Luận án Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ tam thất (Panax Notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ . 1

CHƯƠNG 1 . 3

TỔNG QUAN . 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ. 3

1.1.1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam . 3

1.1.2. Ung thư với đáp ứng miễn dịch . 4

1.2. TỔNG QUAN VỀ TAM THẤT. 11

1.2.1. Tổng quan thực vật. 11

1.2.2. Hóa thực vật rễ củ Tam thất. 14

1.2.3. Các tác dụng dược lý của Tam thất. 16

1.2.3.1. Tác dụng chống ung thư . 16

1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch. 18

1.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan . 19

1.2.3.4. Các tác dụng khác . 21

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC

DỤNG KHÁNG U . 22

1.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro . 22

1.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo. 26

CHƯƠNG 2 . 31

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 31

2.1. CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. 31

2.1.1. Chất liệu nghiên cứu. 312.1.2.Đối tượng nghiên cứu . 35

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu . 35

2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu. 35

2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu. 37

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 39

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến

hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất. 39

2.2.1.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trongcác

mẫu Tam thất hấp và không hấp. . 39

2.2.1.2. Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi

hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

. 40

2.2.1.3. Định lượng hàm lượng saponin trong 2 mẫu cao NP(O) và NP(H) bằng HPLC

. 42

2.2.2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng

và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. . 42

2.2.2.1. Đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng

NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người. 42

2.2.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào

theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung

thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. . 44

2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng NP(H)

và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180. 48

2.2.2.4. Đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn

dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. 50

pdf216 trang | Chia sẻ: thinhloan | Ngày: 12/01/2023 | Lượt xem: 250 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ tam thất (Panax Notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
mẫu dược liệu được trình bày trong bảng 3.10. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết của hai mẫu không hấp và mẫu hấp gần tương đương nhau, tương ứng lần lượt là 44,66% và 41,28%. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rh1-dk1 Rg3-dk1 Rh1-dk2 Rg3-dk2 Rh1-dk3 Rg3-dk3 Rh1-dk4 Rg3-dk4 H àm l ư ợ n gm ột s ố sa p on in t ro n g ta m t h ất ( % ) Saponin Rh1 và Rg3 tại các thời điểm hấp khác nhau 0h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 87 Bảng 3.10. Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu Tên mẫu Khối lượng (g) Độ ẩm dược liệu (%) Khối lượng cao (g) Độ ẩm cao (%) Hiệu suất chiết (%) Mẫu không hấp 988,00 4,30 468,70 9,90 44,66 Mẫu hấp 970,00 13,05 372,78 6,60 41,28 3.1.3.2. Định lượng các mẫu cao chiết Lựa chọn điều kiện sắc ký Tiến hành sắc ký như mô tả ở mục 2.2.1.2, thu được sắc ký đồ như hình sau. Hình 3.8. Sắc ký đồ các cao Tam thất A: Hỗn hợp mẫu chuẩn B: Cao chiết từ mẫu cao định lượng NP(O) C: Cao chiết từ mẫu cao định lượng NP(H) Hình ảnh trên sắc ký đồ cho thấy với điều kiện sắc ký đã chọn, các chất cần phân tích cho các pic tách nhau rõ ràng, có thể dùng để định lượng các mẫu nghiên cứu. Kết quả định lượng Saponin trong các mẫu cao được trình bày ở bảng 3.11. 88 Bảng 3.11. Hàm lượng các saponin trong 2 mẫu cao định lượngNP(O) và NP(H)(Mean ± SD) Tên mẫu Độ ẩm (%) Hàm lượng các chất trong cao (%) Rg1 Re Rb1 Rh1 Rd Rg3 Tổng NP(O) 9,90 11,70a ± 0,16b 1,81 ± 0,01 14,89 ± 0,18 0,30 ± 0,01 3,23 ± 0,08 0,38 ± 0,01 32,32 ± 0,41 NP(H) 6,60 ND ND 5,30 ± 0,07 2,57 ± 0,12 0,83 ± 0,03 16,16 ± 0,07 24,62 ± 0,20 Ghi chú: a: hàm lượng trong mẫu (%), b: độ lệch chuẩn (%, n=3), ND: không phát hiện được Rg1: ginsenosid Rg1, Re: ginsenosid Re, Rb1: ginsenosid Rb1, Rh1: ginsenosid Rh1, Rd: ginsenosid Rd, Rg3: ginsenosid Rg3. 3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người Tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư người của các mẫu thử được đánh giá 3 lần thử nghiệm lặp lại với mỗi mẫu ở một mức nồng độ. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) được xác định bởi phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. Kết quả được trình bày ở bảng sau. 89 Bảng 3.12. IC50 của 6 mẫu saponin và 2 cao định lượng NP(O), NP(H) trên 6 dòng tế bào ung thưngười đã được thử nghiệm Từ các kết quả thu được trong cùng điều kiện thử nghiệm in vitro: * So sánh hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người của 6 saponin đã thử nghiệm,kết quả cho thấy: Mẫu thử Rg1(1) có hoạt tính ức chế yếu sự phát triển của các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml). Mẫu thử Re (2)thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển đối với dòng tế bào SK LU1 với giá trị IC50 là 6,83 ±0,81µg/ml và đối với dòng tế bào A549 là 7,92 ± 0,37µg/ml; các dòng tế bào còn lại sự ức chế phát triển đều ở mức yếu (IC50>10 µg/ml). Mẫu thử Rd (3)cũng thể hiệnhoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF7 và RD đã thử nghiệm với giá trị IC50 từ 8,21± 0,39 µg/ml đến Dòng tế bào UT IC50 ( µg/ml) MCF7 HepG2 HT29 RD SK LU1 A549 Mẫu(1)Rg1 14,87 ±3,20 12,32 ±3,20 13,59 ±3,20 12,21 ±3,20 12,63 ±3,20 11,87 ±3,45 Mẫu(2)Re 12,84 ± 3,85 11,13 ± 2,94 11,85 ± 2,17 14,79 ± 3,25 6,83 ±0,81 7,92 ±0,37 Mẫu (3)Rd 8,21 ± 0,39 12,57 ± 2,151 12,34 ± 3,22 9,17 ± 0,56 11,95 ±3,22 12,11 ±1,21 Mẫu(4)Rb1 8,09 ± 0,81 11,23 ± 2,48 12,36 ± 2,52 8,34 ± 0,37 13,68 ±1,05 12,56 ±3,81 Mẫu(5)Rg3 5,14 ± 0,41 4,54 ±0,42 5,08 ± 0,48 4,44 ± 0,42 9,88 ±0,47 8,01 ±0,58 Mẫu(6)Rh1 8,58 ± 0,59 7,31 ± 0,59 9,19 ± 0,82 6,48 ± 0,63 8,14 ±0,45 10,64 ±0,32 Mẫu chưa hấpNP(O) 12,57 ± 1,84 12,16 ± 2,74 13,21 ± 1,17 11.34 ± 2,23 10,41 ± 2,26 10,32 ± 2,68 Mẫu đãhấp NP(H) 8,89 ± 0,60 9,11 ± 0,44 7,03 ± 0,82 11,84 ±3,24 8,57 ±0,27 7,62 ±0,46 Ellipticine/tham chiếu (+) 0,36 ± 0,02 0,41 ± 0,04 0,40 ± 0,04 0,45 ± 0,05 0,39 ±0,05 0,33 ±0,03 90 9,17± 0,56 µg/ml và chưa thể hiện hoạt tính trên các dòng HepG2, HT-29, SK LU1 và A549 ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml). Mẫu thử Rb1 (4) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF7 và RD đã thử nghiệm với giá trị IC50 từ 8,09 ± 0,81µg/ml đến 8,34 ± 0,37 µg/ml và chưa thể hiện hoạt tính trên các dòng HepG2, HT-29, SK LU1 và A549 ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml). Mẫu thử Rg3 (5) có hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 4,44 ± 0,42 µg/ml đến 9,88± 0,47 µg/ml; Mẫu thử Rh1 (6) có hoạt tính ức chế sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm với giá trị IC50 từ 6,48 ± 0,63 µg/ml đến 9,19 ± 0,82 µg/ml. Như vậy đối với 6 hợp chất tinh khiết phân lập được thì có 4 hợp chất là Rg1, Re2, Rd3 và Rb1có hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm in vitro tương đối yếu so với 2 hợp chất tinh khiết thu được sau khi hấp qua hơi nóng thu được là Rg3 và Rh1. Nói một cách khác, 2 hợp chất Rg3 và Rh1 thu được sau khi Tam thất đã xử lý hấp qua hơi nóng ở 120 độ C trong vòng 8 giờ có hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư mạnh hơn so với 4 hợp chất Rb1, Rd, Re và Rg1 khi được thử trên 6 dòng tế bào ung thư trong cùng điều kiện. ** So sánh hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người đã thử nghiệm với 2 cao định lượng NP(O), NP(H), kết quả cho thấy So sánh hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người đã thử nghiệm,cao định lượng NP(H) (cao định lượng Tam thất sau khi hấp) có hoạt tính ức chế tương đối mạnh sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư là HT29, HepG2, MCF7, SK LU1 và A549 đã thử với giá trị IC50 từ 7,03 đến 9,11 µg/ml, chỉ chưa thể hiện hoạt tính trên một dòng tế bào ung thư là RD ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml). Trong khi đó NP(O) (cao định lượng Tam thất chưa qua hấp) không thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của cả 6 dòng tế bào ung thư đã được thử ở tất cả các nồng độ đã sử dụng (với tất cả các dòng này đều có IC50>10 µg/ml). 91 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. 3.2.2.1. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao định lượng NP(H) *Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) tới hình thái tế bào Sự biến đổi hành thái đặc trưng của tế bào là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độc tính của các chất lên các tế bào ung thư nuôi cấy. Hình 3.9. Hình thái tế bào Sarcoma TG180 (A) Tế bào đối chứng sinh học. (B) Tế bào được xử lý với dung môi 0,5% DMSO tại thời điểm 48h (VK10X15) Qua hình 3.11, không có sự sai khác giữa 2 giếng: tế bào đối chứng sinh học (Hình 3.11A) và tế bào được xử lý với môi trường 0.5% DMSO (Hình 3.11B), điều này cho thấy môi trường chứa 0,5% DMSO (dung môi pha thuốc) không có tác động đáng kể nào lên tế bào. A B 92 Tế bào Sarcoma TG180 dưới tác dụng của NP(H) tại các nồng độ thử nghiệm (A) (B) (C) (D) (E) (F) 2000µg/ml 1000µg/ml 500µg/ml 250µg/ml 125µg/ml 62,5µg/ml Tế bào Sarcoma TG180 dưới tác dụng của Taxol tại các nồng độ thử nghiệm (A1) (B1) (C1) (D1) (E1) (F1) 2µg/ml 1µg/ml 0,5µg/ml 0,25µg/ml 0,125µg/ml 0,0625µg/ml Hình 3.10. Hình thái tế bào Sarcoma TG180 dưới tác dụng của cao định lượng NP(H) và thuốc chứng dương Taxol tại thời điểm 48h (VK10X15) Qua hình thái tế bào thu được sau 48h ủ với cao định lượng NP(H), chúng tôi nhận thấy NP(H) có thể hiện rõ tác dụng gây độc cho tế bào. Tại các nồng độ 2000µg/ml (hình 3.12 A) và 1000µg/ml (hình 3.12 B), số lượng tế bào giảm rõ rệt, hình thái không còn nguyên vẹn, phần lớn, đến 90% tế bào đã vỡ, phân mảnh. Khi giảm nồng độ xuống ½, cụ thể tại Hình 3.12 C, D, E và F, hình thái tế bào phục hồi dần, tạo cụm đặc trưng. Ở nồng độ 250µg/ml (hình 3.12 D) mật độ tế bào đạt khoảng 40% so với giếng đối chứng. Khi giảm đến nồng độ 125 µg/ml (hình 3.12 E) và nồng độ 62,5 µg/ml (hình 3.12 F), mật độ tế bào đạt mức như giếng đối chứng. Với thuốc chứng dương Taxol ở những nồng độ 2µg/ml (hình 3.12 A1), và 1µg/ml (hình 3.12 B1), mật độ tế bào cũng giảm nhiều, số lượng chỉ khoảng 15- 20%, tuy nhiên những tế bào quan sát thấy, vẫn tròn đều, màng sáng, có xu hướng tạo cụm đặc trưng. Khi giảm dần nồng độ thuốc thử, mật độ tế bào cũng tăng dần 93 và hình thái trở về trạng thái sinh lý bình thường (hình 3.12 C1 và hình 3.12 D1). Khi giảm đến nồng độ 0,125 µg/ml(hình 3.12 E1) và nồng độ 0,0625 µg/ml (hình 3.12 F1), mật độ tế bào đạt mức như giếng đối chứng. * Kết quả thử nghiệm MTS MTS[3-(4,5-dimethylthiazol–2-yl)–5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl) - 2H-tetrazolium] là một loại mới của muối tetrazolium, nó có thể bị khử bởi các tế bào sống tạo ra sản phẩm là formazan hòa tan trực tiếp trong môi trường nuôi cấy tế bào. Thuốc thử tetrazolium này được sử dụng kết hợp với thuốc thử nhận điện tử trung gian là phenazine methyl sulfate (PMS) hoặc phenazine ethyl sulfate (PES), có thể xâm nhập vào các tế bào sống, bị khử trong tế bào chất hoặc ở bề mặt tế bào và giải phóng ra khỏi tế bào nơi chúng có thể chuyển đổi tetrazolium thành sản phẩm formazan hòa tan. Nồng độ formazan hình thành được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 490nm. Quá trình khử xảy ra dưới sự xúc tác của enzym trong ty thể trong tế bào sống, theo đó hàm lượng của chất tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống tham gia phản ứng. Phương pháp MTS có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bước thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thường sử dụng kiểm tra độc tính để sàng lọc thuốc với số lượng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau. Kết quả thu được cho ra giá trị IC50, từ đó đánh giá được độ độc của thuốc cần nghiên cứu. Như ở phần phương pháp đã nêu ở trên, chúng tôi thử độc tính các mẫu nghiên cứu gồm 6 nồng độ, nồng độ thử cao nhất là 2000µg/ml đối với cao định lượng NP(H), 2µg/ml đối với thuốc chứng dương Taxol và giảm dần mỗi nồng độ được giảm ½ nồng độ trước nó. Sau 48h ủ thuốc, bằng phương pháp MTS, chỉ số OD được đo tại bước sóng 490, bằng máy đọc ELISA (SpectraMAX Plus 384). 94 Kết quả OD đo được tương đối phù hợp với kết quả định tính so sánh hình thái ở trên, bằng các phương pháp thống kê trong Excel chúng tôi xử lý số liệu và thu được kết quả về % tế bào sống (A%) tương ứng với các nồng độ thử, kết quả thể hiện qua bảng 3.13. Bảng 3.13. Tỷ số tăng sinh (A%) và giá trị IC50 các mẫu nghiên cứu trên dòng Sarcoma TG180 3.2.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. Sau thời gian 12h, 24h và 48h ủ tế bào ung thư mô liên kết chuột Sarcoma 180 với cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml, tiến hành thu tế bào từ các giếng thí nghiệm cũng như đối chứng. Để xác định tỉ lệ tế bào chết theo chương trình chúng tôi sử dụng bộ kít anti- annexin V gắn chất phát huỳnh quang là Fluorescein isothiocyanate (FITC) và chất Nồng độ thử(µg/ml) Sarcoma TG180/chất thử(*) NP(H) Taxol A% Lần 1 A% Lần 2 A% Lần 1 A% Lần 2 2000 14,41 13,73 23,79 20,64 1000 21,02 21,83 37,79 36,24 500 32,42 33,36 49,55 53,45 250 47,83 50,82 56,19 59,08 125 62,75 61,18 62,75 68,66 62,5 101,47 91,77 104,61 92,62 TB IC50 IC50=206,65±10,11 (µg/ml) R2=0,96 IC50=0,701 ±0,266 (µg/ml) R2=0,98 95 nhuộm nhân tế bào phát huỳnh quang là 7-Amino Actinomycin D (7AAD). Quy trình chạy flow cytometrytheo hướng dẫn của bộ kit Annexin V Apoptosis Detection (BD) trên máy đếm tế bào BDFACS-Lysis Của hãng BD Mỹ, tại Labo Sinh học phân tử- Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân Y. Các tế bào apoptosis được nhận biết bằng sự dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+). Kết quả đánh giá tỷ lệ % tổng tế bào Apoptosisđược trình bày ở bảng 3.14. Bảng 3.14. Tỷ lệ % tế bào apoptosis Nhóm TN Tỷ lệ tế bào apoptosis (%) Tỷ lệ %so với đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Trung bình Chứng 4,75 3,41 4,08 100% 12h 6,13 5,91 6,02 147,55 24h 9,58 8,44 9,01 220,83 48h 10,08 8,62 9,35 229,17 Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy cao định lượng NP(H) có khả năng kích thích tế bào Sarcoma TG180 chết theo kiểu apoptosis. Cùng một nồng độ thuốc thử (cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml), thời gian ủ càng lâu thì tỷ lệ tế bào apoptosis càng cao. Cụ thể tại thời điểm sau 12h, 24h và 48h ủ, tỷ lệ tế bào apoptosis tương ứng là147,55%; 220,83% và 229,17% so với đối chứng. Các tế bào apoptosis được phân chia ra thành những tế bào apoptosis sớm và tế bào apoptosis muộn. Tế bào apoptosis sớm là những tế bào mà sự chết được cảm ứng, khởi phát và được định hướng ngay giai đoạn đầu hay giai đoạn sớm của quá trình apoptosis, lúc này trong tế bào mọi hoạt động sống vẫn diễn ra. Những thay đổi trong màng sinh chất là một trong những đặc điểm sớm nhất của quá trình apoptosis, do đó ở các tế bào apoptosis sớm chỉ có sự dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+).Sự phân mảnh DNA trong nhân tế bào apoptosis 96 sớm chưa xảy ra, do đó tế bào âm tính với thuốc nhuộm nhân 7- aminoactinomycin (7-AAD-). Kết quả đánh giá tỷ lệ % tế bào Apoptosis sớm được trình bày ở bảng 3.15. Bảng 3.15. Tỷ lệ tế bào Appotosis sớm Nhóm TN Tỷ lệ chết apoptosis sớm % Tỷ lệ apoptosis so với đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Trung bình Chứng 1,36 1,08 1,22 100% 12h 1,89 1,90 1,90 155,74 24h 3,00 2,71 2,86 234,43 48h 3,38 3,78 3,58 293,44 Kết quả ở bảng 3.15 cho thấy cao định lượng NP(H) làm tăng tỷ lệ tế bào Appotosis sớm. Cùng một nồng độ thuốc thử (cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml), thời gian ủ càng lâu thì tỷ lệ tế bào apoptosis sớm càng cao. Cụ thể tại thời điểm sau 12h, 24h và 48h ủ, tỷ lệ tế bào apoptosis sớm tương ứng là 155,74%; 234,43% và 293,44% so với đối chứng. Tế bào apoptosis muộn là những tế bào mà quá trình apoptosis đã ở giai đoạn muộn,có những thay đổi đáng kể về hình thái xảy ra và một đặc trưng cơ bản là sự phân mảnh DNA trong nhân sau sự cô đặc thể nhiễm sắc, các hoạt động sống của tế bào gần như đã dừng, màng tế bào lúc này không còn các phản ứng chọn lọc. Khi không kiểm soát, đồng nghĩa với việc tế bào cho tất cả các chất qua màng, chính vì vậy ngoài dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+), tế bào còn dương tính với thuốc nhuộm nhân 7- aminoactinomycin (7-AAD+).7-AAD là thuốc nhuộm huỳnh quang có ái lực cao với DNA sợi kép, khi được kích thích bằng nguồn sáng thích hợp, tế bào chết biểu hiện cường độ huỳnh quang, dễ dàng nhận biết và đếm bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Kết quả đánh giá tỷ lệ % tế bào Apoptosis muộn được trình bày ở bảng 3.16. 97 Bảng 3.16. Tỷ lệ tế bào chết Appotosis muộn Nhóm TN Tỷ lệ chết apoptosis muộn% Tỷ lệ (%) apoptosisso với đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Trung bình Chứng 3,39 2,33 2,86 100 12h 4,24 4,01 4,13 144,41 24h 6,58 5,73 6,16 215,38 48h 6,7 4,84 5,77 201,75 Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy cao định lượng NP(H) làm tăng tỷ lệ tế bào Appotosis muộn. Cùng một nồng độ thuốc thử (cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml), ban đầu tỷ lệ tế bào apoptosis muộn tăng theo thời gian ủ, tuy nhiên sau đó khi tiếp tục ủ lâu hơn thì tỷ lệ tế bào apoptosis muộn lại giảm. Cụ thể tại thời điểm sau 12h, 24h và 48h ủ, tỷ lệ tế bào apoptosis muộn tương ứng là 144,41%; 215,38% và 201,75% so với đối chứng. 3.2.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180. 3.2.3.1. Kết quả tạo mô hình khối u sarcoma TG 180 trên chuột Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u tại vị trí tiêm (đùi phải) bằng quan sát, sờ nắn và đo kích thước khối u bằng thước kẹp Caliper. Kết quả tạo mô hình thực nghiệm cho thấy chuột nhắt trắng sau 3 ngày được tiêm huyền dịch chứa 5 x 105 tế bào sarcoma TG 180 vào dưới da đùi phải đều đã xuất hiện những khối ung thư phát triển tại dưới da đùi phải và sau 5 ngày khối u hình thành rõ. Theo dõi chặt chẽ trong 5 ngày đầu gây u, chỉ lựa chọn các chuột có khối u hình thành rõ và có sự phát triển khối u rõ rệt, được đánh giá là chuột gây u thành công và đưa vào nghiên cứu. Tỷ lệ chuột gây u thành công là 98%. 98 Bảng 3.17. Trọng lượng cơ thể chuột và thể tích khối u trong giai đoạn gây u (5 ngày đầu). (Mean ± SD, n =10). Lô chuột Trọng lượng cơ thể chuột (g) Thể tích khối u (mm3) Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 3 Ngày 5 SL 21,28 ± 0,42 25,34 ± 0,54 27,65 ± 0,65 - - UT 21,31± 0,67 25,26± 1,14 27,31± 1,06 303,35 ±44,60 527,01 ± 73,70 LTN 21,22 ± 0,74 24,81 ± 0,92 26,48 ± 1,22 289,85 ± 38,13 516,65 ± 82,03 NP(O)-1 21,36 ± 0,42 25,18 ± 0,99 26,81 ± 1,06 299,10 ± 28,99 519,45 ± 55,92 NP(O)-2 21,39 ± 0,46 24,72 ± 0,70 26,32 ± 1,02 293,27 ± 29,29 508,84 ± 63,20 NP(H)-1 21,24 ± 0,43 24,95 ± 0,48 26,71 ± 0,48 296,80 ± 33,16 522,91 ± 71,66 NP(H)-2 21,13 ± 0,39 24,32 ± 0,73 26,13 ± 1,12 288,26 ± 46,50 524,91 ± 60,58 pgiữa các lô > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Trong 5 ngày đầu kể từ khi tiêm tế bào sarcoma TG 180 để gây u cho chuột, trọng lượng cơ thể chuột ở các lô tăng đều, không có sự khác biệt giữa các lô chuột (p > 0,05). Ở các lô tiêm tế bào sarcoma TG 180, ngày thứ 3 các chuột đã xuất hiện khối u, thể tích trung bình khối u ở các lô đạt 288 mm3 đến 303 mm3. Các khối u phát triển nhanh, ở ngày thứ 5 thể tích trung bình khối u ở các lô đạt từ 509 mm3 đến 527 mm3. Tiếp tục theo dõi cho thấy thể tích khối u tăng dần theo thời gian gây u. Động vật mang u vào giai đoạn muộn có biểu hiện bỏ ăn, suy kiệt, xù lông. 3.2.3.2. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến trọng lượng cơ thể của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. Sau khi xác định gây u thành công ở ngày thứ 5, các chuột được cho uống thuốc theo phân lô bắt đầu từ ngày thứ 6. Tiến hành cân chuột 2 ngày/lần. 99 Bảng 3.18.Trọng lượng cơ thể chuột trong giai đoạn uống thuốc (Mean ± SD, n =10). Lô chuột Trọng lượng cơ thể chuột (g) Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13 Ngày 15 Ngày 17 Ngày 19 Ngày 21 SL 31,09 ± 0,79 34,18 ± 1,55 37,62 ± 1,56 41,51 ± 1,42 43,36 ± 1,37 44,53 ± 1,37 44,96 ± 1,44 45,32 ± 1,44 UT 30,97 ± 1,22 34,02 ± 1,45 37,46 ± 2,28 41,33 ± 2,27 43,14 ± 1,95 44,12 ± 1,74 44,36 ± 1,63 44,51 ± 1,48 LTN 30,23 ± 1,43 33,09 ± 1,58 36,35 ± 1,55 40,63 ± 1,08 42,33 ± 1,06 43,67 ± 1,12 43,28 ± 0,99 43,45 ± 1,04 NP(O)-1 30,72 ± 1,36 33,75 ± 1,33 36,83 ± 1,48 41,02 ± 1,59 42,51 ± 1,68 43,83 ± 1,89 43,66 ± 1,95 43,83 ± 1,94 NP(O)-2 30,18 ± 1,46 33,12 ± 0,97 36,21 ± 0,89 40,88 ± 0,91 42,19 ± 0,94 43,45 ± 1,06 43,12 ± 1,08 43,36 ± 1,04 NP(H)-1 30,57 ± 0,97 33,51 ± 0,74 36,62 ± 0,82 40,97 ± 1,43 42,34 ± 1,38 43,61 ± 1,14 43,34 ± 1,03 43,54 ± 1,04 NP(H)-2 30,06 ± 0,81 33,03 ± 0,84 36,05 ± 0,86 40,18 ± 1,13 42,03 ± 1,08 43,16 ± 1,08 43,02 ± 0,97 43,16 ± 1,02 pgiữa các lô > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Nhận xét: Cân nặng của chuột ở lô SL (không gây u) và lô UT (gây u không dùng thuốc) tăng đều sau mỗi lần cân. Các lô gây u có dùng thuốc, trọng lượng cơ thể chuột từ ngày 7 đến ngày 17 đều tăng sau mỗi lần cân, ngày 19 trọng lượng cơ thể có xu hướng giảm nhẹ sau đó lại tăng ở ngày 21. So sánh giữa các lô tại cùng một thời điểm đo, trọng lượng cơ thể chuột ở các lô khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). 3.2.3.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến sự phát triển khối u rắn sarcoma TG 180. 100 Bảng 3.19. Thể tích trung bình khối u củachuột trong giai đoạn uống thuốc (từ ngày 7 đến ngày 21) (Mean ± SD, n =10). Lô chuột Thể tích trung bình khối u của chuột (mm3) Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13 Ngày 15 Ngày 17 Ngày 19 Ngày 21 UT (1) 858,99 ± 196,05 1016,88 ± 188,69 1315,94 ± 404,59 1741,88 ± 502,20 1963,01 ± 464,01 2480,70 ± 386,12 3184,01 ± 536,99 3254,29 ± 544,01 LTN (2) 791,00 ± 192,47 839,37* ± 181,94 855,70▲ ± 195,11 892,00Δ ± 243,74 973,99 Δ ± 287,85 1017,08 Δ ± 301,38 1085,11 Δ ± 314,85 1164,54 Δ ± 393,88 NP(O)- 1 (3) 829,00 ± 158,76 862,00* ± 129,21 884,00▲ ± 145,67 958,98Δ ± 141,98 1157,00 Δ ± 178,71 1296,02 Δ† ± 207,68 1452,02 Δ† ± 275,00 1507,62 Δ† ± 273,95 NP(O)- 2 (4) 771,90 ± 165,45 837,98* ± 153,41 890,70▲ ± 152,34 938,99 Δ ± 138,43 1041,86 Δ ± 138,74 1247,01Δ ± 286,84 1288,02Δ ± 254,56 1316,19 Δ ± 254,24 NP(H)- 1 (5) 797,99 ± 138,35 834,01* ± 140,05 852,03▲ ± 157,84 861,34 Δ ± 156,57 893,57 Δ ± 163,48 936,99Δ ± 191,89 998,99 Δ ± 198,23 1099,03Δ ± 197,65 NP(H)- 2 (6) 743,05 ± 143,11 808,00* ± 134,36 813,94▲ ± 134,90 826,10 Δ ± 153,34 858,41Δ¥ ± 145,19 885,99Δ¥ ± 144,08 896,00Δ¥ ± 141,90 913,44Δ¥β± 150,99 Ghi chú: *,▲, Δ – p < 0,05, p < 0,01 và p < 0,001 (tương ứng) so với (1); † = p < 0,05 so với (2); = p < 0,01 so với (3) và < 0,05 so với (4); ¥ = p < 0,001 so với (3) và < 0,01 so với (4); β = p < 0,05 so với (5). Nhận xét: Các chuột bắt đầu được cho uống thuốc ở ngày thứ 6 sau tiêm gây u. Ở ngày đo thứ 7 (ngày uống thuốc thứ 2), thể tích trung bình của khối u ở các lô chuột dùng thuốc nhỏ hơn chưa có ý nghĩa thống kê so với gây ung thư không điều trị. Ở các ngày sau, lô gây ung thư không điều trị (UT): thể tích tăng liên tục và rất nhanh sau mỗi lần đo. Các lô dùng Lentinan (LTN), cao Tam thất không hấp (NP(O)-1 và NP(O)-2), cao Tam thất hấp (NP(H)-1 và NP(H)-2), thể tích trung bình khối u cũng tăng nhưng tăng chậm. Ngày thứ 9 và ngày thứ 11 (ngày uống thuốc thứ 4 và thứ 101 6), thể tích trung bình khối u của các lô dùng thuốc nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với lô gây ung thư không dùng thuốc, với p < 0,05 và p < 0,01, tương ứng. Bắt đầu từ ngày 13 (ngày uống thuốc thứ 8) trở đi, thể tích trung bình khối u của các lô dùng thuốc nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với lô gây ung thư không dùng thuốc với p< 0,001. Các lô dùng cao Tam thất hấp (NP(H)-1 và NP(H)-2, thể tích trung bình khối u tăng chậm nhất. Kết quả đo ở các ngày thứ 15, 17, 19 và 21, ở lô dùng cao Tam thất hấp liều thấp NP(H)-1, thể tích trung bình khối u nhỏ hơn so với ở các lô dùng cao Tam thất không hấp (NP(O)-1 và NP(O)-2), với p< 0,01 và p < 0,05, tương ứng. Ở lô dùng cao Tam thất hấp liều cao NP(H)-2, thể tích trung bình khối u nhỏ hơn so với ở các lô dùng cao Tam thất không hấp (NP(O)-1 và NP(O)- 2), với p< 0,001 và p < 0,01. Tại ngày thứ 21, thể tích trung bình khối u ở lô dùng cao Tam thất liều cao nhỏ hơn so với ở lô dùng cao Tam thất hấp liều thấp, với p< 0,05. Ở lô dùng cao Tam thất không hấp liều cao, thể tích trung bình khối u nhỏ hơn không có ý nghĩa thống kê so với ở lô dùng cao Tam thất không hấp liều thấp (p< 0,05). Thể tích trung bình khối u ở các lô dùng cao Tam thất hấp (NP(H)-1 và NP(H)-2), cao Tam thất không hấp liều cao (NP(O)-2 tương đương so với ở lô dùng Lentinan (LTN) (p> 0,05). Tuy nhiên, tại ngày đo 17, 19, 21, thể tích trung bình khối u ở lô dùng cao Tam thất không hấp liều thấp NP(O)-1 lớn hơn so với ở lô dùng Lentinan (LTN) (p < 0,05). Kết quả đánh giá hiệu lực kháng u tại ngày 21 được trình bày ở bảng sau. 102 Bảng 3.20. Hiệu lực kháng u tại ngày 21 sau tiêm gây u ở các lô điều trị (n =10) Lô chuột Thể tích trung bình khối u tại ngày 21 (mm3) Tỷ số ức chế u tính theo thể tích (%) Cân nặng trung bình khối u tại ngày 21(g) Tỷ số ức chế u tính theo cân nặng (%) Hiệu lực kháng u UT (1) 3254,29± 544,01 - 3,451± 0,575 - - LTN (2) 1164,54Δ± 393,88 64,31 1,223Δ ± 0,415 64,56 ++ NP(O)-1 (3) 1507,62Δ†± 273,95 53,66 1,591Δ† ± 0,288 53,90 + NP(O)-2 (4) 1316,19Δ ± 254,24 59,54 1,402Δ ± 0,269 59,37 + NP(H)-1 (5) 1099,03Δ ± 197,65 66,18 1,153Δ ± 0,206 66,59 ++ NP(H)-2 (6) 913,44Δ¥β ± 150,99 72,09 0,958Δ¥β ± 0,160 72,24 ++ Ghi chú: Δ – p < 0,001 so với (1); † = p < 0,05 so với (2); = p < 0,01 so với (3) và < 0,05 so với (4); ¥ = p < 0,001 so với (3) và < 0,01

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_tac_dung_khang_u_thuc_nghiem_cua_re_cu_ta.pdf
  • pdfQĐ 1504 thành lập HĐ cấp Viện của Bùi Thị Thu Hà.pdf
  • pdf3. Tóm tắt Luận án - Bùi Thị Thu Hà.pdf
  • pdf2. Thông tin những đóng góp mới của LA Bùi Thị Thu Hà (Tiếng Việt ).pdf
  • pdf2. Thông tin những đóng góp mới của LA Bùi Thị Thu Hà (Tiếng Anh).pdf
  • pdf1.Trích yếu luận án Bùi Thị Thu Hà (Tiếng Viêt).pdf
  • pdf1. Trích yếu luận án Bùi Thị Thu Hà (Tiếng Anh).pdf
Tài liệu liên quan