Khóa luận Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn

uốc để điều trị viêm xương khớp phổ biến là Diclofenac natri. Thuốc Diclofenac là biệt dược thuộc dẫn chất của acid phenylacetic cho nên sẽ có những khả năng chống viêm không steroid với các công dụng hiệu quả về chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. Thuốc Dicofenac sau khi sử dụng được dung nạp dễ dàng thông qua đường tiêu hóa và hấp thụ một cách nhanh chóng hơn nếu sử dụng thuốc vào lúc đói. Trong huyết tương nồng độ sẽ đạt mức tối đa sau 2 2 tiếng hấp thu, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch sau khi sử dụng thuốc từ 4 đến 6 tiếng sẽ đạt mức cao nhất[]. Màng cellulose vi khuẩn (CVK) được tạo ra từ vi khuẩn Gluconacerobacter xylinus có cấu trúc hóa học gần giống với cellulose thực vật nhưng có 1 số tính chất ưu việt hơn [1] đó là không có sự kết hợp của các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến, mà được cấu thành từ các sợi microfibrin, từ đây tạo nên các bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với những vượt bậc hơn cellulose của thực vật. Ngoài ra CVK bền, sức căng lớn và nó còn là 1 mạng lưới polymer sinh học dẻo dai, có khả năng giữ nước rất lớn và đặc biệt còn là màng kháng khuẩn[2]. Nhờ những ưu điểm trên mà hiện nay màng CVK được các nhà khoa học rất quan tâm và được coi là nguồn nguyên liệu mới trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau như màng bọc thực phẩm, mặt nạ dưỡng da, màng phân tách trong quá trình xử lí nước, trong lĩnh vực y học, màng CVK được nghiên cứu và ứng dụng trong quá trình điều trị bỏng, loét da,[3] đáng chú ý nhất là trong hệ thống kiểm soát vận chuyển thuốc, kết quả cho thấy màng CVK giúp thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Với mục đích nghiên cứu để bổ sung dẫn chứng về khả năng giải phóng của thuốc Diclofenac natri của vật liệu CVK, tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn” 2. Mục đích của nghiên cứu Khảo sát Diclofenac natri được giải phóng tốt nhất trong điều kiện như thế nào từ loại vật liệu CVK tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn. 3. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: khả năng giải phóng thuốc Diclofenac natri của màng Celluluse vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn. Phạm vi nghiên cứu: các thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm. 3 Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 4. Nội dung nghiên cứu Tạo màng cellulose vi khuẩn tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus được nuôi cấy trong môi trường chuẩn, xây dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri, tiến hành hấp thụ thuốc vào màng cellulose vi khuẩn, nghiên cứu sự giải phóng thuốc từ màng đã được hấp thụ thuốc, tính toán số liệu và xử lý thống kê. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học: + Thêm căn cứ để bổ sung dẫn chứng về khả năng giải phóng của thuốc Diclofenac natri của vật liệu CVK. + Từ thực nghiệm tìm ra thời gian thuốc diclofenac được giải phóng hiệu quả nhất. Ý nghĩa thực tiễn: + Hoàn thiện được sơ đồ quá trình tạo màng CVK từ G. Xylinus. + Sử dụng thuốc diclofenac một cách hiệu quả nhất. 4 PHẦN 2. NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Màng VLC tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus 1.1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus 1.1.1.1.Cây phân loại vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus Tên: Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) Chi: Gluconacetobacter Họ: Acetobacteraceae. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của Gluconacetobacter xylinus. G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng. Chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất. G. xylinus có dạng trực khuẩn, kích thước khoảng 2 μm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Bên ngoài các tế bào có một lớp màng nhày bao bọc, mà cellulose là bản chất của lớp màng nhày này. Khi thử bằng thuốc thử Iot và acid sunfuric dạng dung dịch thì bắt màu xanh. Ở điều kiện thích hợp, vi khuẩn phát triển rất mạnh, trong điều kiện tích lũy quá nhiều acid acetic thì hoạt động của vi khuẩn sẽ bị ức chế[4]. 1.1.2. Cellulose vi khuẩn ( CVK ) Năm 1886, A.J. Brown lần đầu tiên trình bày về sự tổng hợp cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter. Tuy nhiên mãi đến nửa sau thế kỷ XX, cellulose vi khuẩn mới thực sự được quan tâm và nghiên cứu. Cấu trúc cellulose vi khuẩn : Cellulose vi khuẩn đựợc cấu tạo bởi chuỗi β-1,4 glucopyranose mạch thẳng đươc tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt trong tự nhiên phải kể đến là Gluconacetobacter.[9] Khi nuôi cấy Gluconacetobacter trên môi trường lỏng, trong điều kiện tĩnh sẽ hình thành nên một lớp màng nhìn giống như thạch dừa, thực chất trong đó là các tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose. Cellulose cấu trúc trong màng CVK có thành phần hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau, đồng thời khả năng kết tinh cao 5 (khoảng 60%), độ polymer hóa lớn nên màng CVK có độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước lớn. Những đặc tính ưu việt hơn hẳn so với cellulose thực vật của cellulose này là: độ chịu lực, tính đàn hồi, độ bền cơ học... Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy đường kính của sợi cellulose vi khuẩn chỉ bằng 1/100 so với sợi cellulose của tế bào thực vật [5]. Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lignin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai. 1.1.3. Môi trường nuôi cấy G. xylinus G. xylinus sinh trưởng và phát triển rất nhanh trong môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu, trong đó không thể không kể đến đường. G. xylinus sử dụng tương đối nhiều đường và nó giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp màng CVK, vi khuẩn G. xylinus được nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện phòng thí nghiệm, sau 7 đến 12 ngày sẽ tạo nên một lớp màng CVK màu trắng như thạch dừa ở phía trên của bình nuôi cấy, ta dễ lấy chúng ra khỏi bình. 1.2. Thuốc Dicofenac natri 1.2.1.Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2 Diclofenac natri là natri 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]phenyl]acetat, phải chứa từ 99,0 đến 101,0% C14H10Cl2 NNaO2, tính theo chế phẩm đã làm khô[12]. * Khối lượng phân tử: 296,148g mol *Loại thuốc: Thuốc chống viêm không steroid. *Chế phẩm: 6 Viên nén, thuốc tiêm, thuốc đạn, thuốc nhỏ mắt, thuốc gel xoa ngoài. 1.2.2. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ. Dễ tan trong methanol, tan trong ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton. 1.2.3. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng Diclofenac, dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin (chất có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tưới máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư đặc biệt ở những người bị bệnh thận hoặc suy tim mạn tính. Với những người bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp và suy tim cấp [6]. Diclofenac được hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa sau khi uống. Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với protein huyết tương, chủ yếu với albumin (99%). Khoảng 50% liều uống được chuyển hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh khả dụng của liều tiêm tĩnh mạch. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương xuất hiện 2 giờ sau khi uống, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch đạt mức cao nhất sau khi uống từ 4 đến 6 giờ. Tác dụng của thuốc xuất hiện 20 - 30 phút sau tiêm bắp, 30 - 60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng, 60 - 120 phút sau khi uống. Nửa đời trong huyết tương khoảng 1 - 2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất chuyển hóa còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn; phần còn lại thải qua mật và phân. Hấp thu, chuyển hóa và đào thải có phụ thuộc vào tuổi hay không còn đang được xem xét. Nếu liều lượng và khoảng cách giữa các 7 lần dùng thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy, ngay cả khi chức năng thận và gan bị giảm[13]. 1.2.4. Dược động học của thuốc Nên liều dùng khởi đầu là 50 mg = 100 mg, nếu cần có thể tăng đến 200 mg trên một ngày. Nên bắt đầu điều trị ngay khi có triệu chứng đầu tiên và tùy thuộc vào các triệu chứng, tiếp tục thêm vài ngày nữa, tốt nhất là uống thuốc trước bữa ăn. Khởi đầu dùng 50 mg khi có triệu chứng đầu tiên. Trong trường hợp sau 2 giờ vẫn không giảm đau, có thể uống thêm liều 50 mg. Nồng độ đỉnh trung bình trong huyết tương của Diclofenac 1,48 ± 65µg/ml. Nếu cần thiết có thể dùng 50 mg trong mỗi 4 đến 6 giờ [13]. 1.2.5. Phân bố - chuyển hoá Diclofenac gắn nhiều protein huyết tương, abumin chiếm tới 99%, khi qua gan lần đầu tiên thì chúng được chuyển hóa lên tới 50%, nồng độ hoạt chất trong hoạt dịch đã cao hơn so với trong huyết tương sau 2 giờ khi đạt tới nồng độ đỉnh trong huyết tương và duy trì cao hơn cho đến 12 giờ [13]. 1.2.6. Thải trừ Khoảng 60% liều dùng được thải trừ qua nước tiểu ở dạng liên hợp của glucuronid của nguyên tử diclofenac nguyên vẹn và chất chuyển hóa, phần lớn những chất này cũng được chuyển thành dạng liên hợp glucuronid. Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao hoạt dịch là 3 đến 6 giờ [13]. 1.2.7. Chỉ định và chống chỉ định *Chỉ định: - Ðiều trị dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp. - Viêm đa khớp dạng thấp thiếu niên. *Chống chỉ định: - Quá mẫn với diclofenac, aspirin hay thuốc chống viêm không steroid khác. - Loét dạ dày tiến triển. 8 - Người uống theo chỉ định của bác sĩ. 1.3. Lịch sử nghiên cứu vấn đề Trên thế giới: - Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được G. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của G. xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng của cellulose vi khuẩn [7]. Ở Việt Nam: - Việc nghiên cứu về màng CVK cũng như các ứng dụng của nó còn hạn chế, mới chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa phổ biến rộng rãi ra ngoài cuộc sống thực tế. - Màng CVK và các ứng dụng được nghiên cứu tại Phòng Vi sinh, thuộc Khoa Sinh - KTNN. Điển hình như nhóm nghiên cứu của GS.TS Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng “( 2012 ) cho thấy màng BC tạo ra từ loại vi khuẩn này có sợi cellulose nhỏ, dẻ dai, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng [8]và một loạt các công trình khác đã được công nhận. - Sử dụng màng CVK trong hệ thống vận tải thuốc được nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng của Khoa Sinh – KTNN. 9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn dùng lên men thu nhận vật liệu CVK được nuôi cấy tại Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu: cao nấm men Hóa chất: - Thuốc Diclofenac natri dạng tinh khiết và dạng chế phẩm bán trên thị trường - Vật liệu CVK (99% là nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus lên men trong các môi trường dinh dưỡng. - Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihidrophotphat, axit clohidric, đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản). - Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) - Bể ổn nhiệt 1013 - Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức) - Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh) - Bể rửa siêu âm TCP 280 - Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu 10 - Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác. 2.1.4. Môi trường lên men thu vật liệu CVK Vật liệu CVK được tạo lên từ môi trường chuẩn: Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu CVK Thành phần Môi trường MTC Glucose 20g Pepton 5g Diamoni photphat 2,7g Cao nấm men 5g Acid citric 1,5g Acid acetic 2% Nước cất 2 lần 1000ml Dịch giống 10% Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu bằng 10% thể tích môi trường; pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4 - 6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác. - Môi trường được hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút. Sau đó cho môi trường khử trùng bằng tia UV trong 15 phút. - Để nguội và bổ sung vào môi trường 10% dịch giống và 2% acid axetic, lắc đều tay. - Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ. - Sau khi ủ tĩnh ở 28°C từ 7 đến 14 ngày, màng CVK thô thu được ngâm vào nước cất trong 2 ngày, và sau đó các màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình như hình 2.1: 11 Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK + Tách CVK: Trong điều kiện nuôi cấy CVK tạo thành một lớp màng có độ dày tùy thuộc vào khoảng thời gian lấy màng ra, thời gian càng lâu, độ dày màng càng lớn, lấy màng ra khỏi môi trường. + Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn có chứa nội độc tố, vì vậy, phải hấp màng trong NaOH 3%, nhiệt độ 113°C để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn. + Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước tới khi màng trắng rồi ép màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48h để trung hòa hết NaOH. + Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nước rồi ép màng. Ngâm nước để trung hòa hết acid trong khoảng 48h ta thu được CVK tinh chế. CVK tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90°C, áp suất thường trong khoảng 4 giờ đến khối lượng không đổi, ta được khối lượng CVK tạo thành. Tách màng CVK Ép loại nước Ngâm trong NaOH 3% 48 h, rửa và ép Ngâm trong HCl 3% 48 h, rửa và ép Ngâm trong nước 48 h, kiểm tra tạp chất Thu CVK tinh chế 12 2.1.5. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế Môi trường pH được sử dụng để tiến hành thử nghiệm là 2; 4,5; 6,8; 7,4. Pha 4 dung dịch đệm có pH như trên theo công thức pha chế dung dịch chuẩn độ của Dược điển Việt Nam[14] Dung dịch đệm pH = 2: cho 6,57g KCl trong nước, sau đó thêm 119ml dung dịch HCl 0,1M và thêm vừa đủ 1000ml nước cất, đo pH và hiệu chỉnh sao cho pH bằng 2 (dùng HCl hoặc NaOH). Dung dịch đệm pH = 4,5: cho 6,8g kali dihydro phosphate trong 1000ml nước cất, dùng máy đo pH và hiệu chỉnh nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH). Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). Dung dịch đệm pH = 7,4: cho 0,6g kali dihydro phosphate, 6,4g dinatri hydrophosphat và thêm 5,85g natri clorid vào nước cất sao cho vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của loại vật liệu CVK nạp thuốc trong môi trường chuẩn. - Nghiên cứu khoảng thời gian giải phóng thuốc tối ưu của loại vật liệu CVK. - Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm. 13 2.2.1. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri Nguyên lí: Sử dụng máy UV-2450 (Shimadru - Nhật Bản) đo quang phổ hấp thụ của diclofenac ở các nồng độ khác nhau với bước sóng 278 nm. Thực hiện: Chuẩn bị các mẫu chuẩn diclofenac với các nồng độ lần lượt là: 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% trong dung môi Methanol. Mẫu trắng là dung môi hòa tan diclofenac (Methanol). Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn diclofenac bằng phần mềm Excel 2010. Để có độ chính xác cao và độ tin cậy, ta tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và đo quang phổ 3 lần để lấy giá trị trung bình, sau đó xây dựng đường chuẩn cho thuốc. Bảng 2.2. Bảng xây dựng đường chuẩn Giá trị OD 276 nm (n=3) STT Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình 1 10% 0.116 0.116 0.119 0.117±0.013 2 20% 0.21 0.25 0.23 0.23±0.013 3 40% 0.49 0.46 0.46 0.47±0.013 4 60% 0.66 0.76 0.68 0.7±0.04 5 80% 0.95 0.94 0.96 0.94±0.006 6 100% 1.169 1.173 1.171 1.171±0.001 14 Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac OD278nm 2.2.2. Tạo vật liệu BC nạp thuốc Màng CVK nạp thuốc được tiến hành thử nghiệm trên 2 loại màng - Mẫu 1 Dùng màng CVK có độ dày 0.5cm - Mẫu 2 Dùng màng CVK có độ dày 1cm Màng CVK sau khi tinh chế, sấy khô 50% một nửa số màng, còn lại giữ nguyên sau đó cho vào bình tam giác thủy tinh có 100 ml dung dịch Diclofenac. Xác định lượng Diclofenac trong BC đã nạp thuốc bằng máy quang phổ UV 2450. Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 1,5h, 2h tiến hành rút mẫu rồi dùng máy đo quang hổ UV Vis để đo giá trị OD từng mẫu. Để có độ chính xác cao, ta tiến hành đo 3 lần. Từ giá trị OD trung bình thu được, ta thay vào phương trình đường chuẩn để tính ra nồng độ Diclofenac. Để tính được lượng thuốc hấp thụ qua màng, áp dụng công thức: 15 mht = mtrước – msau (1) Trong đó: mht: Lượng thuốc hấp thụ vào màng; mtrước: Khối lượng thuốc ban đầu; msau: Khối lượng thuốc còn lại trong dung môi. - Tỉ lệ % Diclofenac được hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn được tính theo công thức: EE% = Qt− Qd Qd × 100% (2) Trong đó: EE: Là phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng (%). Qt: Là lượng thuốc lý thuyết (mg). Qd: Là lượng thuốc còn lại (mg). 2.2.3. Nghiên cứu sự giải phóng thuốc từ vật liệu CVK nạp thuốc - Cho màng CVK ở trạng thái ép và giữ nguyên đã hấp thụ Diclofenac có độ dày màng 0,5 và 1cm vào bình có chứa 900ml môi trường pH tương ứng bằng 2,0; 4,5; 6,8 và 7,4. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ là 37 độ C. Sau 0,5h, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ. Lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung 5ml dung dịch đệm tương ứng. Để có kết quả chính xác và tin cậy, ta lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy kết quả trung bình. - Tỉ lệ giải phóng Diclofenac từ màng BC được tính theo công thức (3): 16 R% = 𝐶𝑡×𝑉1+∑ 𝐶𝑖×𝑉2𝑖=𝑛−1𝑖=1 𝑚 ×100% (3) Trong đó: R : Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) Ct: Nồng độ của Diclofenac trong dung dịch ở thời điểm t V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau n: Số lượng mẫu lấy ra từ dịch giải phóng V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào 2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả Sử dụng hần mềm Excel 2010, các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Số trung bình cộng là giá trị trung bình của các lần thí nghiệm được làm lặp lại. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. 17 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu màng CVK 3.1.1. Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn Khi nuôi cấy G. xylinus trong môi trường nuôi cấy, chúng sẽ sử dụng các chất dinh dưỡng để sinh trưởng và phát triển. Sau một khoảng thời gian, tùy vào mục đích sử dụng thí nghiệm mà ta thu được màng CVK có độ dày mỏng khác nhau. Thường sau hơn 1 tuần màng có độ dày là 0,5 cm và sau 2 tuần độ dày màng sẽ là 1 cm. Hình 3.1. Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong MTC sau 7 ngày 18 3.1.2. Màng CVK nạp thuốc Diclofenac natri Màng CVK sau khi được làm sạch và sấy ở nhiệt độ yêu cầu trong 4h để loại bỏ nước sau đó cho vào các bình tam giác chứa 100 ml dung dịch Diclofenac 5%, đặt bình sao cho vừa bể rung siêu âm, 37 độ C. Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 1,5h, 2h lấy dung dịch ra và tiến hành đo OD nhờ máy đo quang phổ UV 245 để xác định có bao nhiêu mg thuốc Diclofenac được màng hấp thụ. Theo số liệu thu được ta thấy giá trị OD trung bình của dung dịch thuốc có xu hướng giảm dần sau các khoảng thời gian khảo sát và ở 2 độ dày màng tiến hành khảo sát thì gần như không đổi sau 2 giờ và có thể nói lượng thuốc Diclofenac được hấp thụ vào màng tăng dần qua các khoảng thời gian và đạt cực đại tại 2 giờ. Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng với các độ dày khác nhau trong 2 giờ được thể hiện trong bảng sau: Bảng 3.1. Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng Khối lượng thuốc hấp thụ (mg) Màng chuẩn Màng giữ nguyên nước Màng ép 50% nước 22,7 ± 0,0018 22,4 ± 0,0025 22,9 ± 0,0026 22,5 ± 0,0027 3.2. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng ra khỏi màng CVK Sử dụng 4 đệm đã pha ở trên, mỗi bình chứa 900ml đung dịch đệm, sau đó cho các màng sau khi hấp thụ thuốc vào lần lượt các bình. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37 độ C. Sau lần lượt các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 1h, 12h, 24h rút mỗi mẫu 5ml ra đo quang phổ, đồng thời bổ sung 5ml dung dịch đệm tương tự. 19 Hình 3.2. Màng được cho vào dung dịch đệm và dùng máy khuấy từ gia nhiệt Hình 3.3. Mẫu được rút ra để đo OD sau các khoảng thời gian Kết quả mật độ quang thu được thể hiện trong bảng 3.2; 3.3 và hình 3.4; 3.5 20 Bảng 3.2. Gía trị OD thu được tại các thời điểm khảo sát tiến hành trên màng giữ nguyên với 4 loại môi trường khi giải phóng thuốc Diclofenac pH Thời gian(h) Độ dày màng (cm) Gía trị OD theo thời gian 0,5 1 2 4 6 8 10 12 24 2 0,5 0,068 ± 0,005 0,074 ± 0,001 0,103 ± 0,007 0,134 ± 0,008 0,159 ± 0,008 0,335 ± 0,018 0,476 ± 0,022 0,582 ± 0,01 0,67 ± 0,035 1 0,096 ± 0,006 0,124 ± 0,057 0,177 ± 0,004 0,232 ± 0,03 0,279 ± 0,014 0,444 ± 0,024 0,57 ± 0,029 0,763 ± 0,003 0,989 ± 0,048 4,5 0,5 0,046 ± 0,003 0,077 ± 0,06 0,136 ± 0,019 0.148 ± 0,028 0,214 ± 0,021 0,556 ± 0,046 0,604 ± 0,016 0,076 ± 0,018 0,048 ± 0,016 1 0,075 ± 0,031 0,162 ± 0,018 0,178 ± 0,025 0,315 ± 0,011 0,413 ± 0,023 0,729 ± 0,013 0,816 ± 0,011 0,987 ± 0,029 1,032 ± 0,027 6,8 0,5 0,082 ± 0,025 0,143 ± 0,016 0,182 ± 0,027 0,304 ± 0,022 0,455 ± 0,036 0,716 ± 0,027 0,728 ± 0,038 0,805 ± 0,047 0,908 ± 0,032 1 0,104 0,186 0,201 0,348 0,907 0,971 1,072 1,150 1,180 21 ± 0,028 ± 0,022 ± 0,016 ± 0029 ± 0,028 ± 0,009 ± 0,016 ± 0,014 ± 0,029 7,4 0,5 0,095 ± 0,016 0,145 ± 0,023 0,193 ± 0,029 0,306 ± 0,044 0,474 ± 0,045 0,737 ± 0,011 0,825 ± 0,022 0,904 ± 0,036 0,978 ± 0,018 1 0,103 ± 0,035 0,103 ± 0,031 0,184 ± 0,034 0,201 ± 0,016 0,365 ± 0,038 0,904 ± 0,031 0,986 ± 0,035 1,082 ± 0,011 1,150 ± 0,023 Bảng 3.3. Gía trị OD thu được tại các thời điểm khảo sát tiến hành trên màng ép 50 % với 4 loại môi trường khi giải phóng thuốc Diclofenac. pH Thời gian (h) Độ dày màng (cm) Gía trị OD theo thời gian 0,5 1 2 4 6 8 10 12 24 2 0,5 0,064 ± 0,005 0,084 ± 0,001 0,104 ± 0,007 0,132 ± 0,008 0,157 ± 0,008 0,325 ± 0,018 0,426 ± 0,022 0,532 ± 0,01 0,667 ± 0,035 1 0,086 ± 0,006 0,114 ± 0,057 0,157 ± 0,004 0,202 ± 0,03 0,249 ± 0,014 0,435 ± 0,024 0,57 ± 0,029 0,753 ± 0,003 0,988 ± 0,048 4,5 0,5 0,076 ± 0,003 0,097 ± 0,06 0,146 ± 0,019 0.158 ± 0,028 0,254 ± 0,021 0,586 ± 0,046 0,704 ± 0,016 0,075 ± 0,018 0,078 ± 0,016 1 0,095 0,152 0,178 0,317 0,433 0,739 0,817 0,997 1,052 22 ± 0,031 ± 0,018 ± 0,025 ± 0,011 ± 0,023 ± 0,013 ± 0,011 ± 0,029 ± 0,027 6,8 0, 0,092 ± 0,025 0,144 ± 0,016