Khóa luận Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân gíông vô tính cây lựu (Punica granatum. L)

ô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1930)[30]. Morel (1966)[28] là người đầu tiên đã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống lan quí Cymbidium bằng phương pháp này. Trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể, nhờ vậy mà hoa Cymbidium vốn đắt tiền đã có giá thành hạ hơn và đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của nhiều người. ở Thái Lan 90% lan thương mại được nhân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác như cây ăn quả, cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh.... Cúc ở Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, đặc biệt ở Hà Lan sử dụng phương pháp này cho hệ số nhân giống cao từ 410-1010/năm (Nguyễn Xuân Linh, 1988). Các lĩnh vực ứng dụng khác của phương pháp này cũng mang lại nhiều kết quả trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng. Qúa trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các qúa trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào . Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. Các qúa trình trên có thể tóm tắt như sau: Phân hoá tế bào Tế bào dãn Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Ví dụ : khi nuôi cấy mảnh lá hay đốt thân cây thuốc lá, ở điều kiện môi trường thích hợp các tế bào đã phân hoá của lá, đốt thân sẽ phản phân hoá, phân chia trở lại thành mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá, đốt thân nữa. Nếu chuyển sang môi trường khác thì tuỳ theo thành phần môi trường mà các tế bào mô sẹo có thể phân hoá theo các hướng khác nhau (hình thành rễ, chồi hay tạo cây hoàn chỉnh...) Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Cụ thể là: Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. Điều này có ý nghĩa rất lớn với cây thuốc nói chung, đặc biệt đối với các cây trồng để chiết lấy hoạt chất. Tạo được cây có genotip mới( đa bội, đơn bội). Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen. Phục tráng giống thông qua kỹ thuật cấy đỉnh sinh trưởng và cải tạo giống bằng kỹ thuật gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nẩy mầm kém. Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36 – 1012/ năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà. Nếu xét về phương diện hệ số nhân thì nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Chỉ tính riêng lĩnh vực true - to – type, nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc đại cách mạng về hệ số nhân. Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng chục vạn cây D.floribunda trong vòng một năm (Chaturvedi, Sinha, 1979; Phạm Văn Hiển và cs, 1988)[5] hay 26 vạn cây cam thảo trong 5 tháng (Shah, Dalal, 1980)[35] từ một lát cắt ban đầu mà thông thường 1 cây D.floribunda chỉ tạo ra 8 – 10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5 – 7 cây nếu nhân giống bằng cành. Từ một củ giống khoai tây trong thời gian 8 tháng, người ta thu được 2000 củ đồng nhất di truyền, trồng được trên một vùng 40ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống >100 000 so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987). ở Việt nam, Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ só nhân 532 trong vòng 1 năm đối với khoai tây bằng phương pháp này[12]. Đặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500 000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Starisky, 1970)[36]. Whitehead và Giles (1977) dự tính hàng năm có hể thu được 106 cây giống khi nuôi cấy chồi của Popolus nigra, P.yannanensis và con lai của Popolus. Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giồng bằng các phương pháp khác (Nickell, 1973)[33]. Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau: Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao, nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. Cây có thể có những đặc tính không mong muốn. Khả năng tạo đột biến có thể tăng. Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần. Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ những mục đích sau: Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí hiếm làm vật liệu cho công tác chọn giống. Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo. Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thẫn gỗ, Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro Có thể chia thành các bước sau: Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp. Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá...), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn.. thậm chí cả mẩu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành..) cũng được dùng cho nuôi cấy. Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khoẻ và sạch bệnh virus, nhưng ít hay nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tuỳ thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, đòng lúa non ... ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác của cây, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu cấy là sử dụng các hoá chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm. Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy, vì vậy việc lựa chọn loại hoá chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hoá chất hay được sử dụng để khử trùng thì canxi hypoclorit và natri hypoclorit là hay được sử dụng hơn cả vì đặc tính của chúng: có độc tính thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của canxi hypoclorit và natri hypoclorit hay được sử dụng là 5 – 15% và 0,5 – 2% trong thời gian từ 15 – 30 phút. Xác định điều kiện nuôi cấy(môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển mô nuôi cấy theo định hướng. Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều có sự khác nhau (Murashige và Skoog, 1962). Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy, bao gồm cả chất lượng và số lượng hoá chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hoá và chiều hướng phân hoá của tế bào. Cho đến nay đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: Môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)... Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loại cây trồng. Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau: muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chloride, nitrat, sulphat, phosphat và iodid của Ca, Mg, K, Na, Fe, Mn, Zn và B), vitamin, nguồn cacbon, yếu tố sinh trưởng hữu cơ (axit amin, pepton), hormon sinh trưởng. Đường là một thành phần không thể thiếu trong bất cứ môi trường nuôi cấy nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong môi trường nuôi cấy nhiều loài thực vật (Hu et al., 1979). Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở một số trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Hơn nữa, đường còn đóng vai trò thẩm thấu chính của môi trường. Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào. Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các vitamin cần thiết nhưng không đầy đủ về số lượng, vì vậy để đạt được sự sinh trưởng tối ưu người ta thường bổ sung một số vitamin như: thiamin(B1), axit nicotinic(PP), vitamin B5, piridoxin(B6). Trong đó B1 được coi là thiết yếu đối với sự sinh trưởng của tế bào thực vật (Weavaer R.J.,1972; Bhojwani và Razdan, 1983)[22]. Ngoài ra còn có thể sử dụng vitamin C và các chất chống oxy hoá khác. Nồng độ sử dụng vitamin thường từ 0,1 – 1mg/l. Điều khiển tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô nuôi cấy Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (phytohormon) là thành phần quan trọng bậc nhất trong môi trường nuôi cấy. Dựa vào những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro. Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin. Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hoá sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi...(Bhojwani and Razdan,1983)[32]. Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng với nồng độ từ 10-1 – 10-6M tuỳ theo từng chất, mục dích và đối tượng nghiên cứu.Auxin được thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hoá rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo. Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (idol butiric acid), NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (idol acetic acid). Cytokinin là nhóm phytohormon dẫn xuất của adenin, có vai trò sinh lý tương tự nhau. Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hoá các cơ quan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hoá chồi từ mô sẹo nuôi cấy... Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayanaswamy S., 1994). Các cytokinin dùng trong nuôi cấy là kinetin, 2iP (6- (g,g dimethylallylamino) purin,) BAP(benzylaminopurin) với nồng độ 10-4- 10-7 M. Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hoá cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Cân bằng tỷ lệ auxin/ cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằng này nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi. ở tỷ lệ trung gian mô sẹo được hình thành. Đây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Các mô khác nhau có phản ứng không giống nhau. Vì vậy với từng loại mô và từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì tìm được tổ hợp nồng độ auxin-cytokinin thích hợp là rất quan trọng. Đưa những cây tái sinh được trở lại điều kiện tự nhiên. Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luỵên cây in vitro thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Qúa trình thích nghi ở đây được hiểu là quá trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây in vitro. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần. Các đường hướng nhân giống vô tính in vitro Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ. Có hai phương thức tái sinh cây con: Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, hay chồi nách. Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. Tái sinh trực tiếp (direct regenerarion) từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). McCown và Amos (1979) chỉ phát hiện ra 1 trường hợp bất thường trong số hàng trăm nghìn chồi của cây phong được tái sinh bằng cách này.Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trong điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, các tế bào bình thường phân chia nhưng không hình thành mô sẹo mà tạo nên những điểm sinh trưởng phụ (adventitious meristemoid), sau đó các điẻm sinh trưởng phụ này tiếp tục tái sinh thành cây con. Xác suất xuất hiện các biến dị, thậm chí cả đột biến thường cao hơn trường hợp đã nói trên. Trong đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Có thể thấy ngay là hệ số nhân của con đường này vô cùng lớn. Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kỹ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo (Redenborgh et al, 1986). Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc người ta thường tái sinh cây theo đường hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng. Qui trình nhân giống in vitro. Theo Debergh (1991) thì qui trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn : Lấy mẫu và xử lý mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng quyết định quá trình vi nhân giống. Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu.Với cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 25°C, ẩm độ 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh và Zimmerman, 1991). Tái sinh mẫu nuôi cấy. Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Mẫu thường là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tuỳ thuộc đối tượng và mục đích nghiên cứu, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). Nhân nhanh chồi. Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không của phương pháp vi nhân giống (liên quan đến hệ số nhân chồi). Môi trường ở giai đoạn này được bổ xung thêm hormon sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux. ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hoá mạnh (Weiss và Jaffe, 1969), nhiệt độ thích hợp từ 20 – 30°C. Tái sinh rễ. Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, NAA, 2,4-D), ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng (Bhojwani và Razdan, 1983). Đưa cây in vitro ra đất. ở giai đoạn này, cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, đồng thời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con. ứng dụng nuôi cấy in vitro trong nhân giống cây thuốc Cho đến nay, nhiều cây dược liệu vẫn là nguồn cung cấp chủ yếu cho ngành công nghiệp dược. Tuy nhiên, sản lượng của chúng thường không ổn định, đó là do hậu quả của một số yếu tố như : điều kiện tự nhiên không thuận lợi, khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong công tác trồng trọt, chi phí lao động ngày càng tăng... Nhiều cây có nguy cơ tuyệt chủng, hạt ít và có sức nảy mầm kém, mất nhiều năm mới có quả, cây không sạch bệnh...nếu nhân giống bằng phương pháp truyền thống sẽ không đáp ứng yêu cầu. Phương pháp nhân giống in vitro được sử dụng rộng rãi đã khắc phục được những khó khăn trên, nhân nhanh một số giống cây dược liệu nhằm cung cấp những nguyên liệu có chất lượng ổn định để đưa vào sản xuất. Bajaj et al (1986) đã thống kê 148 cây thuốc thuộc 108 chi khác nhau đã được nhân nhanh bằng phương pháp này. Trong số này có các cây như Dioscorea deltoidea, Coluria geoides, Thymus vulgaris, Bergenia crassifolia... Tóm lại, phương pháp nhân giống in vitro với các ưu thế về hệ số nhân giống cực kỳ lớn, tiềm năng công nghiệp hoá cao và tính khả thi rộng, đã thực sự trở thành công cụ cần thiết trong công tác giống cây trồng. Phần iii Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1. Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng trong các thí nghiệm là cây giống đang lưu giữ tại vườn giống của Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Hà nội - Viện Dược Liệu – Bộ Y tế. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu - Mẫu nuôi cấy là những đỉnh chồi và chồi ngủ nằm ở nách lá, được khử trùng để tạo nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. - Mẫu dâm cành là những đoạn cành bánh tẻ có chiều dài 4-5cm, có ít nhất một chồi ngủ. 3.2.2. Phương pháp in vitro Mẫu được xử lý khử trùng bằng hóa chất và đưa vào nuôi cấy trong những điều kiện sau: + Môi trường nuôi cấy: Là môi trường Murashige Skoog (1962) có cải tiến, được hấp dưới áp suất 0,8 kg/ cm2 trong 40 phút. + Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ phòng nuôi: 25oC ±2 - Cường độ ánh sáng: 2000 lux Độ ẩm: 70% Thời gian chiếu sáng: 14 giờ sáng / 10 giờ tối. Các dụng cụ, buồng cấy được vô trùng. Dụng cụ thủy tinh được rửa sạch bằng xà phòng và sấy khô. 3.2.3. Phương pháp thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên đầy đủ, mỗi công thức nhắc lại 3 lần. 3.3 Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Nghiên cứu nhân nhanh in vitro 3.3.1.1. Nghiên cứu thời gian khử trùng mẫu Thí nghiệm 1: CT 1.1: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,07% trong 5 phút CT 1.2: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,07 % trong 8 phút CT 1.3: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,07 % trong 10 phút CT 1.4: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,07% trong 15 phút CT 1.5: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 phút CT 1.6: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % trong 8 phút CT 1.7: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % trong 10 phút CT 1.8: Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % trong 15 phút 3.3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh in vitro + Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin và BAP tới hệ số nhân in vitro. Môi trường nuôi cấy được bổ sung Kin và BAP ở các nồng độ khác nhau từ 0,1; 0,5;1,0 mg/l. Thí nghiệm 2 CT 2.1: MS (đối chứng) CT 2.2: MS + 0,1 mg/l Kin CT 2.3: MS + 0,5 mg/l Kin CT 2.4: MS + 1,0 mg/l Kin CT 2.5: MS + 0,1 mg/l BAP CT 2.6: MS + 0,5 mg/l BAP CT 2.7: MS + 1,0 mg/l BAP + Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hệ số nhân chồi. Môi trường nuôi cấy có bổ sung 1mg/l Kin (MB)với IBA ở các nồng độ khác nhau từ  0,1 ; 0,2 ; 0,5 mg/l. Thí nghiệm 3 CT 3.1: MB CT 3.2: MB + 0,1mg/lIBA CT 3.3: MB + 0,2mg/lIBA CT 3.4: MB + 0,5mg/lIBA + Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới sự ra rễ in vitro. Bổ sung IBA ở các nồng độ khác nhau từ 0,2; 0,5; 1,0 mg/l vào môi trường MS cơ bản. Thí nghiệm 4 CT 4.0: MS ( Đối chứng ) CT 4.1: MS + 0,2mg/lIBA CT 4.2: MS + 0,5mg/lIBA CT 4.3: MS + 1,0mg/liba 3.3.2. Nghiên cứu nhân giống vô tính in vivo + Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA, NAA, IBA tới sự ra rễ của cành dâm: Các cành dâm có kích thước từ 4,5-5cm được xử lý với các chất thuộc nhóm auxin nồng độ 50ppm theo các công thức sau: Thí nghiệm 5 CT 5.0: Đối chứng CT 5.1. xử lý bằng IBA CT 5.2: xử lý bằng NAA CT 5.3: xử lý bằng IAA + Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA tới sự ra rễ của cành dâm.  Thí nghiệm 6 CT 6.0: Đối chứng CT 6.1. xử lý bằng IBA nồng độ 20ppm CT 6.2: xử lý bằng IBA nồng độ 30ppm CT 6.3: xử lý bằng IBA nồng độ 50ppm CT 6.4: xử lý bằng IBA nồng độ 100ppm + Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý IBA tới sự ra rễ của cành dâm. Thí nghiệm 7 CT 7.0: Đối chứng CT 7.1: xử lý bằng IBA trong 5 phút CT 7.2: xử lý bằng IBA trong 10 phút CT 7.3: xử lý bằng IBA trong 15 phút CT 7.4: xử lý bằng IBA trong 20 phút + Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Vân Đài Tố tới sự phát triển của cây dâm cành. Thí nghiệm 8 CT 8.0: Đối chứng CT 8.1. phun VĐT nồng độ 1000ppm CT 8.2: phun VĐT nồng độ 2500ppm CT 8.3: phun VĐT nồng độ 5000ppm 3.4. Các chỉ tiêu đánh giá và phương pháp xử lý số liệu: * Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ mẫu sống(%) =(Tổng số mẫu sống/ Tổng số mẫu)x100 Tỷ lệ mẫu chết(%) =(Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu)x100 Tỷ lệ mẫu nhiễm(%) =(Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu)x100 Tỷ lệ chồi/mẫu= (Tổng số chồi tạo thành/tổng số mẫu cấy) x100 Tỷ lệ ra rễ=(Tổng số chồi ra rễ/tổng số mẫu cấy) x100 Số rễ /cây= Tổng số rễ/tổng số cây Chiều cao/chồi=Tổng chiều cao/ tổng số chồi. *Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thu được trong thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excel. Công thức tính : Trong đó: : Giá trị trung bình của quan trắc Xi : Giá trị riêng lẻ của các đại lượng nghiên cứu (i = 1 - k). Ni: Tần số tương ứng của Xi Sni = n d2: Phương sai. d: Độ lệch chuẩn. Phần IV kết quả và thảo luận 4.1. Khử trùng mẫu Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất, quyết định sự thành bại của nuôi cấy in vitro. Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe mạnh và sạch bệnh, nhưng ít nhiều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc và sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là rất cần thiết và quyết định sự thành công của cả quá trình này. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm và khuẩn. Chất khử trùng cần đảm bảo diệt nấm, vi khuẩn..., nhưng lại phải ít độc hoặc không gây hại đối với mãu cấy. Chất khử trùng hiệu quả thông dụng hiện nay là HgCl2. Khả năng tiêu diệt nấm phụ thuộc vào nồng độ và thời gian xử lý. ở thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng HgCl2 để khử trùng mẫu với nồng độ 0,07 và 0,1% trong các khoảng thời gian 5 ; 8 ;10 ; 15 phút. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 1 và bảng 2. Bảng 1 : Khử trùng mẫu bằng HgCl2 nồng độ 0,07% Hóa chất Thời gian xử lý (Phút) Tỉ lệ nhiễm (%) Tỉ lệ chết (%) Tỉ lệ sống (%) HgCl2 0,07% 5 40,25 9,71 50,04 8 32,15 15,27 52,58 10 19,41 20,22 60,37 15 6,07 28,74 65,19 Biểu đồ 1 : Khử trùng mẫu bằng HgCl2 nồng độ 0,07% Thời gian (phút) % Bảng 2 : Khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở nồng độ 0,1 % Hóa chất Thời gian xử lý (Phút) Tỉ lệ nhiễm (%) Tỉ lệ chết (%) Tỉ lệ sống (%) HgCl2 0,1% 5 20,41 26,52 53,07 8 10,27 28,35 61,38 10 4 31,2 64,8 15 - 42,25 57,75 Biểu đồ 2 : Khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở nồng độ 0,1 % Thời gian (phút) % Nhìn vào số liệu ở bảng 1, 2 ta thấy tỉ lệ mẫu nhiễm giảm dần khi tăng thời gian xử lý từ 5-15 phút, ngược lại tỉ lệ mẫu chết lại tăng lên. Tuy nhiên để đánh giá hiệu quả của việc khử trùng mẫu, người ta dựa vào tỉ lệ mẫu sống, không nhiễm. ở bảng 1, tỉ lệ mẫu sống cao nhất (65,19%)khi khử trùng trong 15 phút, ở bảng 2 thời gian xử lý 10 phút cho kết quả tốt nhất(64,8%). Như vậy thời gian khử trùng mẫu ảnh hưởng nhiều tới kết quả của quá trình này. Ngoài ra nồng độ hóa chất để khử trùng cũng có ảnh hưởng đáng kể tới tỉ lệ mẫu sống. ở nồng độ 0,1 % HgCl2 mẫu nhiễm ít hơn nhưng lại bị chết nhiều dẫn đến tỉ lệ mẫu sống tương đương với khi khử trùng bằng HgCl2 0,07%, tỉ lệ sống 65%. Có thể kết luận, thời gian và nồng độ của hóa chất HgCl2 để khử trùng lựu thích hợp nhất là xử lý mẫu 15 phút trong dung dịch HgCl2 0,07%, hay 10 phút trong dung dịch HgCl2 0,1%.( biểu đồ 2) Mẫu khử trùng được đưa vào môi trường khởi động tạo nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm sau này. 4.2. Nghiên cứu nhân nhanh in vitro 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kin và BAP tới sinh trưởng và phát triển của cây lựu in vitro ở giai đoạn đầu, các chồi được đưa vào môi trường khởi động chỉ phát triển thành một c