và 1cm, độ rộng (1,5x1,5) với trạng thái không ép nước và ép nước 50% cho vào các bình chứa 900ml môi trường có độ pH lần lượt là 2; 4,5; 6,8 và 7,4. - Đặt lên máy khuấy từ gia nhiệt với tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37oC ± 0,5oC. - Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó. - Số lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung lại 5ml dung dịch đệm có độ pH tương ứng. 20 - Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị trung bình. Tỉ lệ thuốc giải phóng được tính theo công thức: R% = 𝐂𝐭𝐱𝐕𝟏+ ∑ 𝐂𝐢𝐱𝐕𝟐 𝐢=𝐧−𝟏 𝐢=𝟏 𝐦 x 100% Trong đó: R: Tỉ lệ giải phóng thuốc Ct: Nồng độ của dung dịch Diclofenac natri trong dung dịch tại thời điểm t V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào m: Khối lượng thuốc hấp thu vào các vật liệu BC 2.4.8. Xử lý thống kê Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2010 và được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. Các thông số động học giải phóng thuốc được tính toán, xử lý bằng công cụ DDSolver trong Excel [24]. 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo màng BC lên men từ 3 loại môi trường (MT chuẩn, MT gạo, MT dừa) Trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn sử dụng chất dinh dưỡng từ môi trường để sinh trưởng và phát triển. Ở 2 ngày đầu, vi khuẩn đang trong quá trình làm quen với môi trường, tích lũy năng lượng và chất dinh dưỡng cho các giai đoạn tiếp theo, lúc này pH môi trường giảm nhẹ do có sinh ra acid. Các ngày tiếp theo, vi khuẩn sản sinh ra một lớp màng BC trên bề mặt môi trường nuôi cấy, màng có màu trắng đục, lẫn tạp chất. Lớp màng dày dần cho đến khi môi trường hết các chất dinh dưỡng. Màng BC được nuôi cấy tĩnh trong các môi trường khác nhau được thể hiện ở hình 3.1 Hình 3.1: Nuôi cấy màng BC trong 3 loại môi trường 22 Qua thực nghiệm, có thể rút ngắn thời gian tạo màng bằng cách: - Sau khi thu màng BC, ta sử dụng lại phần dịch như dịch giống, để ở diều kiện nuôi cấy trong phòng sạch. - Sau khoảng 4-6 ngày, ta thu được màng BC thô. Tinh chế màng: Trong quá trình nuôi cấy, khi màng đã đạt đến độ dày phù hợp, ta tiến thành thu màng. Hình 3.2: Màng BC thu được sau quá trình nuôi cấy Sau quá trình tinh chế, thu được màng BC đáp ứng yêu cầu, có độ đàn hồi tốt, mềm mại, dễ gấp mà không cần thêm vật liệu dẻo, không bị khô khi để ở ngoài không khí 3.2. Hấp thụ thuốc Diclofenac natri Tiến hành thí nghiệm hấp thụ thuốc vào màng BC Lượng thuốc được hấp thụ vào các loại màng như sau: 23 Bảng 3.1: Lượng thuốc hấp thụ vào các loại màng khác nhau Loại màng BC Lượng thuốc hấp thụ (mg) Màng dày 0,5cm Màng dày 1cm Màng chuẩn Không ép nước 22,7 ± 0,0018 22,4 ± 0,0025 Ép nước 50% 22,9 ± 0,0026 22,5 ± 0,0027 Màng gạo Không ép nước 22,27 ± 0,0014 21,66 ± 0,0016 Ép nước 50% 22,32 ± 0,0018 21,88 ± 0,002 Màng dừa Không ép nước 22,1 ± 0,0025 22,02 ± 0,0017 Ép nước 50% 22,47 ± 0,0024 22,34 ± 0,0021 3.3. Xác định lượng thuốc giải phóng ra khỏi màng BC Sau khi hấp thụ thuốc, màng BC được cho vào các khay nhỏ, bảo quản trong tủ lạnh Hình 3.3: Màng BC thu được sau quá trình hấp thụ thuốc Cho màng BC vào các dung dịch đệm có độ pH lần lượt là 2; 4,5; 6,8; 7,4 (mỗi bình có dung tích 900ml). Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/ phút ở nhiệt độ 37oC 24 Hình 3.4: Màng được cho vào máy giải phóng Sau các khoảng thời gian: 0,5h; 1h; 2h; 4h; 6h; 8h; 10h; 12h; 24h tiến hành rút 5ml dịch ra, đo OD, đồng thời bổ sung lại 5ml dịch đệm có độ pH tương ứng Hình 3.5: Mẫu được rút ra để đo quang phổ Sau khi tiến hành lấy mẫu và đo 3 lần để lấy kết quả trung bình. Tiến hành đo OD, từ đó tính được tỉ lệ thuốc giải phóng. 25 3.3.1. Xác định lượng thuốc Diclofenac natri giải phóng từ màng BC lên men từ môi trường chuẩn Lượng thuốc được giải phóng khỏi màng BC có độ dày 0,5 cm và 1cm trong các khoảng thời gian khác nhau ở các dung dịch có độ pH khác nhau được thể hiện ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Bảng 3.2: Tỉ lệ (%) thuốc giải phóng của màng BC tạo ra từ môi trường chuẩn (Màng BC không ép nước) pH Thời gian Độ dày màng 0,5 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 24 h 2 0,5cm 10,24 ± 0,0082 12,71 ± 0,0098 13,82 ± 0,036 13,96 ± 0,041 14,73 ± 0,022 15,64 ± 0,014 16,55 ± 0,045 17,60 ± 0,024 17,98 ± 0,046 1cm 10,89 ± 0,0023 13,27 ± 0,016 13,59 ± 0,024 14,60 ± 0,035 15,22 ± 0,031 16,61 ± 0,022 17,70 ± 0,061 18,19 ± 0,035 18,33 ± 0,034 4,5 0,5cm 11,13 ± 0,0061 12,35 ± 0,043 12,78 ± 0,041 13,67 ± 0,029 14,09 ± 0,008 15,33 ± 0,036 15,49 ± 0,037 16,82 ± 0,02 17,98 ± 0,026 1cm 11,36 ± 0,045 13,81 ± 0,019 14,53 ± 0,025 14,94 ± 0,024 16,00 ± 0,011 16,48 ± 0,017 17,57 ± 0,044 18,13 ± 0,034 18,64 ± 0,042 6,8 0,5cm 12,54 ± 0,018 13,26 ± 0,024 13,82 ± 0,031 15,26 ± 0,031 16,22 ± 0,014 17,11 ± 0,028 17,47 ± 0,022 17,71 ± 0,026 18,02 ± 0,011 1cm 12,81 ± 0,036 16,00 ± 0,025 16,71 ± 0,039 17,03 ± 0,011 17,74 ± 0,021 18,34 ± 0,009 18,71 ± 0,036 19,43 ± 0,022 19,78 ± 0,041 7,4 0,5cm 11,28 ± 0,044 13,26 ± 0,019 13,61 ± 0,022 13,83 ± 0,017 15,63 ± 0,015 16,19 ± 0,035 16,35 ± 0,012 16,78 ± 0,036 17,31 ± 0,029 1cm 11,81 ± 0,014 14,87 ± 0,022 15,30 ± 0,016 16,86 ± 0,023 16,95 ± 0,024 17,03 ± 0,046 17,65 ± 0,044 18,01 ± 0,028 18,77 ± 0,037 26 Bảng 3.3: Tỉ lệ (%) thuốc giải phóng của màng BC tạo ra từ môi trường chuẩn (Màng BC ép nước 50%) pH Thời gian Độ dày màng 0,5 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 24 h 2 0,5cm 10,26 ± 0,035 12,34 ± 0,034 12,78 ± 0,034 13,21 ± 0,018 13,62 ± 0,022 14,23 ± 0,027 15,97 ± 0,034 16,24 ± 0,021 16,98 ± 0,041 1cm 11,24 ± 0,01 12,47 ± 0,015 12,97 ± 0,042 13,79 ± 0,37 14,69 ± 0,046 15,92 ± 0,022 16,88 ± 0,047 17,08 ± 0,043 17,81 ± 0,024 4,5 0,5cm 11,03 ± 0,016 11,20 ± 0,022 11,77 ± 0,019 12,7 ± 0,028 13,53 ± 0,021 14,54 ± 0,046 15,41 ± 0,016 16,92 ± 0,018 17,69 ± 0,016 1cm 12,22 ± 0,031 13,18 ± 0,018 13,91 ± 0,025 14,56 ± 0,011 16,14 ± 0,023 16,51 ± 0,013 17,39 ± 0,011 18,49 ± 0,029 18,81 ± 0,027 6,8 0,5cm 11,37 ± 0,025 12,53 ± 0,016 13,41 ± 0,027 14,24 ± 0,022 15,07 ± 0,036 15,39 ± 0,027 16,25 ± 0,038 17,98 ± 0,047 19,78 ± 0,032 1cm 12,09 ± 0,028 13,31 ± 0,022 14,85 ± 0,016 16,33 ± 0029 17,35 ± 0,028 18,5 ± 0,009 18,30 ± 0,016 18,52 ± 0,014 19,31 ± 0,029 7,4 0,5cm 10,81 ± 0,016 12,21 ± 0,023 12,72 ± 0,029 13,04 ± 0,044 14,68 ± 0,045 15,96 ± 0,011 17,22 ± 0,022 18,57 ± 0,036 19,02 ± 0,018 1cm 11,64 ± 0,35 13,91 ± 0,031 14,70 ± 0,034 15,47 ± 0,016 16,08 ± 0,038 16,55 ± 0,031 17,26 ± 0,035 17,64 ± 0,011 18,87 ± 0,023 27 Dựng đồ thị biểu di