Khóa luận Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều

nh bằng formalin sẽ cố định các protein trong gel và ngăn cản sự thủy phân chúng bằng enzyme khi phân tích bằng khối phổ [32]. 1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) Nguyên lý chung của khối phổ Khối phổ (Mass spectrometry-MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học. Cấu tạo chung của máy khối phổ Máy khối phổ thường được cấu tạo từ các bộ phận chính sau đây: (1) bộ phận đưa mẫu; (2) nguồn ion hóa; (3) hệ thống bơm chân không; (4) bộ phận phân tích khối (mass analyzer) đo tỷ lệ m/z; (5) bộ phận đo tín hiệu (detector) xác định số lượng các ion ở mỗi giá trị m/z; (6) hệ thống phân tích dữ liệu, bao gồm máy tính cấu hình cao với các phần mềm chuyên dụng [2]. Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau [2] Kết hợp điện di 2 chiều - khối phổ (2DE-MS) Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một trong những cách tiếp cận thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu proteomics [20, 22]. Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein [2] Quá trình này có thể chia thành 5 giai đoạn (hình 6). Ở giai đoạn (1), hỗn hợp protein được phân tách và tinh sạch trên gel nhờ kỹ thuật 2-DE. Sau quá trình điện di là sự phân tích hình ảnh các điểm protein trên gel bằng các phần mềm đặc biệt. Vì phổ khối của toàn bộ protein có độ nhạy kém hơn phổ khối của peptide và chỉ riêng thông tin về khối lượng của protein là không đủ để xác định nên ở giai đoạn (2), các điểm và vệt protein quan tâm được lựa chọn, cắt và thủy phân bằng enzyme Tripsin. Sự thủy phân này tạo ra các peptide được ion hóa ở đầu C, cung cấp một lợi thế để xác định trình tự các peptide. Trong giai đoạn (3), các peptide được phân tách bởi phương pháp sắc ký lỏng nano hoặc sắc ký lỏng cao áp trong các ống vi mao quản và được thôi ra rất tinh tế vào trong một nguồn ESI, nơi chúng được bốc hơi, tạo thành những giọt nhỏ tích điện. Ở giai đoạn (4), những peptide sau khi ion hóa được chuyển vào phổ kế và phổ khối được xác định. Máy tính sẽ thiết lập một danh sách những peptide được lựa chọn cho sự phân mảnh tiếp theo bằng năng lượng thích hợp và các phép đo MS/MS sẽ được thực hiện ở giai đoạn (5). MS và hình ảnh MS/MS tiêu biểu được thu nhận để so sánh với những cơ sở dữ liệu mà kết quả là sự nhận biết các peptide/protein [2]. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Máu được thu từ những người tình nguyện tại bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Các mẫu được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng, có hồ sơ, bệnh án rõ ràng và có kết luận là mẫu bình thường từ các bác sỹ chuyên khoa của bệnh viện. Máu toàn phần sau khi xử lý, thu huyết thanh và chia nhỏ lượng mẫu vào các eppendorf, được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng. 2.1.2. Hóa chất Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử và được sử dụng đúng theo những hướng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất. Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2. Bảng 2. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu Hãng Vật liệu Fisher Scientific Methanol (HPLC grade), Acetonitrile (HPLC grade) Bio-Rad Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA), hóa chất điện di 2 chiều (strip, đệm cân bằng 1, đệm cân bằng 2…) Merck Acetonitrile, muối NaCl... New England Biolab Thang protein chuẩn (Protein Marker) Promega Trypsin Sigma TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide, N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED), Ammonium persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS), TriFlourAcetic (TFA), Formic acid (FA), Dithiothreitol (DTT), Amonium bicarbonate (NH4HCO3) 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị điện di 1 chiều SDS-PAGE và hai chiều 2-DE mua từ Bio-Rad (Hercules, CA, Mỹ). Hệ sắc ký lỏng nanoLC đa chiều từ LC Packings (LC Packings, Amsterdam, Hà Lan) được sử dụng để phân tách. Hệ sắc ký gồm một microautosampler FAMOS, bơm Ultimate micro HPLC, và thiết bị chuyển cột Swichos. Hệ máy khối phổ QSTAR® XL, sử dụng nguồn ESI (AplliedBiosystems, MDS SCIEX, Canada). Cột sắc ký ngược pha C18 (Vydac, Mỹ), đầu đưa mẫu Sillica PicoTip (New Objective, Mỹ). Phần mềm Mascot v1.8 (MatrixScience, London, Anh). Phần mềm BioAnalyst QS v1.1 (Applied Biosystems, MDS SCIEX, Canada). Ngân hàng Dữ liệu Protein NCBI (Mỹ) với hơn 4,8 triệu trình tự protein khác nhau được cài trên hệ thống máy chủ Workstation XW6200 BASE UNIT. Các trang thiết bị thực nghiệm cơ bản khác thuộc phòng Hóa sinh Protein, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen Quốc gia, Viện Công nghệ Sinh học. 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh Các protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh được thu nhận lại theo phương pháp của Goufman và cộng sự năm 2006 [19]. Một thể tích (1V) huyết thanh tổng số được trộn đều với 1V đệm ETP (20 mM EDTA pH 8.1, 0.2 M Tris-HCl pH 8.9, 7% (w/v) PEG 6000). Hỗn hợp được ủ 10 phút ở 98oC, 10 phút tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau đó được ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch nổi chứa các protein huyết thanh bền nhiệt được thu nhận lại và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau Protein bền nhiệt thu nhận được theo phương pháp trình bày ở phần 2.2.1 được hòa tan trong đệm ETP có nồng độ Tris cao (~ 200mM) làm ảnh hưởng đến kết quả phân tách bằng kỹ thuật 2-DE. Để loại bỏ Tris, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp kết tủa protein trong đệm chứa Tris bằng trichloroacetic acid (TCA) ở nồng độ và thời gian ủ thích hợp. Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA. Quy trình thí nghiệm cụ thể như sau: (i) Bổ sung TCA vào dung dịch protein bền nhiệt với nồng độ cuối của TCA lần lượt là 15%, 20%, 25% và 30%; (ii) Hỗn hợp phản ứng trên đây được chia thành 2 nhóm không ủ và có ủ 10 phút tại 4oC; (iii) Sau thời gian đó, các hỗn hợp được ly tâm thu tủa với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút; (iv) Loại bỏ phần dịch nổi, rửa lại phần kết tủa bằng aceton lạnh, bước thí nghiệm này được lặp lại 3 lần; (v) Làm khô kết tủa protein bằng máy biến tính nhiệt tại nhiệt độ 100oC trong 5 phút; (vi) Hòa tan lại protein trong đệm (8M ure, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte). Dung dịch protein bền nhiệt được bảo quản ở -80oC. 2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford Hàm lượng protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Mỹ). Cơ sở của phương pháp là định lượng protein dựa vào đặc điểm liên kết của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 với protein [12]. Trong môi trường axit, Coomassie Brilliant Blue G-250 tồn tại chủ yếu ở dạng cation màu đỏ, hấp thụ hai proton (Amax = 470 nm), còn khi thuốc nhuộm liên kết với các gốc axit amin kiềm (arginine) hoặc thơm của protein, chúng chuyển sang dạng màu xanh và không hấp thụ proton (Amax = 595 nm). Dạng liên kết thuốc nhuộm - protein được phát hiện ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ. Protein chuẩn được sử dụng để định lượng protein trong nghiên cứu này là albumin huyết thanh bò (BSA - Bovine Serum Albumin). Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau: Dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại các nồng độ chuẩn khác nhau của BSA Chuẩn bị 7 ống eppendorf với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,75 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2 mg/ml. Rút 20 ml dung dịch BSA ở từng nồng độ kể trên trộn đều với 1ml dung dịch Bradford 1x. Để phản ứng trong hỗn hợp xảy ra tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng trước khi đem đo trên máy quang phổ, tại bước sóng 595 nm. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi nồng độ BSA kể trên. Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch BSA và mẫu protein, ghi kết quả và dựng đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft. Xác định nồng độ protein bền nhiệt Bổ sung 20 ml protein bền nhiệt thu được ở phần 2.2.1 hoặc 2.2.2 vào 1 ml dung dịch Bradford 1x. Trộn đều hỗn hợp, để tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra trước khi đem đo trên máy quang phổ. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi mẫu protein bền nhiệt. Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch protein bền nhiệt, ghi kết quả hấp phụ protein tại bước sóng 595, tính toán nồng độ protein dựa trên đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft. 2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) Trong khóa luận này, kỹ thuật SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi, 1970 [27]. Các thiết bị, hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp. Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Đối với các protein có trọng lượng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thường được sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS-PAGE được tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản như ở bảng 3 cho 3 mẫu: (i) huyết thanh pha loãng 40 lần (ii) dịch nổi protein bền nhiệt (iii) dịch hòa tan của protein bền nhiệt sau khi kết tủa. Bảng 3. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Thành phần Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 ml 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 ml 10% (w/v) APS, 2 ml TEMED Gel tách 12,6% 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45ml 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 ml 10% (w/v) APS, 3 ml TEMED Đệm hòa mẫu 5x 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 Quá trình điện di được thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein. 2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 2-DE là kỹ thuật phân tách các protein dựa trên sự khác nhau về điểm đẳng điện và khối lượng phân tử trên gel polyacrylamide. Ở chiều điện di thứ nhất (điện di đẳng điện, isoelectric focusing - IEF), dưới tác dụng của điện trường, các protein di chuyển đến các vị trí pH mà tại đó điện tích tổng số của protein bằng 0, nói cách khác là di chuyển tới điểm đẳng điện pI của chúng. Ở chiều điện di thứ hai (điện di biến tính SDS-PAGE), các protein tại những giá trị pH nhất định tiếp tục được phân tách theo khối lượng phân tử. Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện) Protein huyết thanh sau khi xử lí nhiệt và loại Tris bằng phương pháp kết tủa được hòa trong đệm (8M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và 0.001% Bromophenol Blue). Hỗn hợp mẫu được thấm vào thanh gel dài 7cm, chứa dải pH từ 3 đến 10 hoặc 17cm, chứa dải pH từ 4 đến 7 (do hãng Bio-Rad, Mỹ cung cấp) trong thời gian từ 12 giờ đến 16 giờ. Sau đó, các protein trên thanh gel được phân tách theo điểm đẳng điện trên hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad). Thể tích mẫu sử dụng, thời gian thấm mẫu lên các thanh gel và các bước biến đổi hiệu điện thế trong quá trình điện di được cài đặt theo theo chương trình được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Bio-Rad). Cân bằng gel Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được khử bằng dung dịch chứa 6 M urea, 20% glycerol 2% SDS, 37,5 mM Tris-HCl pH 8.8, 2% DTT w/v và alkyl hóa bằng dung dịch chứa 6 M urea, 2% SDS 37.5 mM Tris-HCl pH 8.8, glycerol 20% and 40 mM IAA. Điện di chiều hai  Các protein trong thanh gel sau khi được phân tách theo điểm đẳng điện và được cân bằng trong các dung dịch trên sẽ tiếp tục được phân tách trên gel polyarcrylamid 12.5% theo kích thước phân tử của chúng với hiệu điện thế không đổi 150 V. Bản gel 2-DE được nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250 rồi tẩy màu tương tự như với bản gel SDS – PAGE ở mục 2.2.4. 2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin  Các vùng protein đã đánh dấu trên bản gel điện di 2-DE được cắt ra và chuyển vào ống eppendof 1,5 ml. Gel được rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3, pH 8.0, 50% ACN). Sau đó, các mảnh gel được làm khô bằng 100% ACN và khử bằng DTT với dung dịch khử chứa 5 mM DTT ở 56 0C trong 1h. Sau khi khử, gel được alkyl hóa bằng IAA với dung dịch alkylation chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Enzym trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich) được thêm vào với tỷ lệ enzym : cơ chất là 1 : 50, ở 37 0C qua đêm. Sau khi thủy phân, các peptide được chiết ra khỏi gel bằng dung dịch chiết (50% ACN, 0,1% FA) và siêu âm 20 phút. Quá trình chiết peptid khỏi gel được lặp lại 3 lần. 2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS Phương pháp sắc ký lỏng nhiều chiều kết hợp với khối phổ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu các mẫu protein phức tạp. Phương pháp này giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu khi đi vào phân tích bằng khối phổ MS/MS và do đó làm tăng khả năng phát hiện các thành phần protein có nồng độ thấp trong mẫu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng sắc ký một chiều kết nối khối phổ 1D nanoLC-ESI-MS/MS để phân tích và nhận dạng protein do các protein đã được phân tách trước đó nhờ kỹ thuật 2-DE. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân được cô đặc muối trên cột Trap, sau đó sẽ được phân tách trên cột sắc ký ngược pha C18. Cuối cùng hỗn hợp sẽ đưa vào hệ thống khối phổ để phân tích. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng nanoLC được tổng kết trong bảng 4. Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC Sắc ký lỏng nano UltiMate™ / FAMOS/ Switchos™ (LC Packings/Dionex) Cột ngược pha 300ml x 5 mm C18 PepMap100, LC Parking, Nertherland) Cột C18 75ml ID. x 15 cm, Grace Vydac, Hesperia, CA, USA Tốc độ dòng 200 nl/phút Tốc độ dòng Switchos 30 ml /phút Thể tích mẫu 20 ml (mẫu và muối) Các loại đệm A: 0,1% FA B: 85% ACN trong 0,1% FA Thời gian 90 phút, phút 10 bắt đầu tạo gradient với nồng độ đệm B tăng từ 0-100% trong 65 phút. Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS Máy khối phổ QSTARÒXL được vận hành ở chế độ IDA (Information Dependent Acquisition) để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 20 được xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS v1.1 (Applied Biosystems) (Hình 7). Sai số về khối (mass tolerance) được đặt ở mức ± 0,5 Da, thời gian không thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây. Hiệu điện thế được đặt ở nguồn để ion hoá mẫu là 2200V. 2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8 Phổ khối CID thu được từ nanoLC-MS/MS được phân tích bằng phần mềm Mascot v1.8. Đây là phần mềm có khả năng phân tích dữ liệu phổ MS/MS để nhận dạng protein dựa trên thuật toán Mowse được phát triển bởi MatrixScience (London, UK). Cơ sở dữ liệu được dùng để tìm kiếm trong Mascot là NCBInr, một cơ sở dữ liệu các protein không đồng nhất và toàn diện với khoảng gần 3 triệu trình tự khác nhau được cài đặt trên một máy tính HP Proliant Server. Các thông số để tìm kiếm dữ liệu được cài đặt như sau (hình 7) : Hình 7. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8 Cơ sở dữ liệu: NCBI. Sai số khối peptid và MS/MS: 0,5 Da Cải biến cố định: carbamindomethyl (C) Điện tích của peptid: +2 hoặc +3. Cải biến biến đổi: oxidation (methyonine, M). Enzym: trypsin Quá trình nhận diện protein với công cụ tìm kiếm Mascot v1.8 được lặp lại 3 lần. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt Huyết thanh chứa một hệ protein hết sức đa dạng và phức tạp, trong đó, chỉ tính riêng 22 protein có hàm lượng cao nhất đã chiếm đến 99% lượng protein tổng số [30]. Các protein này gây nhiều cản trở cho quá trình nghiên cứu các protein có hàm lượng thấp, trong khi đó nhiều protein có hàm lượng thấp mới thực sự có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu sinh học và y học [9]. Do đó, phương pháp biến tính nhiệt được sử dụng để làm giảm bớt mức độ phức tạp của mẫu huyết thanh đồng thời giúp thu nhận thêm các protein chịu nhiệt trong huyết thanh. Huyết thanh tổng số được trộn đều với đệm chiết ETP theo tỷ lệ thể tích 1:1 rồi ủ 10 phút ở 98oC. Sau khi đã biến tính hoàn toàn, mẫu được đưa về nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút rồi ly tâm tách pha ở 12000 vòng/phút trong 15 phút. Kết quả của quá trình xử lý nhiệt được thể hiện trong hình 8. Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt. A. Huyết thanh trước khi xử lý biến tính nhiệt. B. Huyết thanh sau khi biến tính nhiệt (Phần dịch nổi là dung dịch chứa các protein bền nhiệt. Phần cặn là kết tủa của các protein không bền nhiệt đã bị biến tính) Kết quả thu được trên ảnh cùng với việc hút chuyển dịch nổi bằng pipetman chính xác cho thấy tỷ lệ thể tích giữa phần cặn và phần dịch nổi xấp xỉ 1:1. Như vậy, có khả năng các protein bền nhiệt trong huyết thanh chưa bị pha loãng và nếu phương pháp xử lý nhiệt, thu hồi mẫu có hiệu quả thì nồng độ các protein bền nhiệt trong dịch nổi xem như tương đương với nồng độ của chúng trong huyết thanh nguyên. Hàm lượng của các protein bền nhiệt này sẽ tiếp tục được đánh giá tương đối bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE và khẳng định lại bằng phép đo Bradford. 3.2. Điện di SDS-PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được Để định lượng tương đối và đánh giá thành phần các protein bền nhiệt thu được, phần dịch nổi thu được từ huyết thanh sau khi biến tính nhiệt được chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng điện di biến tính SDS-PAGE ở nồng độ gel 12,6%, bản điện di được hiện màu bằng Comassive Blue Brilliant R-250. Kết quả điện di kiểm tra của các protein huyết thanh chịu nhiệt được thể hiện trong hình 9. Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt. Đường chạy M: Thang protein marker chuẩn; Đường chạy 1: Dung dịch huyết thanh đã pha loãng 40 lần; Đường chạy 2: Dịch nổi chứa protein bền nhiệt. Với lượng mẫu ở đường chạy số 1 là 10ml huyết thanh đã pha loãng 40 lần, ở đường chạy số 2 là 15ml dịch nổi chứa protein bền nhiệt và mức độ biểu hiện trên gel điện di, có thể thấy hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh nguyên là rất thấp so với hàm lượng protein tổng số. Ở đường chạy số 1, xuất hiện một băng lớn có kích thước khoảng 66.2 kDa, tương đương kích thước của protein Albumin trong huyết thanh, sự có mặt của Albumin sẽ cản trở việc nghiên cứu trên protein khác. Trong khi đó ở đường chạy số 2 không còn thấy xuất hiện băng lớn của Albumin chứng tỏ bằng phương pháp biến tính nhiệt, chúng tôi đã loại bỏ được hầu hết protein này. Nhờ đó sự phân tách của các protein khác rõ ràng hơn, xuất hiện nhiều băng có kích thước nhỏ hơn. Các kết quả trên cho thấy, bằng phương pháp xử lý biến tính nhiệt, chúng tôi đã thu được các protein bền nhiệt, đồng thời làm đơn giản thành phần protein trong huyết thanh. Kết quả này sẽ giúp cho các protein phân tách tốt hơn khi điện di 2-DE [22]. Ngoài ra, nếu so sánh với các phương pháp làm đơn giản mẫu protein huyết thanh khác như Aurum serum protein Mini Kit, cột sắc ký đa ái lực (Multiple Affinity Removal LC Column - Agilent), IgY-microbeads kit (SepproÒ), Cut off, … thì phương pháp biến tính nhiệt rõ ràng là đơn giản, dễ làm và đỡ tốn kém hơn. 3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford Bradford là phương pháp định lượng protein đơn giản và chính xác trong số các phương pháp xác định nồng độ protein trong dung dịch. Sử dụng phương pháp so màu Bradford cho phép chúng tôi xác định chính xác hàm lượng protein bền nhiệt thu được từ dịch nổi, đánh giá được tỷ lệ protein bền nhiệt so với hàm lượng protein tổng số của huyết thanh trong mẫu nghiên cứu, đồng thời cũng giúp cho việc tính toán chính xác lượng mẫu cần thiết phục vụ cho các thí nghiệm điện di 2-DE sau này. Đường chuẩn nồng độ BSA được xây dựng từ số liệu đo OD của 7 dung dịch BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125 mg/ml đến 2 mg/ml), thí nghiệm đo được lặp lại 3 lần và lấy giá trị đo trung bình. Kết quả đo OD của các dung dịch chuẩn này được ghi lại trong bảng 5. Bảng 5: Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn STT Nồng độ BSA (mg/ml) OD 1 0.125 0.163 2 0.25 0.294 3 0.5 0.560 4 0.75 0.747 5 1 0.850 6 1.5 1.058 7 2 1.258 Từ kết quả đo OD các nồng độ BSA chuẩn ở bước sóng A595 nm trên máy quang phổ, chúng tôi đã sử dụng phần mềm xử lý số liệu thống kê Excel để xây dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính dạng y = ax + b nhằm xác định chính xác nồng độ protein có mặt trong các mẫu nghiên cứu. Kết quả dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính lý thuyết được thể hiện trong hình 10. Hình 10: Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford Phương trình đường chuẩn thu được có bình phương hệ số tương quan R2 = 0,9502 đảm bảo mức độ tuyến tính và xác suất tin cậy của phương trình đã đưa ra. Dựa trên phương trình này và tiếp tục tính toán trên phần mềm Excel, chúng tôi thu được kết quả xác định nồng độ protein trong các mẫu nghiên cứu, kết quả được thể hiện trong bảng 6. Bảng 6 : Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford STT Mẫu OD Hàm lượng 1 Huyết thanh bền nhiệt 0.644 0.77365 2 Huyết thanh pha loãng 40 lần 1.1048 1.54724 3 Huyết thanh nguyên 61.89 Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy với phương pháp xử lý biến tính nhiệt như chúng tôi đã thực hiện thì hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh thu được từ mẫu nghiên cứu chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với protein tổng số, khoảng 1,25%. Kết quả này được thể hiện trong hình 11. Hình 11: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số 3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt Điện di hai chiều là phương pháp nghiên cứu protein truyền thống, tuy nhiên đến nay vẫn có nhiều ưu thế như có thể xác định, so sánh hình ảnh tương quan của các mẫu với hàng nghìn protein ở các trạng thái khác nhau (dạng bình thường, bệnh lý, nghiên cứu mức độ biểu hiện của các protein khác nhau, đánh giá khả năng phân tách protein từ mẫu huyết thanh nguyên và huyết thanh sau khi được xử lý loại các protein hàm lượng lớn ...) [19,20,21]. Mẫu protein huyết thanh sau khi được xử lý biến tính nhiệt và thu dịch nổi đã loại bỏ được hầu hết các protein có hàm lượng lớn, kém bền nhiệt và trở nên đơn giản hơn nhiều so với mẫu huyết thanh ban đầu, tạo điều kiện cho các protein phân tách tốt hơn trên bản điện di 2-DE. Tuy nhiên, trong dung dịch protein thu được còn chứa đệm ETP mà các thành phần có mặt trong đó có thể gây ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chạy điện di 2-DE. Do đó, để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần này và tối ưu hóa kết quả của thí nghiệm điện di 2-DE, chúng tôi tiến hành khảo sát thí nghiệm này trên thanh Strip pH 3-10 với kích thước 7cm theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.5, bản điện di được nhuộm màu bằng Comassive Blue Brilliant R-250. Trong quá trình tiến hành điện di IEF, chúng tôi nhận thấy các thông số hiệu điện thế (Voltage) trong các bước thí nghiệm đều không đạt được như chương trình đã đặt (xem bảng 5). Tại một số thời điểm, sự gia tăng tuyến tính của hiệu điện thế bị gián đoạn kéo dài, do đó hiệu điện thế của dòng điện không đạt được các giá trị đã chọn, làm tăng thời gian chạy thí nghiệm và gây ra những ảnh hưởng không mong muốn đến kết quả điện di. Bảng 7: Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian (A) theo chương trình cài đặt ; (B) trong thực tế theo dõi Voltage Time Volt - Hours Ramp Step 1 250 20 min -------- Linear Step 2 4000 2hr ----- Linear Step 3 4000 -------- 10000 V - hr Rapid Total 5hr 14000 V - hr A Step 1 Step 2 Step 3 Phút thứ 8 10 15 20 90 95 105 140 180 188 3000 12000 Voltage 17 59 23 27 140 150 207 122 364 270 127 1036 B Kết quả ảnh điện di 2-DE thu được (hình 12) cũng cho thấy sự phân tách protein chưa tốt, nhiều protein xuất hiện ở dạng vệt – dải (được đánh số 1, 2, 3 ở trên hình) pH 3 10 Hình 12: Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt. HW: vùng khối lượng phân thử cao; LW: vùng khối lượng phân tử thấp Tất cả các đặc điểm này cho thấy đã có sự ảnh hưởng của các thành phần đệm trong mẫu đến quá trình điện di IEF, đặc biệt là rất phù hợp với các nghiên cứu về ảnh hưởng của Tris ở nồng độ cao đến điện di IEF và 2-DE (hình 3)[17], trong đó đặc trưng