Khóa luận Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối và hàm lượng β-Glucan ở một số chủng nấm hương nuôi cấy trong môi trường lỏng

,... [3]. Chihara [7] đã chứng minh khả năng của Lentinan trong kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng. Đặc biệt, Lentinan làm giảm mạnh ảnh hưởng trong hóa trị liệu lao, chống bội nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân HIV. 2.2.3. Ứng dụng của β-glucan Ứng dụng của β-glucan trong thực phẩm: β-glucan trong tự nhiên rất sạch, có khả năng giữ nước cao, không tạo gel, không bị phân hủy bởi enzym tiêu hóa ở người, vì vậy chúng thích hợp như một nguồn xơ thực phẩm. Khi β-glucan đi qua ruột già, nó bị phân hủy một phần bởi hệ vi khuẩn ruột mà không làm mất tính giữ nước của chúng. Quá trình lên men này tạo ra các chuỗi axít béo ngắn (chủ yếu là acetat, propionat, butyrat) có lợi cho tế bào nhầy lót ruột. Dung tích giữ nước của β-glucan lớn hơn rất nhiều so với những chất xơ thực vật và hạt khác. Do đó, β-glucan được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa [6]. Đặc biệt với hoạt tính sinh học cao β-glucan đang được ứng dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm chức năng. Ứng dụng của β-glucan trong y dược: Nhiều nghiên cứu đã cho thấy β-glucan có tác động lên hệ thống miễn dịch thông qua cơ chế kích thích đại thực bào, nâng cao khả năng của đại thực bào hoặc tạo ra các chất trung gian hoạt hóa oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ. Trên lâm sàng β-glucan được sử dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư. Đối với bệnh nhân ung thư phải điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu xạ β-glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi máu khi chiếu xạ, kích thích sự phục hồi tủy xương sau hóa trị liệu và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh trong quá trình điều trị. Bên cạnh đó, β-glucan còn có hiệu quả kháng khối u, giảm kích cỡ khối u [6, 7]. Ứng dụng của β-glucan trong mỹ phẩm: β-1,3-glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da. Tế bào Langerhans là một loại tế bào đại thực bào chuyên hóa nằm trên da hoạt động tương tự như đại thực bào. β-1,3-glucan làm se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và elastin, giảm màu đỏ, giảm kích thích và sự khô da, giảm số lượng và kích cỡ tổn thương trên da. β-1,3-glucan có thể thêm vào kem bôi da, mỹ phẩm thuốc mỡ, kem cạo râu và nói chung là các sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với da [6]. Ứng dụng của β-glucan trong nuôi trồng thủy sản: Tôm sú là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nhưng các loại bệnh virus và vi khuẩn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm và dẫn đến ảnh hưởng tới kinh tế hộ nông dân nói riêng, kinh tế đất nước nói chung. Có một số nghiên cứu sử dụng β-glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản [6]. Chang cheng-Fang và cs.(2000) đã nghiên cứu hiệu quả của β-1,3-glucan lên sự sống sót của tôm sú lớn (Penaeus monodon). Tôm được bổ sung β-1,3-glucan (2g/kg trọng lượng) trong 40 ngày. Kết quả nhận được cho thấy lượng tôm sống sót trong lô có bổ sung β-1,3-glucan cao hơn hẳn (p<0,001) so với lô đối chứng [6]. Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs.(1995) cho thấy khi bổ sung β-glucan vào thức ăn hàng ngày của cá hồi Atlantic (Salmo salar) với hàm lượng 1g/kg thức ăn trong 12 tuần trước khi nhiễm nguồn bệnh, lượng cá sống sót tăng lên rất nhiều [6]. 2.2.4. β-glucan trong nấm Hương Trong nấm Hương chứa một lượng β-glucan, tên là Lentinan. Lentinan là một β-glucan có chứa các liên kết glicozit β-1,3: β-1,6. Lentinan là một polysaccarit không chứa nitơ, trọng lượng phân tử xấp xỉ 500 000 Da [14]. Lentinan được chiết suất từ thể quả cũng như từ sinh khối sợi nấm. Hình 2.3. Công thức cấu tạo Lentinan β-D-glucopyranosyl-(1→6)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranose Lentinan là hợp chất quan trọng của hệ sợi nấm Hương cũng như của thể quả nấm. Lentinan tạo nên các tính chất dược lý của nấm Hương. Các nhà nghiên cứu đã ghi nhận rằng Lentinan có khả năng tăng cường các phản ứng miễn dịch, có tính chất chống ung thư mạnh, có tác dụng chống virus, tính kháng sinh [20,21]. Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato (1999) về hàm lượng β-glucan chứa trong một số loại nấm ăn thì trong nấm Hương (Lentinula edodes) lượng β-glucan khoảng 0,22g/100g chất khô, trong nấm Sò (Pleurotus ostreatus) là khoảng 0,30g/100g chất khô, trong nấm Sò vua (Pleurotus eryngii) là khoảng 0,32g/100g chất khô, trong nấm Sò xám (Pleurotus pulmunarius) là khoảng 0,53g/100g chất khô. Như vậy, hàm lượng β-glucan có trong các loại nấm ăn dao động trong khoảng 0,22g – 0,53g/100g chất khô [19]. 2.2.5. Các phương pháp tách chiết β-glucan Bản chất β-glucan là một polysaccarit do đó các phương pháp tách chiết β-glucan cũng dựa trên nguyên lý chung tách chiết các polysaccrit. Cơ bản có 2 phương pháp tách chiết β-glucan là phương pháp hóa học và phương pháp enzym. - Phương pháp hóa học: thường sử dụng dung môi natri hydroxide (NaOH) hay kali hydroxide (KOH), hoặc natri hydro cacbonat (NaHCO3), hoặc natri cacbonat (Na2CO3) để chiết β-glucan. Sau đó tiến hành ly tâm thu hồi và tinh chế. Phương pháp hóa học thích hợp với các mẫu phân tích chứa lớn hơn 20% glucan tổng số. Theo nghiên cứu của Mỹ các phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi 50-80%, quy trình đơn giản, không tốn kém tuy nhiên thời gian tách chiết lâu [24]. - Phương pháp enzym: sử dụng enzym β-1,3-glucanase để tách chiết β-glucan sau đó tiến hành tinh chế. Phương pháp enzym thích hợp với các mẫu phân tích có chứa hàm lượng β-glucan thấp. Phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chi phí cao [17]. 2.3. MỘT SỐ SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI TỪ NẤM HƯƠNG Ngoài sản phẩm nấm Hương tươi, hiện nay còn một số sản phẩm từ nấm phổ biến như sau: - Thể quả thu hái tự nhiên được sấy khô, hoặc nghiền thành bột mịn rồi đóng viên con nhộng hay viên nén. - Bột thể quả nấm nuôi trồng nhân tạo. - Dịch chiết thu được do chiết nước nóng hay chiết bằng ethanol từ bột thể quả, dịch chiết cô đặc. - Các chế phẩm sấy khô và nghiền mịn từ giá thể hỗn hợp gồm hệ sợi nấm, giống nấm và môi trường rắn ăn được (thường là hạt). - Sinh khối hoặc dịch chiết từ sinh khối sợi nấm hoặc từ môi trường lên men. - Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): chiết suất từ hệ sợi nấm Hương lên men giá thể bã mía. LEM được tách chiết từ hệ sợi nấm, ở dạng bột. Trong 1 kg bột chứa 6-7g LEM. - Chế phẩm LAP là dung dịch hệ sợi nấm Hương + 4 lần thể tích ethanol. LAP ≈ 0,3g LEM. Các sản phẩm trên được thấy phổ biến ở các nước có ngành công nghiệp nấm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ [4, 5]. 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NẤM HƯƠNG 2.4.1. Tình hình ngoài nước Nấm Hương được nuôi trồng nhân tạo tại Trung Quốc từ cách đây trên 1000 năm tức là từ thời Bắc Tống (960 - 1127). Đầu thế kỷ XX nấm Hương đã được nuôi trồng nhân tạo ở quy mô công nghiệp tại Nhật, Pháp, Mỹ. Gần đây Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên là những nước trồng nhiều nấm Hương nhất trên thế giới. Tổng sản lượng hàng năm đạt trên 1 triệu tấn. Sản phẩm nấm được sử dụng chủ yếu ở dạng tươi và sấy khô. Các nước này còn phát triển sản xuất sinh khối sợi nấm Hương và đang cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước một số sản phẩm dạng bột và dạng lỏng rất có giá trị về dinh dưỡng và phòng trị bệnh. Đặc tính làm lành vết thương của nấm đã được biết đến từ hàng ngàn năm nay, với báo cáo đầu tiên về khả năng y học của chúng được đánh dấu khoảng 3000 năm trước, mặc dù đặc tính này do một số thành phần khác nhau của nấm nhưng β-glucan lôi kéo sự chú ý hơn cả. Năm 1969 các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng nấm Hương có chứa một loại polysaccarit tên là Lentinan. Chất này có tác dụng nâng cao tính miễn dịch của cơ thể và có tác dụng chống khối u [1]. Người ta đã phát hiện ra rằng hiệu lực kháng khối u của glucan là kêt quả kích thích tế bào miễn dịch chứ không phải là độc tính trực tiếp của glucan đối với tế bào khối u. Từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đã thử tách chiết β-glucan từ nấm lớn và nó trở thành hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản. Trong 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu đã góp phần to lớn vào việc định loại. tách chiết, định lượng, định tính các thành phần khác nhau của β-glucan. Các nhà khoa học và các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực ngày càng chú ý hơn đến việc sử dụng β-glucan để giải quyết nhiều vấn đề liên quan đến đáp ứng miễn dịch [1]. Có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của β-glucan nhưng kết quả đôi khi trái ngược nhau. Điều này chủ yếu là do sử dụng β-glucan có trọng lượng phân tử khác nhau và sự thay đổi hóa học do β-glucan được nhận từ các nguồn nấm khác nhau. Hiệu quả miễn dịch của β-glucan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh của phân tử, độ dài của polyme và cấu trúc bậc 3 của nó [6]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan có nhiều trong nấm như là nấm Linh Chi, nấm Sò, nấm Hương, nhiều nhất là trong thành tế bào nấm men bánh mỳ. β-glucan trong yến mạch và lúa mạch có rất ít hoặc không có hoạt tính. Nhưng trong nước của yến mạch có thể giảm nguy cơ bệnh tim [6]. Do những giá trị dinh dưỡng và tác dụng phòng, chữa bệnh của nấm Hương cũng như hệ sợi nấm Hương đem lại nên gần đây các nhà khoa học trên thế giới đang ngày càng chú ý đến việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm, vì điều kiện phát triển hệ sợi không yêu cầu khắt khe như nuôi lấy thể quả, thời gian nuôi cấy lại rút ngắn. Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến để làm giá thể nuôi cấy nấm trên môi trường rắn và lỏng. Điều này có ý nghĩa rất lớn vừa giảm thiểu được ô nhiêm môi trường vừa tạo ra được thực phẩm. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Từ lâu nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam. Tuy nhiên việc ươm trồng loại nấm này ở nước ta vẫn chưa được phát triển nên phần lớn nấm được sử dụng ở dạng quả thể nấm khô nhập khẩu từ Trung Quốc. Có thể tìm thấy nấm Hương dạng quả thể khô ở khắp các siêu thị ở nước ta, và có bán trên thị trường do nhu cầu sử dụng rộng rãi của người dân. Hiện nay có một số tỉnh trồng nấm Hương với quy mô nhỏ vì còn phù thuộc vào điều kiện thời tiết, nó chỉ hợp với với nhiệt độ vào mùa đông ở miền Bắc nước ta. Một số tỉnh triển khai trồng nầm như: Cao Bằng, Hà Giang, Lạng Sơn, Lào Cai … Các nghiên cứu liên quan đến công nghệ trồng nấm Hương từ trước đến nay chủ yếu là dạng truyền thống tức là sử dụng giá thể rắn để trồng nấm thu quả thể. Hiện nay chưa có một công bố kết quả nghiên cứu liên quan đến sản xuất sinh khối sợi nấm. Các nghiên cứu về tách chiết hoạt chất nấm cũng không nhiều, chủ yếu tập trung trên nấm dược liệu như nấm Linh Chi. Năm 2000, Phòng Công nghệ sinh học và Kỹ thuật hạt nhân Đà Lạt Trường Đại học Tây Nguyên đã công bố kết quả lên men dịch thể hệ sợi nấm Hương. Kết quả cho thấy có thể thu sinh khối thuần khiết với hiệu suất cao sau 20-30 ngày nuôi cấy, tùy theo thể tích bình lên men và điểu kiện sục khí [3]. Nghiên cứu đã mở ra hướng phát triển về nuôi cấy nấm trong môi trường lỏng. Gần đây các nghiên cứu liên quan đến hoạt chất sinh học, sản xuất thực phẩm chức năng đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Năm 2005 Nguyễn Thị Chính và CS đã tiến hành các nghiên cứu về công nghệ sản xuất nấm dược liệu, bao gồm các nghiên cứu về nấm Hương như là nghiên cứu đặc tính sinh học và công nghệ nuôi trồng nấm Hương, hoạt tính kháng sinh của Lentinula edode. Nghiên cứu gần đây về β-glucan là tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men của viện Công nghiệp Thực phẩm (2005). Điều này cho thấy nhu cầu ngày càng lớn về thực phẩm chức năng và hướng phát triển của nghành thực phẩm chức năng trong tương lai. 2.5. NUÔI CẤY HỆ SỢI NẤM HƯƠNG TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG 2.5.1. Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log). Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khi nhiều có thể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn. Ưu điểm của phương pháp: - Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất được sinh tổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao. - Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh được nhiễm khuẩn. - Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lý của vi sinh vật. - Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công. Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Các phương pháp lên men chìm - Lên men gián đoạn: Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệ thống đóng kín. Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù: Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn. logxx III IV II I t |h| Hình 2.4. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật (I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn) - Lên men bổ sung: Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm men). Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi. Phải bổ sung tiền chất liên tục. 2.5.2. Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương Nuôi cấy nấm Hương trong môi trường lỏng cần chú ý tới nhu cầu dinh dưỡng như sau: - Về nguồn cacbon, nấm Hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa (như tinh bột, chất xơ, chất gỗ). - Về nguồn nitơ, nấm Hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ như protein, peptit, axit amin hay urê hoặc đạm vô cơ như các muối amôn. Nấm Hương không đồng hóa được nitơ trong nitrat, nitrit. Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1. Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1. Theo nghiên cứu này bổ sung cám gạo vào môi trường đến một lượng nhất định thu được kết quả tỷ lệ C:N phù hợp nhất là 30:1 cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [18]. - Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn. Khi nuôi trồng nấm Hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1. Các vitamin khác nấm Hương đều có thể tự tổng hợp. Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cần bổ sung 100μl vitamin B1. Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật như gibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụng xúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [1]. Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấm Hương. 2.5.3. Ảnh hưởng của chủng giống Theo một số kết quả nghiên cứu thấy rằng cùng một loài nấm Hương, nhưng các chủng giống nấm khác nhau tốc độ phát triển của chúng cũng khác nhau. Mata và CS khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm dao động từ 4,9 đến 7,1cm. Chủng Q616 có đường kính phát triển thấp nhất là 4,9cm, chủng M115 và V084 có đường kính phát triển lớn nhất sau 7 ngày nuôi cấy. Các chủng còn lại có đường kính từ 5,9cm đến 6,8cm [8]. Theo nghiên cứu của De Carvalho thì đường kính phát triển của 2 chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch là khác nhau. Sau 10 ngày, kết quả đo đường kính phát triển của chúng tương ứng là 9,2cm và 4,5cm [13]. Như vậy các chủng nấm Hương khác nhau thì tốc độ phát triển khác nhau, sinh khối thu được cũng khác nhau và hàm lượng β-glucan chứa trong nó cũng khác nhau. 2.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương Nồng độ ôxy: Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí. Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC. Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4mg/ml. Trong khi nuôi cấy có lắc với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tăng lên 5mg/ml [9]. Nhiệt độ môi trường: Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 20 đến 25oC. Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng của nước ta. Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC sự sinh trưởng của hệ sợi nấm bị hạn chế. Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [1]. Độ pH môi trường: Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và CS thì pH tối ưu cho sợi nấm Hương phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5 [9]. Cường độ ánh sáng: Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi. Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt. Đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [22]. Phần III ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm Hương nghiên cứu đều do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp. 1. Chủng nấm Hương Ld có nguồn gốc xuất xứ từ Ý. 2. Chủng nấm Hương Lg có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc. 3. Chủng nấm Hương Lc có nguồn gốc xuất xứ từ Cao Bằng. 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất tiến hành ` a) Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu - Cân phân tích. - Máy quang phổ tử ngoại – khả biến U-1800 của Nhật Bản. - Máy ly tâm HERMLE Z300 của Đức. - Máy lắc ORBIT 1900 của Nhật Bản. - Tủ cấy vi sinh vật. - Tủ sấy mẫu. - Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật. - Dụng cụ thủy tinh các loại: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, ống đong, phễu, cốc, đũa thủy tinh, Micropipet loại 1 ml và 0,2ml. - Dụng cụ kim loại như que cấy, que trang, dụng cụ đục thạch. - Các dụng cụ khác như bông thấm nước, bông không thấm nước, đèn cồn, giấy báo, nồi nấu, dao thái, giấy đo pH, thang đo pH. b) Hóa chất nghiên cứu - Hóa chất bổ sung môi trường: axít lactic, đường glucose, cám gạo,.... - Hóa chất phân tích β-glucan: D-glucose tinh khiết, phenol, axít sulfuric 96%, cồn 96o. c) Môi trường nuôi cấy - Môi trường thạch PDA: 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar. Tính cho 1 lít. - Môi trường lỏng PDR: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít. 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm - Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất luợng nông sản thực phẩm - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch. Địa chỉ: Số 4 - Ngô Quyền - Hà Nội. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA. - Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR. - Xác định và so sánh hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm ở một số chủng nấm Hương phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.3.1.1. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA, pH trong khoảng 5, nhiệt độ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm là 25oC. Sau đó, xác định đường kính phát triển hệ sợi nấm của các chủng giống sau từ 3 đến 9 ngày nuôi cấy. Từ kết quả thu được đánh giá tốc độ phát triển của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa để kết luận chủng giống nào phát triển tốt nhất trên môi trường rắn làm cơ sở cho sự nghiên cứu phát triển của các chủng giống này trong môi trường nuôi cấy lỏng tiếp theo. Nhân và làm sạch giống trên đĩa thạch: Tiến hành nhân giống trên đĩa thạch từ ống giống. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa. So sánh theo sinh khối trên đĩa thạch: Sau khi nhân giống 10 ngày, tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của 3 chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA thông qua đo đường kính hệ sợi nấm. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa. 3.3.1.2. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR Tiến hành cấy chuyển từ các đĩa thạch đã được bảo quản ở 5oC sau 10 ngày nhân giống như đã nêu ở mục 3.3.1.1 sang môi trường lỏng PDR. Chuẩn bị 5 bình/giống x 3 giống = 15 bình. Nuôi cấy ở cùng điều kiện của môi trường phòng thí nghiệm (20 - 30oC), pH trong khoảng 4 - 5, tốc độ lắc 120 vòng/phút (lắc 8 giờ/ngày chia làm 2 lần). Lấy mẫu để xác định khối lượng sinh khối khô vào ngày 22. Kết quả cần xác định là khả năng phát triển sinh khối của các chủng giống để xem chủng nào có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường lỏng. 3.3.1.3. Thí nghiệm phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối ở các chủng nấm Hương Để đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi của 3 chủng nấm Hương Ld, Lg, Lc tiến hành thu sinh khối sợi nấm khô từ 3 chủng ở mục 3.3.1.2 và phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối. Số lượng mẫu bố trí là 3 giống x 3 lần lặp = 9 mẫu phân tích. Từ kết quả thu được đánh giá chủng nấm nào cho hàm lượng β-glucan cao nhất. 3.3.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường 3.3.2.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch đĩa PDA Chuẩn bị khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g + 20g glucose + 20g thạch agar và nước cho đủ 1 lít. Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g đun sôi đến chín kỹ rồi lọc qua vải lọc 2 lần. Sau đó mới thêm 20g glucose + 20g thạch agar, bổ sung cho đủ 1 lít rồi đun cho tan thạch. Điều chỉnh pH trong khoảng 5 bằng axít lactic. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 20 phút. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml/đĩa (ф 9) rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Sau đó đậy nắp để thạch đông thì lật ngược lại cho vào tủ ấp. Sau 2 ngày kiểm tra đĩa thạch nào bị nhiễm mốc xanh hay đen thì loại bỏ. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm. 3.1.2.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng PDR Môi trường PDR (200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g định mức 1 lít nước đem đun chín kỹ rồi bổ sung 25g cám gạo vào và khuấy đều. Đem lọc qua vải lọc 2 lần rồi lọc tiếp bằng vải lọc malt 2 lần. Sau đó định lượng đến 1 lít, bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH đến khoảng 4 - 5. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1at trong 30 phút. 3.3.3. Phương pháp nuôi cấy 3.3.3.1. Phương pháp đặt thạch Thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Dùng que cấy móc, khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Khi móc nguội dùng lấy sợi nấm trong ống nghiệm giống gốc rồi chấm vào 3 điểm trên đĩa thạch. Sau đó lật ngược lại nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 25oC. Sau 10 ngày khi sợi nấm phát triển rộng thì tiến hành đục lỗ thạch (nơi có sợi nấm phát triển) bằng cái đục tròn rỗng có đường kính 5mm. Dùng kẹp đã khử trùng gắp mảng thạch đường kính 5mm đó đặt vào tâm đĩa thạch khác và tiếp tục nuôi ở nhiệt độ 25oC trong tủ ấm. Theo dõi sự phát triển thông qua đo đường kính của hệ sợi nấm. 3.3.3.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng Cấy chuyển sang môi trường lỏng: Tiến hành trong tủ cấy vô trùng, đục lỗ thạch bằng dụng cụ đục lỗ có đường kính 5mm như đã nêu ở mục 3.3.3.1, gắp cho vào mỗi bình 5 miếng thạch. Đậy nút bông và đặt trên máy lắc. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 120 vòng/phút (8h/ngày), trong 22 ngày. 3.3.4. Phương pháp xác định lượng sinh khối tươi và khô Sử dụng loại giấy lọc có đường kính 9mm, sấy vải lọc ở nhiệt độ 120oC trong thời gian 4h. Sau đó để nguội trong bình hút ầm có silicagel. Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng. Dùng các giấy lọc đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi nuôi cấy. Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc. Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc. Sấy ở nhiệt độ 60oC trong 18h rồi đem để nguội trong bình hút ẩm trước khi cân. Tính toán khối lượng sinh khối khô thông qua chênh lệch khối lượng. Lượng sinh khối được tính theo mg trên 1 ml môi trường. Giá trị trung bình được tính từ 5 mẫu song song. 3.3.5. Phương pháp phân tích hàm lượng β-glucan Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato hàm lượng β-glucan trong nấm Hương khoảng 0,22g/100g chất khô [19]. Như vậy, để tách chiết và phân tích được lượng β-glu